Method Article

의 사체 프로파일 링 생체 제작 소 착상 전 배아

DOI:

10.3791/53754

⸱

January 30th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microarray 기술은 게놈 전체에 기초를 둔 transcripts의 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 합니다. 따라서 이 프로토콜은 적은 양의 총 RNA를 사용할 수 있는 타당성을 입증하기 위해 Day 7 소 배아를 사용하여 2색 맞춤형 소 어레이에서 최적화된 기술 절차를 제공합니다.

Abstract

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조기 배아 손실은 소의 불임에 큰 영향을 미칩니다. 더욱이, 소는 유사한 발달 과정으로 인해 인간 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미로운 모델이 됩니다. 유전적 요인이 초기 배아 발달에 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 그러한 요인을 발견하는 것은 심각한 도전이었습니다. 마이크로어레이 기술을 통해 게놈 전체에서 전사체 수준의 정량적 측정 및 유전자 발현 프로파일링이 가능합니다. 마이크로어레이 실험을 계획할 때 내려야 하는 주요 결정 사항 중 하나는 1색 또는 2색 접근 방식을 사용할지 여부입니다. 2색 설계는 기술적 복제를 증가시키고, 변동성을 최소화하며, 감도와 정확도를 향상시킬 뿐만 아니라 루프 설계를 허용하여 공통 참조 샘플을 정의할 수 있습니다. 마이크로어레이는 강력한 생물학적 도구이지만 그 힘을 약화시킬 수 있는 잠재적인 위험이 있습니다. 따라서 이 기술 백서에서는 2색 분석 전략을 사용하여 RNA 추출, 증폭, 라벨링된 증폭된 RNA를 어레이로 하이브리드화, 어레이 스캐닝 및 데이터 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 보여줍니다.

Introduction

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높은 생산 젖소의 초기 배아 손실은 낙농 산업 1, 2의 주요 과제 중 하나입니다. 소는 그들의 유사한 발달 과정 3, 4 인간의 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미있는 모델이되고있다. 그러나, 더 많은 연구가 소 초기 배아 발달에 관여하는 유전자에 대한 이해가 요구된다.

첫 마이크로 어레이 기술 보낸 이십년 1995 5 개발 후보다 정교한 프로브 제작 기술 감소 인쇄 오류 및 마이크로 어레이 내의 상이한 플랫폼 (6) 사이의 어레이 칩의 변동의 개발. 개선 된 마이크로 어레이 기술은 초기 배아 질문에, 최근 임상 연구 7에서이 기술을 널리 응용 프로그램에서 결과를 uality 평가 (8).

마이크로 어레이 기술에 필요한 재료의 양이 큰 마이크로 어레이 기술은 초기에 초기 배아 발달로 연구 분야의 번호를 입력 못....

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Protocol

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이 연구의 동물 부분은 알버타 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 모든 동물 실험 절차 승인 (프로토콜 # AUP00000131)와, 앨버타, 에드먼턴, 캐나다 대학의 대사 연구 단위에서 실시하고, 동물에 따라 마음에 든다고했다 동물 보호 가이드 라인의 캐나다 협의회 (1993)이다.

1. 배아 생산, 총 RNA와 DNase의 치료의 분리

  1. 동물 실험 프로토콜 및 배아 컬렉션에 대한 이전 간행물 17, 18을 참조하십시오.
  2. 수영장 및 액체 질소의 각 소에서 비슷한 단계의 배아를 동결 스냅 다음 RNA 추출 할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
  3. (키트 정보 자료 목록에서 사용할 수 있습니다) 피코 규모의 샘플에서 RNA를 추출 할 수있는 컬럼 기반의 RNA 추출 키트를 통해 총 RNA를 추출합니다.
    참고 : 권장 키트에는 다음이 포함 컨디셔닝 버퍼, 추출를 버퍼를선봉, 70 % 에탄올, 워시 버퍼 1, 세척 버퍼 2, 용출 버퍼, 수집 튜브 및 마이크로 원심 튜브와 RNA 정화 열입니다.
  4. 튜브 포함 배아에 10 μL 추출 버퍼를 추가하고 42 ° C에서 30 분 동안....

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Results

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7 일 소 배아로부터 총 RNA 증폭 아르나의 대표적인 결과가도 3에 도시되고 표 1에 요약 하였다.

RNA 무결성 및 프로파일은 RNA 추출 후 평가 될 수있다. RNA의 질 평가 bioanalyzer 기기 (도 3a) 및 이상 7.0 증폭 (표 1)에 사용되는 자격 RIN 값들만 샘플에 의해 수행 될 수있다.

품질과 증폭 된 RNA의 양을 증폭 후 평가되어야한다. 증폭 된 RNA 프로필 적절한 크기 범위의 유사성은 품질 제어 (도 3b)의 주된 요인이다. 두 라운드의 증폭 후, 증폭 된 RNA 단편.......

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Discussion

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첫 번째 문제는 유전자 발현 연구를위한 고품질의 RNA의 충분한 양을 받고 있지 않은 7 일 소 배아를 이용한 마이크로 어레이 분석을 수행한다. 기존의 페놀 / 클로로포름 RNA 추출 및 에탄올 침전 방법은 낮은 수율 및 RNA 증폭 반응 억제 할 수 남은 페놀의 결과로, 7 일 배아를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신에, 기준 열 기초 방법은 총 RNA를 분리 한 후 농도를 높이기 위해 최소 용출 버퍼로 RNA를 용출 좋다. 배아 당 총 RNA의 780 페이지의 평균은 동일한 방법론 (26)와, 현재 사용되는 동일한 RNA 추출 키트 (27), (28)를 사용하여 다른 리포트를 비교할 현재 연구에서 얻어진다. RNA 추출을 위해, 추출 전에 버퍼를 다시 완전히 용해 혼합하여 사용하거나 추출 완충액 바이알을 따뜻하게하기 전에 침전물을 용해 권장사용. 또한, 배양 시간은 추출 단계.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry의 지원을 받는 연구.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PicoPure RNA 분리 키트Applied BiosystemsKIT0204
RNase-Free DNase Set (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS KitApplied BiosystemsKIT0505
2100 Bioanalyzer InstrumentsAgilent TechnologiesG2940CA
RNA 스크린 테이프Agilent Technologies5067-5576
ULS 형광 라벨링 키트Kreatech DiagnosticsEA-021
맞춤형 유전자 발현 마이크로어레이Agilent TechnologiesG2514F
Agilent 유전자 발현 세척 버퍼 1Agilent TechnologiesPart #5188-5325
Agilent Gene Expression 세척 버퍼 2Agilent TechnologiesPart #5188-5326
2x Hi-RPM 하이브리드화 버퍼Agilent Technologies  부품 번호 #5190-0403
25x 단편 버퍼Agilent Technologies부품 번호 #5185-5974
10x GE 차단제Agilent Technologies부품 #5188-5281
안정화 및 건조 솔루션Agilent Technologies  부품 번호 #5185-5979
Agilent SureHyb techonolgyAgilent TechnologiesG2524-6001220개의 가스켓 슬라이드 팩, 4개의 마이크로어레이/슬라이드
2색 RNA 스파이크인 키트Agilent Technologies  Cat# 5188-5279
GenePix 4000B 어레이 스캐너분자 장치GENEPIX 4000B-U
오존 프리 박스BioTrayOFB_100x200
GAL 파일Agilent Technologies-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
  2. Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
    3. ....

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Bovine EmbryosRNA ExtractionTwo color MicroarrayGene Expression ProfilingAmplification KitFluorescent LabelingArray HybridizationData NormalizationStatistical AnalysisEmbryonic Loss

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