척수뇌 운동실조증 1형(SCA1) 및 기타 소뇌 신경퇴행성 질환 치료를 위한 미토콘드리아 표적 수용성 화합물의 효능을 평가하기 위한 생화학적 및 행동 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 기능 장애는 노화 과정에서 여러 유전 척수 소 뇌성 운동 실조증과 소뇌의 진보적 인 변성에 의해 표시 다른 운동 장애를 포함한 신경 퇴행성 질환에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜의 목적은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)에서 미토콘드리아 기능 부전을 평가하고, 병의 진행을 느리게하는 수용성 화합물 숙신산 통해 호흡 대사 약물 표적의 효능을 평가하는 것이다. 이 접근은 다른 소뇌 질환에 적용 할 수있다 수용성 요법 숙주에 적응 될 수있다.
미토콘드리아 호흡의 생체 분석을 감지하고 미토콘드리아 기능에서 질병 관련 변경 사항을 정량화하는 데 사용됩니다. 유전 적 증거 (게시되지 않은 데이터)와 SCA1 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애의 단백체 증거, 우리는 수용성 대사 부스터의 치료의 효능을 평가홈 케이지 마시는 물에 직접 화합물을 용해하여 uccinic 산. 혈액 뇌 장벽을 통과하는 약물의 능력은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 추론 될 수있다. 이들 화합물의 효능은 다음 가속 로타로드 (rotarod), 밸런스 빔 테스트 및 공간 분석 등 다양한 행동 패러다임을 사용하여 테스트 할 수있다. 소뇌 Cytoarchitectural 무결성 조롱박 세포핵 및 조롱박 수지상 세포 및 소마 검출 면역 분석법을 이용하여 평가할 수있다. 이러한 방법은 미토콘드리아 장애와 소뇌 신경 퇴행성 질환의 수용성 화합물 치료의 효능을 결정하기위한 견고한 기술이다.
서론
미토콘드리아의 전자 전달계를 이용하여 산화 적 인산화 (OXPHOS)를 통해 생성 된 미토콘드리아 ATP의 대부분과, 아데노신 삼인산 (ATP), 세포 에너지의 필수 조효소의 주요 생산자이다. 뇌는 높은 신진 대사 요구와 신경 활동에 전력을 공급하기위한 산화 적 인산화에 대한 의존도를 부여, 미토콘드리아 기능 장애에 매우 민감하다. 그 결과, 미토콘드리아 장애는 노화 과정 트리거 (1) 및 다수의 신경 퇴행성 질환은 2, 3, 4의 병인에 연루되어있다. 따라서 미토콘드리아는 신경 퇴행에 대한 매력적인 치료 대상이되는 것을 다음과 같습니다.
이 프로토콜에서, 우리는 미토콘드리아의 연구를위한 모델 신경 퇴행성 질환과 같은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)의 사용을 채택리터 부전과 미토콘드리아 - 표적으로 한 치료의 개발. SCA1 다른 뇌 영역의 조롱박 소뇌의 뉴런과 뉴런의 진보적 인 변성을 트리거 ataxin-1 유전자 산물의 폴리 글루타민 (polyQ) 반복 확장 돌연변이에 의해 발생....
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프로토콜
이 프로토콜은 마우스 작업을위한 스키드 모어 대학에서 IACUC 지침을 따른다.
수용성 화합물 처리 1.
- 케이지 마시는 물에 0.75 ㎎ / ㎖의 농도로 숙신산을 녹인다. 원하는 농도에서 관심의 수용성 화합물이 단계에서 대체 될 수 있습니다. 화합물이 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 솔루션을 저어.
- 마우스는 치료의 목적 나이에 도달 한 후, 단계 1.1의 용액으로 처리 조건 그룹의 홈 케이지 식수를 교체합니다.
- 모두 처리 한 대조군 마우스는 같은 양의 물을 마시고되도록 매일 두 실험군과 대조군의 물병의 무게를 측정한다. 케이지 당 총 약물 복용량을 계산하기 위해 이러한 측정을 사용합니다. 실험 및 모니터 병의 무게에 걸쳐 치료를 계속합니다.
2. 발자국 분석
- 바닥에 활주로를 놓거나밀폐 된 방에 테이블. 침구 및 보상 음식 늘어서 홈 상자쪽으로 약간 위쪽 각도 (예 : 설탕 시리얼)에서 활주로를 설정합니다. 흰 종이와 활주로의 길이를 줄. 피사체가 5 분 홈 상자에 적응 할 수 있습니다.
