쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

요약

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

초록

효율적인 희소돌기아교 형성은 척수 손상, 신생아 저산소증, 다발성 경화증 및 횡단성 척수염과 같은 탈수초성 질환을 포함한 여러 연구 분야의 치료 목표입니다. 수초화는 중추 신경계 내에서 빠른 충동 전파를 촉진할 뿐만 아니라 기저 축삭에 영양 지원을 제공하는 데 필요합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 희소돌기아교세포 분화를 촉진하거나 억제할 수 있는 요인을 식별하는 데 도움이 되도록 체외에서 연구할 수 있습니다. 현재까지 이 프로세스를 평가하는 데 사용할 수 있는 많은 방법은 많은 수의 세포를 필요로 하여 한 번에 조사할 수 있는 조건의 수를 제한하거나 노동 집약적인 정량 분석 방법을 사용했습니다. 여기에서는 여러 조건에서 동시에 희소돌기아교 형성을 결정하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법과 함께 많은 수의 고순도 OPC를 분리하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. OPC는 P5-P7 신생아 쥐 피질에서 분리하고 분화 전 3일 동안 체외에서 성장합니다. 분화 4일 후, 이중 적외선 형광 스캐닝 분석을 사용하여 희소돌기아교 형성을 평가하여 미엘린 단백질의 발현을 결정합니다.

서론

포유 동물의 중추 신경계 (CNS)의 효율적인 신경 전도는 희소 돌기 아교 세포에 의한 축삭의 수초가 필요합니다. 개발하는 동안, 희소 돌기 아교 세포는 개발 전뇌 신경 관 ^(1)의 심실 영역에서 마이그레이션 생각되는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 (개 OPC)의 풀에서 발생한다. 마이그레이션 개 OPC는 성숙 myelinating 희소 돌기 아교 세포로 분화 한 후 효율적인 임펄스 전파를 용이하게 할뿐만 아니라 영양 지원 ² 축삭을 제공 할뿐만 아니라. 성인 CNS는 모든 셀 ^3의 약 5-8%를 포함하는 회색과 흰색 물질 전반에 걸쳐 분산 개 OPC의 풍부한 인구를 유지한다. 탈수 초성 모욕에 따라, 개 OPC는 부상의 사이트로 마이그레이션 증식, 노출 축삭에 분실 또는 손상된 미엘린 수초를 대체하는 차별화. 그러나, 일부 질병 / 부상 설정에서,이 공정은 비효율적 인 것으로 판명되거나 완전히 ^{4 실패} 할 수있다. 동안만성 탈수 초화는 증상 ^(5)을 완화 할 수있다 질환, 효율적인 oligodendrogenesis 및 재유 수화의 부담에 추가 할 생각된다. 따라서 oligodendrogenesis에 실험 인자의 효과를 결정하기 위해 시험 관내 연구 OPC에 관심있다.

희소 돌기 아교 세포 분화의 상이한 단계로 통찰 단계 특정 세포 마커의 식별에 의해 가능하게되었다. 자기 갱신 초기 전구 세포, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (α)의 발현 (PDGFRα)에 의해 정의되는, 신경 / 신경교 항원이 (NG2)과 A2B5 ^6-8. OPC를 자신의 분화 과정을 개시하고, 세포주기로부터 탈퇴, 그들은 이러한 마커의 발현을 하향 조절 및 고리 뉴클레오티드 3'- 포스 (CNPase) 및 희소 돌기 아교 세포를 포함 O4 premyelinating 나타내는 단백질을 발현하기 시작한다. 마지막으로, 더 성숙한 oligodendroc으로 분화, 킬로바이트는 미엘린 관련 당 단백질 (MAG), 테오 단백질 (PLP), 및 미엘린 염기성 단백질 (MBP)을 포함하여 수초 관련 단백질의 발현을 특징으로한다. MBP는 세포 내 주변 막 단백질과 수초의 주요 구성 요소입니다. MBP 결핍 마우스는 CNS의 수초 크게 떨림, 경련 및 조기 사망 ^9,10 선도 저하되는 심각한 표현형을 개발한다. 수초에서 MBP의 중요한 역할은 생체 외 및 생체 ⁽¹¹⁾ 모두 희소 돌기 아교 세포 분화 마커로서의 사용하게되었다.

