쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

요약

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

초록

효율적인 희소돌기아교 형성은 척수 손상, 신생아 저산소증, 다발성 경화증 및 횡단성 척수염과 같은 탈수초성 질환을 포함한 여러 연구 분야의 치료 목표입니다. 수초화는 중추 신경계 내에서 빠른 충동 전파를 촉진할 뿐만 아니라 기저 축삭에 영양 지원을 제공하는 데 필요합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 희소돌기아교세포 분화를 촉진하거나 억제할 수 있는 요인을 식별하는 데 도움이 되도록 체외에서 연구할 수 있습니다. 현재까지 이 프로세스를 평가하는 데 사용할 수 있는 많은 방법은 많은 수의 세포를 필요로 하여 한 번에 조사할 수 있는 조건의 수를 제한하거나 노동 집약적인 정량 분석 방법을 사용했습니다. 여기에서는 여러 조건에서 동시에 희소돌기아교 형성을 결정하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법과 함께 많은 수의 고순도 OPC를 분리하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. OPC는 P5-P7 신생아 쥐 피질에서 분리하고 분화 전 3일 동안 체외에서 성장합니다. 분화 4일 후, 이중 적외선 형광 스캐닝 분석을 사용하여 희소돌기아교 형성을 평가하여 미엘린 단백질의 발현을 결정합니다.

서론

포유 동물의 중추 신경계 (CNS)의 효율적인 신경 전도는 희소 돌기 아교 세포에 의한 축삭의 수초가 필요합니다. 개발하는 동안, 희소 돌기 아교 세포는 개발 전뇌 신경 관 ^(1)의 심실 영역에서 마이그레이션 생각되는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 (개 OPC)의 풀에서 발생한다. 마이그레이션 개 OPC는 성숙 myelinating 희소 돌기 아교 세포로 분화 한 후 효율적인 임펄스 전파를 용이하게 할뿐만 아니라 영양 지원 ² 축삭을 제공 할뿐만 아니라. 성인 CNS는 모든 셀 ^3의 약 5-8%를 포함하는 회색과 흰색 물질 전반에 걸쳐 분산 개 OPC의 풍부한 인구를 유지한다. 탈수 초성 모욕에 따라, 개 OPC는 부상의 사이트로 마이그레이션 증식, 노출 축삭에 분실 또는 손상된 미엘린 수초를 대체하는 차별화. 그러나, 일부 질병 / 부상 설정에서,이 공정은 비효율적 인 것으로 판명되거나 완전히 ^{4 실패} 할 수있다. 동안만성 탈수 초화는 증상 ^(5)을 완화 할 수있다 질환, 효율적인 oligodendrogenesis 및 재유 수화의 부담에 추가 할 생각된다. 따라서 oligodendrogenesis에 실험 인자의 효과를 결정하기 위해 시험 관내 연구 OPC에 관심있다.

프로토콜

동물 과목을 포함하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 존스 홉킨스 의과 대학에 의해 승인되었습니다.

분석 후판 재고 솔루션 및 OPC 기반 미디어 1. 준비

참고 : 여기에 설명 된 쥐 OPC베이스 (사토) 미디어는 이전에 발표 된 연구 ^{12, 13에서} 파생되었습니다. 대안 미디어 제제는이 절차와 호환 할 수있다.

1. 멸균 증류수에 10 ㎍ / ml의 농도로 재현 탁 폴리 -L- 리신 (PLL). 피펫 검은 벽, 분명 바닥 24 잘 조직 문화 학년 접시의 각 웰에 희석 PLL의 400 μL.
2. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 또는 밤새 4 ° C 냉장고에 2 시간 동안 코트 조직 문화 요리.
3. 도금에 적어도 20 분 전에 코팅 요리에서 대기음 PLL. 조직 배양의 뚜껑을 부분적으로 열려 24 웰 플레이트를 배치하여 남아있는 PLL이 우물에서 건조하도록 허용후드. 우물 격리 개 OPC 도금 전에 완전히 건조되었는지 확인합니다. 세포는 액체 PLL 존재가 플라스틱을 준수하지 않습니다.
4. N 아세틸 L 시스테인 (NAC) 원액 (1000 배)를 준비 : 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) 20ml에 100 mg의 N 아세틸 L....

