방법 논문

의 사체 프로파일 링 생체 제작 소 착상 전 배아

DOI:

10.3791/53754

⸱

2017년 1월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microarray 기술은 게놈 전체에 기초를 둔 transcripts의 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 합니다. 따라서 이 프로토콜은 적은 양의 총 RNA를 사용할 수 있는 타당성을 입증하기 위해 Day 7 소 배아를 사용하여 2색 맞춤형 소 어레이에서 최적화된 기술 절차를 제공합니다.

초록

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조기 배아 손실은 소의 불임에 큰 영향을 미칩니다. 더욱이, 소는 유사한 발달 과정으로 인해 인간 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미로운 모델이 됩니다. 유전적 요인이 초기 배아 발달에 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 그러한 요인을 발견하는 것은 심각한 도전이었습니다. 마이크로어레이 기술을 통해 게놈 전체에서 전사체 수준의 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링이 가능합니다. 마이크로어레이 실험을 계획할 때 내려야 하는 주요 결정 사항 중 하나는 1색 또는 2색 접근 방식을 사용할지 여부입니다. 2색 설계는 기술적 복제를 증가시키고, 변동성을 최소화하며, 감도와 정확도를 향상시킬 뿐만 아니라 루프 설계를 허용하여 공통 참조 샘플을 정의할 수 있습니다. 마이크로어레이는 강력한 생물학적 도구이지만 그 힘을 약화시킬 수 있는 잠재적인 위험이 있습니다. 따라서 이 기술 백서에서는 2색 분석 전략을 사용하여 RNA 추출, 증폭, 라벨링된 증폭된 RNA를 어레이로 하이브리드화, 어레이 스캐닝 및 데이터 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 보여줍니다.

서론

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높은 생산 젖소의 초기 배아 손실은 낙농 산업 1, 2의 주요 과제 중 하나입니다. 소는 그들의 유사한 발달 과정 3, 4 인간의 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미있는 모델이되고있다. 그러나, 더 많은 연구가 소 초기 배아 발달에 관여하는 유전자에 대한 이해가 요구된다.

첫 마이크로 어레이 기술 보낸 이십년 1995 5 개발 후보다 정교한 프로브 제작 기술 감소 인쇄 오류 및 마이크로 어레이 내의 상이한 플랫폼 (6) 사이의 어레이 칩의 변동의 개발. 개선 된 마이크로 어레이 기술은 초기 배아 질문에, 최근 임상 연구 7에서이 기술을 널리 응용 프로그램에서 결과를 uality 평가 (8).

마이크로 어레이 기술에 필요한 재료의 양이 큰 마이크로 어레이 기술은 초기에 초기 배아 발달로 연구 분야의 번호를 입력 못한 주된 이유이다. 최근 RNA 증폭 방법은 선형 RNA 재료 (9)를 시작 서브 나노 그램에서 마이크로 그램 수준까지 RNA를 증폭하도록 개선되었다. 시장에서 사용할 수있는 여러 상업 RNA 증폭 키트가 있습니다; 그러나, 더 많은 인기를 잘 개발 키트는 Ribo를 싱글 프라이머 등온 증폭 (10) 관련 및 T7 프로모터 (11) 방법을 구동된다. 가장 인기있는 안티센스 RNA 증폭는 5 '말단 (12)에 T7 프로모터에 연결하는 올리고 DT 프라이머와 시험 관내 전사에 사용합니다. 이 기술은 선형 증폭 후에 F 대표적인 안티센스 전 사체를 최대한 유지할 수 있도록또는 배열 하이브리드 13. 이 방법은 소 배아 (8)로부터 추출 된 총 RNA의 피코 그램 수준을 증폭하도록하고있다.