MBP 정량은 몇 가지 다른 방법을 사용하여 달성 될 수있다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 다른 치료 요법에서 MBP 수준의 정량화를 허용합니다. 면역 세포는 현미경 카메라 기반 방식이 사용되는 경우도있을 수있는 양적 질적 일반적인 접근법이다. 이 시스템은 안정적이고 근본적인 있지만희소 돌기 아교 세포 분화 연구는 이들이 각각의 약물 선별에서 이들의 사용을 제한하는 고유 단점을 갖는다. 우선, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 필요한 기본 OPC에 량이 동시에 검사 할 수있는 변수의 수를 감소시킨다. 면역 세포에 대한 세포의 요구 사항이 훨씬 낮은 반면 정량화가 목표 인 경우, 상당한 시간이 각 실험에 전념해야합니다. 다수의 이미지를 캡쳐 한 후 실험적 분석을 용이하게 정량한다. 이러한주의 사항은 높은 처리량 평가를 필요로 연구에 고려해야 할 중요한 장애물이된다. 크게 필요한 세포의 수 및 정량 분석​​을 완료하는 데 시간을 모두 줄이면서 여기에서 우리는, 면역 세포 및 수초의 정량 웨스턴 블롯 방법론 모두에서 근본적인 측면을 활용하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 과목을 포함하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 존스 홉킨스 의과 대학에 의해 승인되었습니다.

분석 후판 재고 솔루션 및 OPC 기반 미디어 1. 준비

참고 : 여기에 설명 된 쥐 OPC베이스 (사토) 미디어는 이전에 발표 된 연구 ^{12, 13에서} 파생되었습니다. 대안 미디어 제제는이 절차와 호환 할 수있다.

1. 멸균 증류수에 10 ㎍ / ml의 농도로 재현 탁 폴리 -L- 리신 (PLL). 피펫 검은 벽, 분명 바닥 24 잘 조직 문화 학년 접시의 각 웰에 희석 PLL의 400 μL.
2. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 또는 밤새 4 ° C 냉장고에 2 시간 동안 코트 조직 문화 요리.
3. 도금에 적어도 20 분 전에 코팅 요리에서 대기음 PLL. 조직 배양의 뚜껑을 부분적으로 열려 24 웰 플레이트를 배치하여 남아있는 PLL이 우물에서 건조하도록 허용후드. 우물 격리 개 OPC 도금 전에 완전히 건조되었는지 확인합니다. 세포는 액체 PLL 존재가 플라스틱을 준수하지 않습니다.
4. N 아세틸 L 시스테인 (NAC) 원액 (1000 배)를 준비 : 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) 20ml에 100 mg의 N 아세틸 L 시스테인 (NAC)를 용해. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
5. 하이드로 코티손 원액 (1000 배)를 준비 : 1 mg을 하이드로 코티손 및 용해 소용돌이에 에탄올 1 ML을 추가합니다. , DMEM의 19 ML을 추가 -20 ° C에서 솔루션 나누어지는 및 저장을 섞는다. 기본 미디어 하이드로의 첨가 교세포 ^(14)의 생존을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.
6. 디 - 비오틴 주식 솔루션 (5,000 배)를 준비 : PBS 50ml에 디 - 비오틴 2.5 mg을 녹이고. 용해에 도움이 0.1 N NaOH를 1-2 × 5 μl의 방울을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
7. 인슐린 원액 (100X)를 준비 : 조직 배양 등급의 물 50 ㎖에 25 mg의 인슐린을 녹인다. 250 μL O를 추가F 1 N 염산 및 솔루션가 선명해질 때까지 섞는다. 최대 6 주 동안 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소와 소독.
8. 사토 원액 (100 배)를 준비 :
   1. 프로게스테론 원액 (25 μg의 / μL)를 준비 : 에탄올 100 ㎕에 2.5 mg의 프로게스테론을 용해.
   2. 나트륨 셀레 나이트 원액 (400 NG / μL)를 준비 : 0.1 N NaOH를 100 ㎕에 4 mg의 나트륨 셀레 나이트를 녹여. DMEM의 10 ML을 추가하고 혼합한다.
   3. DMEM 100 ml의 인간 아포 트랜스페린의 1g, 소 혈청 알부민 1g 및 푸 트레 신 160 ㎎을 추가하고 완전히 용해 혼합한다. 프로게스테론 원액 25 μL, 아 셀렌 산 나트륨 원액 1,000 μl를 추가하고 혼합한다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
9. OPC베이스 미디어 준비 : DMEM 100 ㎖ 당 (4.5 g / 리터 D 글루코오스, L- 글루타민, 110 밀리그램 / L 피루브산 나트륨 포함) 100 μL NAC, 100 μL의 하이드로 코르티손, 20 μL의 디 - 비오틴, 1를 가하여 인슐린, 1 ml의 사토 주식, 100 ㎕의 미량 원소의 B,이 용액 B-27 보조제 (50X) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 ×) 1 ㎖. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소와 소독.
10. PDGF-AA 원액 (1000 배)을 제조 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 12.5 ml의 PBS에 250 μg의은 20 μg의 / ml의 용액을 만들기 위해 녹인다. -80 ° C에서 나누어지는 및 저장.
11. OPC 증식 미디어를 준비합니다 OPC 기반 미디어 20 NG / ㎖ PDGF-AA 보충.
12. OPC 차별화 미디어를 준비 : 45 나노 트리 요오 도티 로닌 보충 OPC 기반 미디어를.
13. 열 버퍼를 준비 : PBS 500 ml의 2.5 BSA의 g 2 ml의 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 (EDTA)를 추가하고 7.2로 pH를 조정합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소와 소독.

