여기에서 우리는 안정적으로 합성 LINE-1을 표현 인 HepG2 세포주의 염색체 스프레드에서 하나의 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스을 추적하기 위해 FISH 방법을 사용한다.
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이 논문에서
요약
초록
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 또는 L1)은 인간 게놈에 존재하는 DNA의 약 17%를 차지합니다. L1s의 대다수는 5' 절단으로 인해 비활성 상태이지만 이러한 요소 중 ~80-100개는 후전위 능력을 유지하고 RNA 중간체를 통해 게놈 전체의 다른 위치로 전파됩니다. 더 오래된 L1은 게놈의 풍부한 AT 영역을 표적으로 하는 것으로 여겨지지만, 더 새롭고 더 활동적인 L1의 염색체 표적은 잘 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기에서는 단일 핵 수준에서 L1 삽입 패턴과 이소성 L1 혼입 속도를 추적하는 데 사용할 수 있는 FISH(Fluorescence in situ hybridization) 방법론에 대해 설명합니다. 이 실험에서는 이소성 L1을 안정적으로 발현하는 HepG2 세포에서 L1 역전이를 추적하기 위해 플루오레세인 이소티오시아네이트/시아닌-3(FITC/CY3) 표지 네오마이신 프로브를 사용했습니다. 이 방법론은 독성에 의해 제기되는 역전위 속도 추정의 오류를 방지하고 단일 핵에 여러 삽입의 발생을 설명합니다.
서론
인간의 긴 산재 핵 요소-1 (라인-1 또는 L1) 레트로 트랜스 메커니즘을 관통 게놈 내에서 전파 "복사 및 붙여 넣기"자율 이동 요소입니다. 일반적인 인간의 L1은 ~ 6킬로바이트 길고 프로모터 역할을하는 5'UTR (번역되지 않은 지역)으로 구성되어, 두 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF를) L1 -ORF1 및 L1 -ORF2 및 폴리 -A와 3'UTR . 코일 코일 도메인, RNA 인식 모티브와 C 터미널 도메인, L1 -ORF2 단백질이 효소를 가지고있는 동안, 효소 및 시스테인이 풍부한 도메인 1,2,3,4,5 역 : 꼬리 L1 -ORF1 단백질은 세 가지 영역이 있습니다. L1 -ORF2는 레트로 트랜스 1,2,6 모두 필요 단백질, 효소 활성을 제공하지만 L1 -ORF1는 핵산 샤페론 활성을 나타낸다.
L1의 레트로 트랜스의주기는 L1의 5'UTR에서 전사로 시작 RNA 중합 효소 II, 전위 세포질로, 번역에 의해 bicistronic mRNA를. 세포질에서, L1....
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프로토콜
주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행한다. 개별 시약을 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 시약 섹션을 참조하십시오.
1. 레이블 L1 프로브
참고 : 프로브는 화학 물질 또는 PCR 라벨로 표시 할 수 있습니다.
- 화학 표시
- 에티 디움 브로마이드 (0.5 μg의 / ㎖)를 추가 한 후 용융 할 때까지 전자 레인지에 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 버퍼, 열에서 0.7-1 % 아가로 오스 겔을 겔 냉각 할 수 있도록합니다. 젤 트레이에 붓고 빗을 추가하고 젤은 실온에서 응고 할 수 있습니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 1 시간 동안 37 ° C에서 CY3 또는 FITC와 SNeo 프로브 (1-2 μg의)를 레이블.
참고 : SNeo는 S는 레트로 트랜스의 전체 사이클 이후 표현 네오 마이신 유전자를 pliced이다. 프로브의 크기는 1000 ~ BP이다. SNeo는 PCR 어떤 벡터 또는 genom에서 증폭 될 수있다IC에서 DNA. 스트렙 타비 딘 - CY3 / FITC 표지 시약에 ....