유니버설 링크 시스템 (ULS)를 직접 구아닌 (14)의 N7 위치에 배위 결합을 형성함으로써, 백금 결합 된 형광 염료 중 하나 시아닌 (547) 또는 시아닌 647로 DNA 또는 RNA 증폭을 통합 라벨링 방법입니다. 이 방법은 ARNA이 효소 방법 (15)에 의해 생성 된 수정 된 아미노 알릴에 비해 수정하지 않고 ARNA 증폭보다 안정적인 생성하는 배아 연구에 적응했다. 단일 염료와 두 개의 염료 라벨 두 가지 방법은 마이크로 어레이에 범용 연계 시스템을 사용하여 적용하고있다. 큰 마이크로 어레이의 비교 연구는 단일 및 두 개 컬러 배열 플랫폼 (6) 사이의 데이터 품질의 상관 관계가 있다고 하였다.

최근 두 T7 프로모터 드라이브N 안티센스 RNA 증폭 ULS 라벨링 방법은 마이크로 어레이 혼성화 8 16 아르나 물질을 표지 고품질의 충분한 양을 생성하기위한 더 신뢰성있는 프로토콜을 제공하기 위해 개발되었다. 따라서 본 연구는 예를 들어 7 일 소 배아를 사용하여 두 개의 색상에 관련된 마이크로 어레이 데이터 분석 RNA 추출의 중요한 단계 중 일부를 입증하는 프로토콜을 제공한다.

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프로토콜

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이 연구의 동물 부분은 알버타 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 모든 동물 실험 절차 승인 (프로토콜 # AUP00000131)와, 앨버타, 에드먼턴, 캐나다 대학의 대사 연구 단위에서 실시하고, 동물에 따라 마음에 든다고했다 동물 보호 가이드 라인의 캐나다 협의회 (1993)이다.

1. 배아 생산, 총 RNA와 DNase의 치료의 분리

  1. 동물 실험 프로토콜 및 배아 컬렉션에 대한 이전 간행물 17, 18을 참조하십시오.
  2. 수영장 및 액체 질소의 각 소에서 비슷한 단계의 배아를 동결 스냅 다음 RNA 추출 할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
  3. (키트 정보 자료 목록에서 사용할 수 있습니다) 피코 규모의 샘플에서 RNA를 추출 할 수있는 컬럼 기반의 RNA 추출 키트를 통해 총 RNA를 추출합니다.
    참고 : 권장 키트에는 다음이 포함 컨디셔닝 버퍼, 추출를 버퍼를선봉, 70 % 에탄올, 워시 버퍼 1, 세척 버퍼 2, 용출 버퍼, 수집 튜브 및 마이크로 원심 튜브와 RNA 정화 열입니다.
  4. 튜브 포함 배아에 10 μL 추출 버퍼를 추가하고 42 ° C에서 30 분 동안 품어. 2 분 동안 800 XG에 원심 분리기 튜브는 microcentrifuge 관에 세포 추출물을 수집합니다.
  5. 정제 컬럼 여과막에 250 μL 냉방 버퍼 피펫. 실온에서 5 분 컨디셔닝 버퍼와 RNA 정제 컬럼 인큐베이션. 1 분 동안 16,000 XG에서 수집 튜브의 정제 컬럼을 원심 분리기.
  6. 피펫 RNA 추출 버퍼 및 배아의 혼합물에 70 % 에탄올 10 μL. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 컨디셔닝 정제 칼럼에 피펫 혼합물.
  7. 100 XG에서 2 분 동안 RNA, 원심 분리기 정화 열을 결합하고 즉시 통해 흐름을 제거하기 위해 30 초 동안 16,000 XG에서 원심 분리하여 수행하십시오.
  8. 피펫 (100)81, 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 세척 버퍼 1의 L.
    참고 : DNase를 처리 RNA 분리 한 후 역전사 또는 증폭을 수행하는 경우 권장합니다.
  9. 바로 단계 1.8 이후 게놈 DNA를 소화.
    참고 : 권장 DNase의 키트는 재질 목록에서 사용할 수 있습니다. 추천 키트에는 다음이 포함 DNase의 I 원액 및 버퍼.
  10. 35 μL 버퍼 5 μL의 DNase I 원액을 혼합하여 DNase의 배양 혼합물을 준비합니다. 부드럽게 반전 섞는다.
  11. 정화 열 막에 직접 40 μL DNase의 배양 혼합물을 피펫. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
  12. 피펫 40 μL 세척 정화 열 막에 버퍼 1과는 15 초 동안 8,000 XG에 원심 분리기.
  13. 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 피펫 100 μL 세척 버퍼 2.
  14. 정화 열 및 원심 분리기로 또 다른 100 μL 세척 버퍼 (2) 피펫16,000 × g으로에서 2 분.
  15. 새로운 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 열을 전송합니다. 직접 정제 컬럼의 막 상에 용출 버퍼의 피펫 11 μL. 용출 완충제를 분배하는 동안 막에 용출 버퍼의 최대 흡수를 보장하기 위해 부드럽게 막 표면에 피펫의 끝을 터치.
  16. 실온에서 1 분 동안 열을 품어. 컬럼에서 용출 버퍼를 배포하는 1,000 XG에서 1 분 동안 열을 원심 분리 한 후 RNA를 용출 16,000 XG에서 1 분 동안 회전.
  17. RNA의 질과 양 (19)을 평가하기 위해 제조자의 지시에 따라 bioanalyzer 수단을 사용한다.
  18. 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA 샘플을 저장합니다.

2. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 증폭 및 라벨링

참고 : RNA 증폭 및 라벨 절차 작업 처음 사용자의 경우, RNA ALO에서 스파이크의 다섯 NG를 사용실제 아르나 샘플을 ng를하면 RNA 증폭 및 혼성화의 품질 제어 측정을 모니터링한다. 스파이크-에서 RNA 믹스는 소정의 비율로 열 체외 합성, 폴리아 데 닐화 성적 증명서가 포함되어 있습니다. 절차가 적절히 수행되면, 표지 사체 구체적 배열 상보 제어 프로브에만 혼성화하고 데이터는 최소한 자기 또는 교차 혼성화와 품질 관리 보증 추적 검사 할 수있다. 배열 및 데이터 분석을 스캔 한 후 제어 세기에 아군과 정상화 절차에 관한 더 자세한 설명은 이전 간행물 20, 21 참조입니다. 다음 절차는 일상적인 마이크로 어레이 사용자에게 제공됩니다.

  1. 11 μL - (10)의 총 부피 100 PG 고품질 RNA 시료 (RNA 무결성 번호 (RIN) 값 적어도> 7.0)을 준비한다.
  2. 증폭 키트에 수있는와 RNA 샘플을 증폭(작은 페이지 100로) 피코 규모의 샘플과 함께 작동합니다.
    참고 : 권장 증폭 키트 정보는 재질 목록에서 사용할 수 있으며 수정없이 제조업체의 지침을 따른다.
  3. 증폭 된 ARNA의 크기 범위의 프로파일을 평가하기 위해 형광 기반의 정량을 사용합니다.
  4. 증폭 아르나의 농도를 측정하기 위해 (260 및 280 nm에서의 흡광도)을 분광 광도계를 사용하여 악기.
  5. 라벨에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 증폭 된 ARNA를 저장합니다.
  6. ULS ARNA 라벨 키트 사용 설명서에 따라 형광 라벨에 대한 증폭 된 RNA의 2 μg의를 사용합니다.
    주 : 647 염료 쉽게 오존에 의해 분해되고 광 열화 647 시아닌 색소에 민감한 시아닌 547 시아닌 이후는 표시 순서는 빛의 최소량 및 오존이없는 환경 하에서 이루어진다.
  7. 오존의 수준까지 오존 상자 (그림 1A)를 켜은 0.001 ppm으로합니다.
    8. 시아닌 547 또는 시아닌 647, 라벨 버퍼 2 μL의 2 μL를 추가하여 오존 상자 (그림 1B) 내부의 반응 설치를 수행 한 다음 안전 등 아래의 RNase없는 물 20 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 광원에 암실 필터를 추가합니다.
  8. 부드럽게 혼합하고 15 분 동안 85 ° C에서 열 순환기의 튜브를 품어. 적어도 1 분 동안 얼음에 장소 샘플. 사이 영상 염색 표지 증폭 된 RNA를 정리하기 위해 (1.9부터 1.11까지) DNase의 처리에 관한 단계를 제외하고, RNA 추출 키트를 진행하기 전에 튜브의 내용을 수집하는 스핀 다운.
  9. 측정 및 표시 증폭 된 RNA의 농도를 결정하고 사용하기 전에 3 일간 -80 ° C의 최대 레이블 ARNA을 유지하기 위해 분광 광도계 악기를 사용합니다.