2. 쥐 뇌 해부

참고 : P5-P7 쥐 새끼는이 프로토콜에 사용됩니다. 각각의 쥐 강아지 피질은 약 1.5-2.0 × 10 ⁽⁶⁾ A2B5 양성 세포를 얻을 수 있습니다.

1. 250을 사용하여 모든 절제 장비 소독6; C 가열 비드 살균기.
2. 50 ML 원뿔 튜브에 PBS의 ^(칼슘과 마그네슘 ²⁺ 제외) 15 ~ 20 ML을 추가합니다. 한 50 ML 원뿔 관은 3-4 쥐 강아지 피질에 충분하다. 얼음에 50 ML 원뿔 튜브를 놓습니다. 해부 동안 다이 싱 피질 조직을 유지하기 위해 50 ㎖에게 원뿔 튜브를 사용합니다.
3. 10cm 페트리 접시에 차가운 PBS를 추가합니다. 이 접시는 광학 현미경 하에서 절개 사용될 것이다.
4. 큰 수술 가위로 잘린 쥐 새끼를 희생. 70 % 에탄올로 머리를 스프레이.
5. 전체 뇌의 압축을 풉니 다
   1. 사용 작은 가위는 중간 선 아래로 다시 귀 껍질 피부 플랩 뒤에 피부를 잘라. 중간 선 뇌간에서 시작하여 눈에 끝을 두개골을 잘라. 기본 피질의 구조를 유지하기 위해 너무 깊이 잘라하지 않도록주의하십시오.
   2. 난원 매그넘에 작은 수술 가위를 삽입하여 소뇌 두 가지 측면 인하 열등합니다. 눈 사이에 추가 컷을 확인, 개미후각 전구에 erior.
   3. 조심스럽게 다시 두개골의 각각의 절반 껍질. 차가운 PBS로 가득 10cm 페트리 접시에 전체 뇌와 장소를 제거합니다.
6. 해부 광 현미경 미세 수술 집게로 후각 전구 및 소뇌를 제거합니다.
7. 복부 표면이 빛을 현미경으로 볼 수 있도록 뇌를 뒤집습니다.
8. 사용하기 좋은 직선 집게은 뇌의 2/3에 대해 깊이 피질과 시상 하부 사이의 닫힌 집게 팁을 배치하여 무딘 절개를 수행합니다. 집게가 제자리에 일단 끝이 열 수 있습니다. 다른 반구에 대해 반복합니다.
9. 시상 하부와 중뇌 지역의 피질을 애타게.
10. 그 뒤 표면에서 중뇌을 잡고 뇌의 앞쪽 끝 부분을 박리하여 시상 ​​하부, 시상, 그리고 중뇌를 제거합니다. 전방 연결을 단절.
11. 바깥쪽으로 pealing 다음에 대한 연결을 절단하여 해마를 제거잘 구부러진 해부 집게를 사용 피질.
12. 잘 구부러진 해부 집게를 사용하여 바깥쪽으로 대각선 움직임에 기본 피질에서 폐기로 남아있는 줄무늬를 제거합니다.
13. 피질의 복부 표면에서 모든 혈관과 수막을 취소합니다.
14. 등의 표면이 볼 수 있도록 뇌를 뒤집습니다. 수막 혈관은 명백하다. 미세 해부 집게를 사용하여 기본 피질에서 필 수막. 후각 망울의 부착 위치에서 풀기 시작합니다.
15. 전체 3-4 쥐 새끼의 총 2.4-2.14 단계를 반복합니다.
16. 건조 페트리 접시에 3-4 해부 쥐 강아지 피질을 놓고 1mm X 1mm 덩어리가 달성 될 때까지 멸균 면도날로 들어온다. 한 50 ML 원뿔 튜브 (2 단계)를 얼음에 다시 배치에서 PBS로 접시를 세척하여 조직을 수집합니다.