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결과
L1의 레트로 트랜스 벡터의 개략도는도 1에 제시되어있다. 벡터는 센스 방향의 글로빈 인트론에 의해 중단 및 SD 및 SA 사이트에서 끼워 L1의 ORF에 안티센스 방향 네오 마이신 유전자로 구성된다. 안정적으로 염색체에 통합하면, L1의 mRNA가 결합 된 CMV 및 L1-5'UTR 프로모터 (그림 1)에서 전사한다. RNA 프로세싱 동안에, 글로빈 인트론은 네오 마이신 유전자에서 접합된다. 신자유 L1 RNA는 패키지 전좌와 전체 길이 또는 절단 삽입 중 하나로 게놈에 통합되어 있습니다. 나타낸 바와 같이, L1은 접합의 레트로 트랜스 네오 마이신 (도 1)에 특이적인 프로브를 이용하여 FISH에 의해 추적 될 수있다.
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토론
이러한 전체 게놈 시퀀싱, 역 PCR 및 남부 블롯 같은 방법론은 L1의 레트로 트랜스을 연구하기 위해 사용되어왔다. 이 방법은 L1 삽입은 게놈 내에서 발생하는 곳의 위치에서 매우 가치가 있지만, 그들 모두에 대한 혼란 문제는 순서를 재 조립하기에 실리 프로그래밍의 필요성이다. 여기에 설명 된 FISH 방법은 특히 배양 된 세포에서의 이소성 L1 레트로 트랜스의 분석을 요구하는 시험의 경우에는, 이러한 방법을 보충하도록 설계된다. 접근법은 레트로 트랜스 이벤트 양적 질적 평가를 위해 사용되는 핵 간기에 적용될 수있다. 이 방법론은 이소성 L1 삽입 부위 (16)를 결정하는데 사용 이후에 실리 서열 정렬 방법의 정확도를 제공합니다. 반복적 서열 정렬 의한 단독 중합체의 형성 모호 할 수있는 동안 반복 sequenCES는 반복 서열의 과소 대표 결과 템플릿의 프라이머 증폭 중에 손실 될 수 있습니다.......
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공개 사항
저자는 잠재적 경쟁 이익을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences, ES014443 및 ES017274)와 아스트라제네카(AstraZeneca)의 KSR 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x 무색 버퍼 | Promega | M3178 | |
| 개별 dNTP | Sigma | DNTP10 | dATP, dGTP, dCTP의 농도를 2 mM 및 dTTP는 1.5 뉴클레아제가 없는 물에 있는 mM. |
| dUTP-16-비오틴(0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH 라벨링 키트 | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH 라벨링 키트 | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | NucleoSpin PCR 클린업 키트 |
| 아가로스 | 시그마 | A9539 | |
| Preparing chromosome spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Colcemid를 성장 배지에 직접 첨가하여 최종 농도 0.4 &마이크로; g/ml |
| 1 M KCl | 시그마 | P9541 | 희석 1 M KCl 솔루션에 75 Hypotonic Solution을 만드는 mM 솔루션 |
| Carnoy Fixative Solution | 3 부피의 메탄올과 1 부피의 아세트산을 혼합하여 Carnoy Fixative Solution을 만듭니다. 매번 신선하게 만드십시오. | ||
| 메탄올 | 시그마 | 322415 | |
| 아세트산 | 시그마 | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Hoechst-33342를 PBS에 용해시켜 최종 농도 1 mg/ml입니다. |
| 다이아몬드 포인트 마커 | Thermo Scientific | 750 | |
| 서리 슬라이드 | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | detech cell을 위해 Trypsin에서 세포를 5분 동안 배양하고 동일한 부피의 완전한 배지로 비활성 |