3. 마이크로 어레이 혼성화 및 세척

참고 : 다음 중요한 단계는 2 색의 마이크로 어레이 기반의 유전자 발현 분석 프로토콜에 따라 적응 (버전6.5 2010 년 5 월).

  1. 각 시아닌 547- 및 시아닌 647 표지 ARNA에서 ng를 825의 동일한 금액을 추가하고 25 배 조각과 10 배 차단 버퍼와 혼합.
  2. 15 분 동안 60 ℃에서 혼합물을 가열하고 1 분간 얼음 쿨.
  3. 배 하이브리드 버퍼의 같은 양을 넣고 잘 섞는다.
  4. 13,000 rpm에서 원심 분리 후 혼합물 하이브리드에 대한 준비가되어 있습니다.
  5. 배열 슬라이드에 혼합물로부터 100 μL를 넣고 하이브리드 챔버 내부의 슬라이드를 밀봉.
  6. 오븐에서 10 rpm으로 회전 65 ° C에서 17 시간 동안 하이브리드 오븐에 조립 챔버를 넣습니다.
  7. 안정화에 담그고 30 초 동안 용액을 건조하여 오존 보호 치료 프로토콜에 따라 배열을 씻으십시오.
  8. 어떤 먼지 입자를 용액에서 배열을 제거하고 배열 표면이 건조되어 있는지 확인

4. 스캔 마이크로 어레이 슬라이드

  1. 어두운 곳에서 배열을 유지하고 scann를 켭니다ER는 (15 분 대기 시간)을 사용하도록 준비 될 때까지.
  2. 스캐너에, 왼쪽에있는 배열 바코드를 넣고 스캔을 시작합니다. 소프트웨어 사용자 설명서에 따라 현장 분석을 수행하고 (GPR) 파일 형식으로 데이터를 저장합니다.

5. 통계 분석

  1. FlexArray 소프트웨어 http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php "가져 오기 원시 데이터"를 클릭하고 FlexArray에 GPR 파일을로드를 다운로드 할 수 있습니다.
  2. 필요한 경우 명령에 따라 정규화 및 통계 분석을 수행합니다. 참고 : 이전에 22 한 바와 같이 본 연구에서 긍정적 인 장소 선택에 대한 임계 값을 계산합니다.
  3. 모든 혼성 관광 명소 및 배경 신호를 볼 수있는 FlexArray의 줄거리 뷰어에서 수동 드롭 다운 메뉴를 선택합니다. 주 : 마이크로 어레이에 하이브리드 후 컨트롤에 아군의 비슷한 그림은 이전 연구 (8)에서 볼 수 있습니다.
  4. 선택FlexArray에서 배열 정규화 과정 사이의 분위수에 의해 다음과 같은 배열 내 황토 정상화 따라 매뉴얼을 내려 놓습니다.
  5. 엑셀로 FlexArray의 모든 정규화 된 데이터를 내보내기하는 것은 더 사용을 위해 파일.

6. 생물 정보학 분석

소 태아 특이 성적로부터 프로브 시퀀스의 원래 주석은 (BESTv1) 마이크로 어레이는 이미 8 설명되었다. 본 연구에서는 20,403 고유 한 유전자 기호 (GS)을 (를 얻었다 을 File1을 보충 EmbryoGENE 실험실 정보 관리 시스템 (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca)을 통해). 6765 고유 한 유전자 (목록이 있는 File2 보조 식품 )을 선택하고 마이크로 어레이 정규화 과정 이후의 모든 긍정적 인 신호 (5 단계에 해당되었다0.5) 7 일 소 태아 유전자 발현 프로파일에서. 포지티브 신호 임계치는 A 값의 신호 강도로부터 투과성 공보 16에 기초하여 계산 하였다.