3. 효소 및 기계 조직 해리

참고 :이 단계를 들면, 파파인 기반의 신경 분리 키트를 권장합니다. 네 사용우랄 해리 키트 (P)는, OPC 분리를위한 최적 특별한 단계가 설명되어 있습니다.

1. 적절한 버퍼와 효소 P를 희석하여 첫 번째 해리 효소를 준비합니다. 각각 50 ㎖ 원뿔 (샘플 1)의 내용은 효소 믹스 1950 μL 개의 재현 탁한다. 10 분 동안 37 ° C의 조에서 효소 믹스 찾는.
   1 샘플 : 파파인 효소의 버퍼의 1,900 μL는 + 50 μL
2. 3 분 동안 300 XG에 50 ml의 3-4 다이 싱 쥐 강아지 피질을 포함하는 원뿔 튜브를 스핀.
3. 상등액을 흡인하고, 각 샘플 튜브에 효소 용액 1950 μL를 추가 반전 튜브 가볍게 흔들어 펠렛을 깨지.
4. 연속 튜브 회전에 15 분 동안 37 ° C 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션.
5. 배양 마지막 5 분 동안 제 효소 믹스 A.는 적절한 버퍼에 효소를 희석하여 준비한다. 30 μL의 총이 추가됩니다각 50 ML 원뿔 샘플 튜브에.
   샘플 1 : 효소 완충액 20 μL + 10 μL
6. 배양이 완료되면, 각 튜브 제 효소 혼합물 30 μL를 추가 혼합 반전.
7. 피펫 컨트롤러에 연결된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 기계적으로 10 ~ 15 회 피펫 또는 조직 조각의 크기가 감소하고 용액이 흐려질 때까지 조직을 해리. 연속 회전을 15 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 샘플을 돌려줍니다.
8. 1 ML의 피펫을 사용하여 각 조직 균질 샘플을 10 ~ 15 번 피펫.
9. 200 μL 피펫을 사용하여 각 조직 균질 샘플을 15 ~ 20 회 피펫
10. 연속 회전 10 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 모든 샘플을 돌려줍니다.
11. 50m에 둔 40 μm의 기공 필터를 통해 균질 각 샘플 ^{(2 + 칼슘} 및 마그네슘과) PBS의 10 ML을 추가 및 필터링L 튜브. PBS의 추가 1-2 ml의 필터를 씻어.
12. 한 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 균질 시료 모두 풀 및 전체 세포 수를 획득.
13. 세포 수를 수행 한 후 (각 시료 튜브 1) 15ml의 원뿔형 튜브에 고르게 분할 파쇄. 300 X g에서 10 ~ 12 분 동안 원심 분리기.