결과

A2B5 양성 자성는 OPC를 컬럼 분리 시스템을 이용하여 양성 세포의 선택을 통해 분리된다. 분리 과정 이전에, 전체 뇌 P5와 P7 사이에 래트 새끼로부터 제거된다. 전뇌 성공적 두개골로부터 분리되면, 후각 전구 및 소뇌 미세 수술 집게 (도 1A)를 사용하여 제거된다. 대뇌 피질 조직을 분리하기 위해 시상 하부, 시상과 중뇌는 조심 해부 (그림 1B)에 의해 절제된다. 다음으로, 해마와 줄무늬는 구부러진 수술 집게 (- D 그림 1C)를 사용하여 제거된다. 분리 과정은 효율적 수막염 및 섬유 아세포 세포를 제거하지만, 수막 및 혈관이 (도 1E)를 제거 할 때의 효소 소화가 향상된다. 마지막으로, 1mm X 1mm의 조직 블록도 (후속 조직 해리 단계에 대한 준비가되어 있습니다URE .......

토론

여기에 제시된 프로토콜은 쥐 개 OPC를 분리하고 실험적인 요인에 반응하여 체외 oligodendrogenesis의 정량화를위한 ​​빠르고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 긍정적 인 선택을 사용 가능한 순수 개 OPC의 높은 수율은 실험 목적에 직접 사용됩니다. 이 방법은 1 주일 기간에 분리 배양, 분화 단계를 간소화하고, 고정 된 세포는 편리하게 분석 감도의 손실없이 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.

스캐너 계 형광 분석법으로 큰 장점은 데이터 수집 및 분석을 크게 전통적인 카메라 기반 현미경 기술에 비해 신속한된다는 것이다. 현미경 OPC 분화 유도제를 식별하는 높은 처리량 스크린에 성공적으로 사용되었지만, 그것은 토륨 수백 촬상 시퀀스 프로그래밍, 데이터 수집 몇 시간 분석을 필요로하기 때문에, 데이터 수집은 본질적 느리다이미지 파일, 및 사용자 정의 알고리즘 ousands 정규화 또는 분석 ^18,19 개별 균체를 구별한다........

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm 폴리스티렌 페트리 접시	Fisherbrand	0857512
광 해부 현미경	Motic	SM2-168
Dissociation 재료
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μ m 세포 여과기	Corning	352340
A2B5 컬럼 정제
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	비드 결합 A2B5 항체
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401	자기 선택 컬럼
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS(Ca2+ 및 Mg2+	Corning	20-030-CV	1x 포함
소 세럼 알부민	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
<강한>배양 재료
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
디메틸 설폭사이드	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	시그마-알드리치	T6397	45 nM
클레마스틴 푸마르산염 염	시그마-알드리치	SML0445-100MG	1 μ M
케티아핀 헤미푸마레이트 염	시그마-알드리치	Q3638-10MG	1μ M
N- 아세틸 시스테인	시그마 - 알드리치	A9165	5 μ g/ml
프로게스테론	시그마-알드리치	P8783	60 ng/ml
폴리-L-라이신	시그마-알드리치	P1524	10 μ g/ml
푸트레신	시그마-알드리치	P7505	16 & g/ml
나트륨 셀레나이트	시그마-알드리치	S5261	40 ng/ml
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H0135	50 ng/ml
d-비오틴	시그마-알드리치	B4639	10 ng/ml
인슐린	시그마-알드리치	I6634	5 μ g/ml
Apo-Transferrin	시그마-알드리치	T1147	100 & g/ml
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A4161	100 μ g/ml
미량 원소 B	코닝	25-022-Cl	1x
B-27 보충제	생명 기술	17504044	1x
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
뚜껑이 있는 24웰 블랙 Visiplate	Perkin Elmer	1450-605	조직 배양 등급
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
마우스 단클론 항 MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 희석
토끼 다클론 항 Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 희석
토끼 다클론 항 Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 희석
염소 항 마우스 680RD	Licor	926-68070	1:500 희석
염소 항 토끼 800CW	Licor	926-32211	1:500 희석
Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스	Life Technologies	A11032	1:1,000 희석
Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼	Life Technologies	A11008	1:1,000 희석
DAPI로 골드 안티페이드 연장	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
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