  1. 분류 시스템 (23), 24 (진화 관계를 통해 단백질 분석) PANTHER와 기능 분석을 수행하려면 다음 링크 (http://www.pantherdb.org/about.jsp)을 엽니 다.
  2. 통계 overrepresentation 테스트를 사용하여 배아 개발하는 동안 특정 생물학적 과정을 확인하고 참조 목록 25 보스 황소의 기본 설정 (데이터베이스의 모든 유전자)를 사용하는 6765 배아 특정 GS의 목록을 업로드합니다.
    참고 :이 통계적으로 과다 또는 발현 이항 테스트를 사용하는 GO 용어에서 발달 관련 프로세스의 식별을 할 수 있습니다.
  3. 소프트웨어 기본값으로 <0.05에서 설정 P-값 임계 값. 데이터 다운로드 및 엑스포 될 수있다추가 선택 16 Excel 파일로 rted.

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결과

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7 일 소 배아로부터 총 RNA 증폭 아르나의 대표적인 결과가도 3에 도시되고 표 1에 요약 하였다.

RNA 무결성 및 프로파일은 RNA 추출 후 평가 될 수있다. RNA의 질 평가 bioanalyzer 기기 (도 3a) 및 이상 7.0 증폭 (표 1)에 사용되는 자격 RIN 값들만 샘플에 의해 수행 될 수있다.

품질과 증폭 된 RNA의 양을 증폭 후 평가되어야한다. 증폭 된 RNA 프로필 적절한 크기 범위의 유사성은 품질 제어 (도 3b)의 주된 요인이다. 두 라운드의 증폭 후, 증폭 된 RNA 단편...

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토론

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첫 번째 문제는 유전자 발현 연구를위한 고품질의 RNA의 충분한 양을 받고 있지 않은 7 일 소 배아를 이용한 마이크로 어레이 분석을 수행한다. 기존의 페놀 / 클로로포름 RNA 추출 및 에탄올 침전 방법은 낮은 수율 및 RNA 증폭 반응 억제 할 수 남은 페놀의 결과로, 7 일 배아를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신에, 기준 열 기초 방법은 총 RNA를 분리 한 후 농도를 높이기 위해 최소 용출 버퍼로 RNA를 용출 좋다. 배아 당 총 RNA의 780 페이지의 평균은 동일한 방법론 (26)와, 현재 사용되는 동일한 RNA 추출 키트 (27), (28)를 사용하여 다른 리포트를 비교할 현재 연구에서 얻어진다. RNA 추출을 위해, 추출 전에 버퍼를 다시 완전히 용해 혼합하여 사용하거나 추출 완충액 바이알을 따뜻하게하기 전에 침전물을 용해 권장사용. 또한, 배양 시간은 추출 단계...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry의 지원을 받는 연구.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PicoPure RNA 분리 키트Applied BiosystemsKIT0204
RNase-Free DNase Set (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitApplied BiosystemsKIT0505
2100 Bioanalyzer InstrumentsAgilent TechnologiesG2940CA
RNA 스크린 테이프Agilent Technologies5067-5576
ULS 형광 라벨링 키트Kreatech DiagnosticsEA-021
맞춤형 유전자 발현 마이크로어레이Agilent TechnologiesG2514F
Agilent 유전자 발현 세척 버퍼 1Agilent TechnologiesPart #5188-5325
Agilent Gene Expression 세척 버퍼 2Agilent TechnologiesPart #5188-5326
2x Hi-RPM 하이브리드화 버퍼Agilent Technologies  부품 번호 #5190-0403
25x 단편 버퍼Agilent Technologies부품 번호 #5185-5974
10x GE 차단제Agilent Technologies부품 #5188-5281
안정화 및 건조 솔루션Agilent Technologies  부품 번호 #5185-5979
Agilent SureHyb techonolgyAgilent TechnologiesG2524-6001220개의 가스켓 슬라이드 팩, 4개의 마이크로어레이/슬라이드
2색 RNA 스파이크인 키트Agilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B 어레이 스캐너분자 장치GENEPIX 4000B-U
오존 프리 박스BioTrayOFB_100x200
GAL 파일Agilent Technologies-

참고문헌

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