4. 안티 A2B5 구슬 응용 프로그램, 열 정제 및 도금

1. 열 버퍼 및 안티 A2B5 마이크로 비드에 대한 계산을 수행합니다. 매 1 × 10 ⁶ 세포에 대한 7 μl를 열 버퍼를 추가합니다. 매 1 × 10 ⁶ 세포 2 μL 안티 A2B5 마이크로 비드를 추가합니다.
2. 10-12 분 동안 300 XG에 칼럼 완충액 10 ㎖ 원심 분리기의 총 부피 세포를 재현 탁하여 모든 샘플을 결합한다.
3. 단계 4.1에서 계산 된 열 버퍼의 적절한 양으로 세포 펠렛을 재현 탁. 펠릿 크고 느슨한 경우에만 방지를 유지 컬럼 버퍼 볼륨의 약 절반을 추가셀 재 부유의 적절한 농도의 몸.
4. 4 ℃에서 10 분 동안 세포 현탁액을 품어.
5. (단계 4.1에서 계산) 항 A2B5 마이크로 비드를 추가 여러 번 반전하고 30 ~ 60 분 동안 4 ° C에서 품어. 부드럽게 튜브를 여러 번 매 10 분을 반전. 긴 배양 시간은 세포 수율을 증가시킬 수 있지만, 비특이적 결합을 증가시킬 수있다.
6. 열 버퍼의 5 볼륨을 추가합니다. 세포를 1 ml의 부피에 재현 탁 경우 세포가 2 ㎖에 재현 탁 경우, 컬럼 완충액 10 ㎖를 추가하는 반면, 칼럼 완충액 5 mL를 추가한다.
7. 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기.
8. 정제에 필요한 얼마나 많은 LS 열을 확인합니다. 한 LS 열은 15 ~ 20 × 10 ⁽⁶⁾ 총 세포 충분하다.
9. LS 칼럼 당 칼럼 완충액 1000 ㎕의 세포 펠렛을 resuspend 것이 사용된다.
10. 프라임 컬럼 완충액 5 mL를 추가하여 각각의 LS 칼럼. 50 ML 원뿔 튜브의 흐름을 통해 수집합니다. 열 버퍼되면ffer 완전​​히 상부 챔버를 통과 한 각각의 컬럼 세포 현탁액 1000 μL를 적용하여 세포를 통해 중력에 의해 실행할 수 있습니다.
    주 : 세포 밀도가 너무 높으면, 열이 느리게 실행된다.
11. 세포 현탁액이 컬럼을 통과 한 직후, 천천히 언 바운드 세포를 씻어 각 열에 열 버퍼의 3 ㎖를 추가합니다. 세척이 용이 열 (매 30 ~ 45 초 동안 1 방울)를 통해 실행중인 경우, 열 버퍼의 3 ㎖에 두 개의 추가 시간을 씻는다.
12. 각 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 놓습니다. 컬럼 완충액 5 mL를 첨가하고 컬럼 패키징 플라스틱 플런저를 사용하여 빠른 속도로 칼럼을 통해 완충액을 뛰어. 급락 열에서 그들을 해제 결합 셀을 제거합니다.
13. LS 열 번째 라운드를 통해 샘플을 실행하여 순도를 높일 수 있습니다. 첫번째 통과 동안 사용 열의 수의 1/3을 사용한다. 프라임 열 버퍼 5 ㎖와 열입니다.열 버퍼가 상부 챔버를 통과 할 수 있습니다.
14. 세포 현탁액의 부피가 매우 클 것이기 때문에, 균일 각 열에 세포 현탁액 1000 μL를 적용하고, 현탁액은 추가로 1000 μL에 보급하기 전에 컬럼 상부 챔버를 통과 할 수있다.
15. 세포 현탁액을 완전히 열 번째 라운드에인가되면, 열 버퍼의 3 ㎖로 2-3 회 세척한다.
16. 각 열을 제거하고 멸균 15 ML 원뿔 튜브 위에 놓습니다. 열 버퍼의 5 ML을 추가하고 열로 포장 된 플라스틱 플런저를 사용하여 버퍼를 뛰어. 급락 열에서 그들을 해제 결합 셀을 제거합니다.
17. 12 ~ 15 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 펠렛은 컴팩트 나타납니다.
18. 예열 OPC 증식 배지 (PDGF-AA 20 NG / ㎖로 보충 된 OPC 기반 매체) 5-10 ml의 세포 펠렛을 재현 탁.
19. 혈구 세포를 사용하여 계산.
20. 세포를 플레이트. OPC 증식 미디어 60000 세포 / ml의 세포를 희석. 각 검정에 분명 하단 24도, 잘의 측면을 따라 세포의 피펫 500 μl를 잘 당 30,000 세포를 얻을 수있다. 가로 판을 진탕도 여덟 움직임을 이용하여 세포를 섞는다. 48, 96 또는 384 웰 플레이트에서 분석을 수행하는 경우, 각각 아니라 당 15,000, 7,500, 또는 1,500 셀을 추가 할 수 있습니다. 이 수치는 각각의 플레이트 사양에 따라 조정될 수있다.
21. 0 일 기준 제어 문화에 대해 별도의 접시를 준비합니다. 5.7 절에 설명 된대로 분화가 날 0에서 시작하는 경우이 컨트롤 판은 4 % 파라 포름 알데히드로 고정해야합니다.
22. 문화 미디어 없음 변화 3 일 동안 37 ° C에서 OPC 증식 배지에서 세포.