| 커버 슬라이드 | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| 히트 블록 | 이러한 목적으로 모든 히트 블록을 사용할 수 있지만 가열 슬라이드에 장착된 블록이 권장됩니다. | ||
| 비커(600 ml) | Sigma | CLS1003600 | 비커에 물을 채우고 끓일 때까지 가열한 다음 뜨거운 증기를 사용하여 염색체를 터뜨립니다. |
| 니콘 현미경 | 니콘 | 125690 | 모든 현미경을 사용하여 스프레드 품질을 볼 수 있습니다. |
| < 강> 시약 및 재료 FISH< / 강> | |||
| 시트르산 삼 나트륨 | 시그마 | S1804 | |
| 크로라이드 | 나트륨 시그마 | S3014 | |
| 포름 아미드 | 시그마 | F9037 | |
| 트윈 -20 | 시그마 | F1379 | |
| Detran 황산염 | 시그마 | D8906 | |
| SDS | 시그마 | L3771 | |
| 연어 정자 DNA | 생명 기술 | 15632-011 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| 에틸 알코올 | 시그마 | 459844 | |
| 메탄올 | 시그마 | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Hoechst-33342를 PBS에 용해시켜 최종 농도 1 mg/ml입니다. |
| 고무 시멘트/사이토본드 씰란트 | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| 어두운 가습 챔버 | 시그마 | CLS2551 | |
| 커버 슬라이드 | VWR | 48366067 | |
| 건조 디지털 히트 블록 | VWR | 13259 | |
| 형광 현미경 | |||
| 20x 식염수-구연산나트륨 (20x SSC) | NaCl 175g과 88.2 분자 등급 H2O 800ml가 함유된 시트르산 삼나트륨 g. pH 7로 조정하면서 저어줍니다. 모든 염이 용해되면 부피를 1L로 조정하고 0.22 &마이크로를 통해 필터링합니다. m 여과지. 4 °C에 보관하십시오. | ||
| 1 mg/ml의 Rnase 20x | SSC 버퍼를 2x SSC 버퍼로 희석합니다. RNase A를 2x SSC 완충액에 용해시켜 최종 농도 1 mg/ml입니다. 매번 새로운 솔루션을 만드십시오. | ||
| 1% 펩신 | 펩신(W/V)을 10mM HCl에 용해시켜 1% 용액의 최종 농도로 만듭니다. 매번 신선하게 만드십시오. | ||
| 4% 파라포름알데히드 (4% PFA) | PFA 4.0 g을 연기 후드에 넣고 1xPBS 50 ml를 첨가하여 60 로 가열합니다. &데그; C를 교반하면서 모든 PFA가 용해되고 용액이 투명해질 때까지 NaOH 방울로 pH를 조정합니다. 볼륨을 100 ml, 0.22 µ를 통한 필터; m 종이를 여과하고 -5 에서 20ml 분취액을 보관하십시오. °C. 37에서 PFA의 해동 분취량 ° 후속 사용을 위해 10-15분 동안 C. 파라포름알데히드의 양에 따라 필터 크기를 조정합니다. | ||
| 세척 완충액 | 100ml의 포름아미드(20%)와 2.5ml의 20x SSC를 결합하고 1.0M HCl로 pH 7로 조정한 다음 분자 등급 H2O로 부피를 500ml로 가져옵니다. | ||
| 혼성화 완충액 | 은 2x SSC 완충액에 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 설페이트, 0.1% SDS 및 300ng/ml 연어 정자 DNA를 결합합니다. 포름 아미드의 양은 염색 분류가 얼마나 집중되어 있는지를 결정합니다. 금액을 적정하십시오. | ||
| 검출 버퍼: | 20x SSC 버퍼를 4x로 희석하고 0.2% Tween-20을 추가하여 검출 버퍼를 만듭니다. | ||
| 블로킹 버퍼 | : 5% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.2% Tween-20을 4x SSC 버퍼에 결합합니다. | ||
| 탈수 용액 | 은 70%, 80% 및 95% 에탄올 용액을 만듭니다. |
참고문헌
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease ....
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재인쇄 및 허가