- 파랑 및 빨강 무독성 수성 도료를 각각 홈 박스에서 피사체를 제거하고, 좌우 뒷다리 페인트. 도장 인화 다중 출력 행....
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결과
숙신산과 소뇌 미토콘드리아의 약물 학적 타겟팅을 통해 우리는 소뇌 신경 퇴행성 질환 SCA1의 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애를 방지 할 수 있습니다. 숙신산 탈수소 효소, 숙신산,의 표준 전자 공여체 치료 (그림 1A) 다음과 같은 치료 및 신경 병리학 적 평가의 두 번째 주 동안 행동 평가의 시작과 함께, 한 달 동안 SCA1 마우스의 홈 케이지 마시는 물에 용해시켰다. 풋 프린트 분석 빔 분석 및 로타로드 (rotarod) 분석 가속에 의해 측정 숙신산 처리 22 SCA1 마우스의 성능을 향상시킨다. 검출 된 행동 개선 (그림 1B-D)를 학습 모터 조정 및 모터를 강화 나타냅니다.
행동의 성능의 구조는 세르의 보존.......
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토론
설명 된 바와 같이 이러한 방법을 사용하는 경우, 이들은 검출 및 소뇌 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에서 산화 적 인산화 매개 미토콘드리아 기능 부전을 경감 할 수있다. 결합 된 생화학 적 및 행동 분석은 소뇌 신경 퇴행성 질환의 병리에 미토콘드리아 기여의 정도를 결정하기위한 다각적 인 방법입니다. 신진 대사를 자극하고 미토콘드리아 기능을 강화하기 위해 숙신산과 쥐를 치료함으로써, 우리는 소뇌 행동 적자와 소뇌 변성의 구조를 표시 할 수 있습니다.
여기서 제시된 방법론은 소뇌 신경 퇴행성 질환의 치료에 잠재적 인 수용성 대사 표적 다양한 화합물을 시험하는데 사용될 수있다. 숙신산은 케이지 식수를 통해 간단한 배달을 허용하고 보충 식품 펠렛의 작성을 필요로하지 않습니다 0.75 ㎎ / ㎖의 물에 쉽게 용해된다. 다른 수용성화합물은 용이 프로토콜로 대체 될 수있다. 수용성없는 대사 표적 화합물을 사용하는 경우, 우리의 방법은 용이하게 보충 식품 펠릿
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
형질전환 마우스를 아낌없이 선물해 주신 미네소타 대학의 Harry Orr 박사님께 감사드립니다. 또한 이전 실험을 수행한 Skidmore College 졸업생인 Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson 및 Cheyanne Slocum에게도 감사드립니다. 또한 이러한 방법의 개발에 자금을 지원해 주신 Skidmore College에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데노신 디 포스페이 | 시그마 Aldrich | A2754 | ADP |
| 아스 코르 베이트 | 시그마 Aldrich | A7631 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 Aldrich | A2153 | BSA |
| 4 ', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌 | 시그마 Aldrich | D9542 | DAPI |
| 디지토닌 | 시그마 Aldrich | D141 | |
| 디티 오 트레이톨 | 시그마 알드리치 | D0632 | DTT |
| 당나귀 세럼 | 시그마 알드리치 | D9663 | |
| 글루타메이트 | 시그마 알드리치 | 1446600 | |
| 말레이트 | 시그마 알드리치 | 6994 | |
| 만니톨 | 시그마 알드리치 | M4125 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 알드리치 | P6148 | |
| 칼륨-락토바이오네이트 | 바이오 설탕 | 69313-67-3 | |
| 로테논 | 시그마 알드리치 | R8875 | |
| 사포닌 | 시그마 알드리치 | 47036 | |
| 숙신산 | 시그마 알드리치 | S3674 | |
| N,N,N′,N′ -Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield 마운팅 매체 | Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ 항체 (안티 아탁신-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary 항체 | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary 항체 | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin 항체 (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| 형질전환 마우스 제어 | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 마우스 | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| 야생형 마우스 | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton 주사기 | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm 전극 제어 장치 | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. 종이 | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP& G | 정보는 교신자에게 연락: | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health(국립보건원) | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P& G Rota-Rod v3.3.3(로타로드 소프트웨어) | PPP& G | Phidget21.dll 정보는 교신저자에게 연락( | |
| 로타로드 소프트웨어에 필요) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
참고문헌
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A.
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