4 % 파라 포름 알데히드와 OPC 차별화 및 고정 5. 유도

주 : oligodendrogenesis 작은 분자의 효과를 시험 할 때, 우리는 일상적 dissolv디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 전자는 약 -80 ° C에서 저장 및 0.1 % DMSO의 최종 농도를 얻기 위해 SATO 매체에 직접 희석 수 1000 배 주식을 제조 하였다. 우리는 OPC의 증식이나 분화 하나가 이러한 DMSO 농도를 사용하여 어떠한 변화도 관찰되지 않은 (데이터는 보이지 않음).

1. 사전 따뜻한 OPC베이스 37 ° C에 미디어 및 실온으로 약물 치료의 주식을 해동. 이중으로 치료를 수행 할 때, 1.5 ㎖의 튜브에 처리 군 당 매체의 약 1.25 mL로 제조. 세중의 샘플의 경우, 느슨 함을 고려하여 2 ml의 용량 원심 분리기 튜브를 사용합니다.
2. 직접 OPC 기반 미디어로 처리 주식을 희석하여 복제 우물에 대한 치료 마스터 믹스를 준비합니다. 간단히 소용돌이 또는 부드럽게는 치료의 균일 한 분포를 보장하기 위해 각 mastermix를 섞는다.
3. 양성 대조군과 음성 대조군과 같은 적절한 수단으로 45 나노 트리 요오 도티 로닌 (T _3)를 준비한다. 10 mM의 T ₍₃₎ 주식을 희석1 : OPC베이스 미디어 1 ㎖ 1,000하고 더 필요한 경우 DMSO의 최종 농도를 감소시키는 치료 마스터 믹스 희석.
4. 세포 건조 방지하도록 시간에 배양 한 웰 투여군에서 매체를 대기음. 웰의 측면으로부터 상기 배양에 블랙 물질을 긁어 않도록 유리 파스퇴르 피펫의 끝에서 200 μL 피펫 팁을 사용한다.
5. 천천히 잘 1 ML의 피펫을 사용의 측면을 따라 처리 mastermix 500 μl를 추가합니다.
6. 2-3 일마다 신선한 치료 매체로 전체 미디어 교환을 수행, 원하는 기간에 대한 문화를 품어. 우리는 일상적으로 차별화 미디어 4 일 후 30-40 %의 MBP ⁺ 문화를 관찰합니다.
7. 원하는 치료 기간의 끝에서, 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 제조 또는 실온 냉동 보관 해동. 주의 : PFA 매우 독성 및 흄 후드에서 제조되어야한다.
8. 미디어를 대기음 천천히 (400)를 추가1, 세포를 해결하기 위해 우물의 측면에 PFA의 리터. 실온에서 20 분 동안 플레이트를 인큐베이션.
9. PFA를 대기음 천천히 세포를 씻어 잘의 측면에 멸균 (칼슘과 ²⁺ 및 마그네슘 ²⁺⁾ D-PBS 500 μl를 추가합니다. 세척 두 번 이상 총을 반복합니다. 최종 세척을 대기음하지 마십시오.
10. 나중에 처리를 위해 4 ° C에서 파​​라 필름 및 저장에 접시를 감싸거나 다음 단계로 직접 진행합니다. 플레이트를 몇 주 동안 저장 될 수있다.

미엘린 염기성 단백질 6. 면역 세포 화학 및 정량화

참고 : 24 웰 플레이트에서 액체 처리 절차를 수행 할 때, 상기 세포를 건조 피하기 위해 빠르게 작동하도록 권장한다. 여기서, 멀티 채널 진공 흡입기와 다 채널 피펫의 사용을 권장한다.

1. 0.1 % 트리톤 X-100, 5 % 함유 (칼슘과 ²⁺ 및 마그네슘 ²⁺⁾ D-PBS 250 μl를 실온에 판을 가져와 우물을 대기음 및 추가정상 염소 혈청 (NGS). 완만 한 궤도 진탕을 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
2. 1,000 토끼 다 클론 항 - 액틴 항체를 1 : 마우스 단일 클론 항 MBP 항체 1을 희석하여 기본 배양 용액을 제조 5 % NGS를 포함하는 D-PBS 200 (칼슘과 ²⁺ 및 마그네슘 ^2+). 대안 적으로, 폴리 클로 날 토끼 항 - Olig2을 1 : 1,000 혼합 신경교 배양 희소 돌기 아교 세포의 특정한 정규화 위해 사용될 수있다. 물론 당 250 μl를 수용하기에 충분한 기본 솔루션을 준비합니다.
3. 부드러운 궤도 흔들림에 16 ~ 18 시간 동안 4 ° C에서 하룻밤 일차 항체를 품어.
4. 차 배양 솔루션을 기음과 부드러운 궤도 흔들림 실온에서 (칼슘과 ²⁺ 및 마그네슘 ²⁺⁾ D-PBS 500 μL와 세포를 3 × 10 분을 씻는다.
5. 플레이트를 세척하는 동안, 항 - 마우스 (680) 및 항 - 토끼 항체 (800) 1 차 희석하여 배양 용액을 제조 하였다 : (CA)와 (D-PBS 500 ²⁺ 과의 Mg ^2+). 이 솔루션을 준비 할 때 주변 광 노출을 최소화합니다.
6. 최종 세척을 대기음 및 보조 배양 용액 250 μl를 추가합니다. 광으로부터 판을 보호 궤도 부드럽게 흔들어 1 시간 동안 실온에서이를 부화.
7. 차 배양 솔루션을 기음과 부드러운 궤도 흔들림 실온에서 (칼슘과 ²⁺ 및 마그네슘 ²⁺⁾ D-PBS 500 μL와 우물 3 × 10 분을 씻는다.
8. 700 nm 내지 800 nm의 형광 방출을 검출 할 수있는 촬상 장치를 이용하여 플레이트를 검사한다. 시작 지점으로, MBP 1.5 3과 감도, 굴지 5.0 및 Olig2 3.5 오프셋 초점을 설정합니다. 신호 과다 노출을 방지하기 위해 필요한 감도 값을 조정한다.
9. 반 자동화 된 소프트웨어 기반의 방법을 사용하여 oligodendrogenesis의 정도를 정량화.
   1. 소프트웨어를 사용하여 플레이트 분석 모드를 "24 음"으로 설정하고 주위 t 원 정렬스캔 한 우물 그는 외주. "800"로 정상화 채널을 설정하고 700 nm의 (MBP) 및 800 nm의 (Olig2 / 액틴) 채널에 대한 전체 및 상대 형광 강도를 보냅니다.
   2. 상대적 형광 단위의 표준화 MBP 식주고 800 nm에서 강도가 700 nm에서의 강도를 나눈다. 복제 측정치의 평균을 계산 및 분석을 위해 필요에 따라 날을 0 + PDGF 컨트롤 식 확장.

결과

A2B5 양성 자성는 OPC를 컬럼 분리 시스템을 이용하여 양성 세포의 선택을 통해 분리된다. 분리 과정 이전에, 전체 뇌 P5와 P7 사이에 래트 새끼로부터 제거된다. 전뇌 성공적 두개골로부터 분리되면, 후각 전구 및 소뇌 미세 수술 집게 (도 1A)를 사용하여 제거된다. 대뇌 피질 조직을 분리하기 위해 시상 하부, 시상과 중뇌는 조심 해부 (그림 1B)에 의해 절제된다. 다음으로, 해마와 줄무늬는 구부러진 수술 집게 (- D 그림 1C)를 사용하여 제거된다. 분리 과정은 효율적 수막염 및 섬유 아세포 세포를 제거하지만, 수막 및 혈관이 (도 1E)를 제거 할 때의 효소 소화가 향상된다. 마지막으로, 1mm X 1mm의 조직 블록도 (후속 조직 해리 단계에 대한 준비가되어 있습니다URE ...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 쥐 개 OPC를 분리하고 실험적인 요인에 반응하여 체외 oligodendrogenesis의 정량화를위한 ​​빠르고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 긍정적 인 선택을 사용 가능한 순수 개 OPC의 높은 수율은 실험 목적에 직접 사용됩니다. 이 방법은 1 주일 기간에 분리 배양, 분화 단계를 간소화하고, 고정 된 세포는 편리하게 분석 감도의 손실없이 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.

스캐너 계 형광 분석법으로 큰 장점은 데이터 수집 및 분석을 크게 전통적인 카메라 기반 현미경 기술에 비해 신속한된다는 것이다. 현미경 OPC 분화 유도제를 식별하는 높은 처리량 스크린에 성공적으로 사용되었지만, 그것은 토륨 수백 촬상 시퀀스 프로그래밍, 데이터 수집 몇 시간 분석을 필요로하기 때문에, 데이터 수집은 본질적 느리다이미지 파일, 및 사용자 정의 알고리즘 ousands 정규화 또는 분석 ^18,19 개별 균체를 구별한다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm 폴리스티렌 페트리 접시	Fisherbrand	0857512
광 해부 현미경	Motic	SM2-168
Dissociation 재료
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μ m 세포 여과기	Corning	352340
A2B5 컬럼 정제
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	비드 결합 A2B5 항체
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401	자기 선택 컬럼
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS(Ca2+ 및 Mg2+	Corning	20-030-CV	1x 포함
소 세럼 알부민	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
<강한>배양 재료
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
디메틸 설폭사이드	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	시그마-알드리치	T6397	45 nM
클레마스틴 푸마르산염 염	시그마-알드리치	SML0445-100MG	1 μ M
케티아핀 헤미푸마레이트 염	시그마-알드리치	Q3638-10MG	1μ M
N- 아세틸 시스테인	시그마 - 알드리치	A9165	5 μ g/ml
프로게스테론	시그마-알드리치	P8783	60 ng/ml
폴리-L-라이신	시그마-알드리치	P1524	10 μ g/ml
푸트레신	시그마-알드리치	P7505	16 & g/ml
나트륨 셀레나이트	시그마-알드리치	S5261	40 ng/ml
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H0135	50 ng/ml
d-비오틴	시그마-알드리치	B4639	10 ng/ml
인슐린	시그마-알드리치	I6634	5 μ g/ml
Apo-Transferrin	시그마-알드리치	T1147	100 & g/ml
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A4161	100 μ g/ml
미량 원소 B	코닝	25-022-Cl	1x
B-27 보충제	생명 기술	17504044	1x
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
뚜껑이 있는 24웰 블랙 Visiplate	Perkin Elmer	1450-605	조직 배양 등급
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
마우스 단클론 항 MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 희석
토끼 다클론 항 Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 희석
토끼 다클론 항 Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 희석
염소 항 마우스 680RD	Licor	926-68070	1:500 희석
염소 항 토끼 800CW	Licor	926-32211	1:500 희석
Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스	Life Technologies	A11032	1:1,000 희석
Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼	Life Technologies	A11008	1:1,000 희석
DAPI로 골드 안티페이드 연장	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
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