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방법 논문

타액 기능 저하의 쥐 모델에서 Retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사

11.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53785

⸱

2016년 4월 24일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Molecular Physiology and Therapeutics Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, NIH, DHHS

이 논문에서

요약

두경부 방사선 요법의 주요 부작용인 타액선 기능 저하로 환자의 삶의 질을 떨어뜨립니다. 동물 모델에서 새로운 치료법의 효능을 입증하는 것은 임상 전환 전에 전제 조건입니다. 이 프로토콜은 쥐의 턱밑샘에 대한 후향 투여 및 국소 방사선 조사에 대해 설명합니다.

초록

방사선 입구 안에 있는 정상 조직은 부주의로 손상됩니다. 타액선은 두경부 방사선 치료 중에 손상되는 경우가 많습니다. 돌이킬 수 없는 세포 손상은 기본적인 구강 활동을 손상시키고 구강 감염 및 충치의 위험을 증가시키는 만성적인 타액 기능 손실을 초래합니다. 타액 기능 저하와 그 합병증은 환자의 편안함에 심각한 영향을 미칩니다. 현재 이 질환의 증상 관리는 효과적이지 않으며, 이 질환을 완화하기 위한 새로운 치료법이 필요합니다.

침샘은 배설관을 통해 분비물을 입으로 배출하는 외분비샘입니다. 이 관의 캐뉼레이션은 땀샘에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 주요 타액선에 조영제를 후방으로 전달하는 것은 진단 영상을 위한 일상적인 외래 환자 절차입니다. 유사한 절차를 사용하여 땀샘의 국소 치료가 가능합니다. 그러나 작은 동물을 대상으로 한 전임상 연구에서 이 기술을 수행하는 것은 고유한 문제를 제기합니다. 이 연구에서는 Bruce Baum 박사의 실험실(NIH)1에서 개선된 절차인 쥐의 턱밑샘에 대한 후향 투여 기술을 설명하고 국소 분비선 방사선 조사 절차를 제시합니다.

서론

건강한 조직의 담보 파괴는 암 치료의 해로운 부작용의 다수를 차지한다. 방사선 필드 거짓말 주요 침샘의 일부 또는 전부가 불가피하게 파괴된다. 따라서, 골수 이식 전에 경부암, 자궁 경관 임파종 또는 전신 조사를위한 방사선 치료를받은 대부분의 환자들은 방사선, 침샘의 기능 저하 2-6의 일반적인 영구 부작용을 겪는다.

침샘의 유체 생산 선방 세포는 방사선에 심하게 민감하다. 침샘의 손상은 타액의 흐름과 같은 타액 기능 저하라고하는 조건의 급격한 감소하는 발생합니다. 타액의 흐름에서 만성 감소는 저작, 연하, 음성, 맛,하지만 강렬한 통증, 점막 눈물, 연하 곤란, 기회 감염의 병적 인 후유증으로 키 구강 활동을 손상 및 충치는을 악화환자의 건강과 기능 2,3.

방사선 관련 타액선 세포 손실 비가역 때문에, 구강 건조증의 더 교정 치료는 없다. 인공 타액 대체 및 prosecretory 약물로 증상을 assuaging에 초점을 맞추고 현재 치료는 장기적인 구호 6 비효율적이다. 개선 된 방사 전달 기술은 증상의 중증도를 감소 도움이되지만, 정상 조직에 독성 및 부작용은 암 치료에 -6,7- 제한 요소 남아있다. 방사선 - 관련 합병증을 예방하는 선제 대책 따라서, 표준이되고있다. DNA 수리 자유 라디칼 산소 종, 위탁 셀 다시 채우기를 청소할 또는 향상 라디오 - 보호제는 타액 기능 저하 8-11을 피하기 위해 탐구되고있다.

외분비 침샘의 분비는 주요 배설 덕트를 통해 입으로 배출. 일의 내 경구 삽관조영제의 주입을위한 전자 배설 덕트는 외래 환자 절차로 정기적으로 수행됩니다. 유사한 방법을 이용 침샘 직접 국소 치료 (12)를 대상으로 할 수있다. 이 외에 전신 부작용의 위험을 감소에서, retroductal 선 점안 혜택을 추가했다. 도관 트리 주위 타액선 세포의 단층 배열은 모든 타액 상피 세포 표적화 수 있고, 장벽 그랜드 행위 섬유상 캡슐 불필요한 치료 확산을 줄이기 위해. 본질적으로, 침샘은 방사선에 의한 타액의 기능 저하 등의 글 랜드 고통의 표적 치료를위한 최적 적합하다.

주 동안 - (2.5 Gy를 / 분수 / 일, 주 5 일 1.8) 암 치료에 대한 기존의 방사선은 작은 용량으로 제공됩니다. 따라서, 실험 모델의 장기화 조사 방식에 대한 효능을 보여줍니다 라디오 보호 치료는 큰 임상 베어링을 보유하고 있습니다. COMPRO분획 후 방사능 mised 타액 함수 작은 동물에 기록하지만, 방사선 소스, 도즈 비율 및 사용되는 프로토콜은 다양한 9,10,13이다되었다.

이 보고서에 retroductal 배달 및 환자 관련 방사선 소스 및 용량 부분을 사용하여 쥐 턱밑 샘의 지역화 된 방사선하는 방법을 설정합니다.

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프로토콜

모든 절차는 LSU 건강, 슈 리브 포트, 동물 관리 및 사용위원회의 승인 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 NIH의 지침에 따라이었다 하였다.

쥐 턱밑 침샘의 1 캐 뉼러

  1. 주사기 - 튜브 어셈블리의 제조
    1. 메스로 PE10 폴리에틸렌 튜브의 10cm 길이를 잘라. 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 관의 양쪽 끝을 잡고. 부드러운 불꽃 상기 튜브의 중간 부분을 가열, 부드럽게 양쪽을 잡아 당겨 길이를 두 배로 연화 튜브를 스트레칭.
    2. 테이퍼 끝 각 - 2 캐 뉼러를 얻기 위해 45 오의 각도로 메스와 중간에 튜브를 잘라. 0.5 CC의 인슐린 주사기의 29 G 바늘 이상을 맞춤으로써 캐 뉼러의 비 테이퍼 끝을 확장합니다.
    3. 정맥을 제거하고 주사기로 생리 식염수 220 μl를 그립니다. 공기 방울을 제거하기 위해 누릅니다. cannul를 장착바늘을 통해, 공기를 배출하고 정맥을 통해 솔루션의 자유로운 흐름을 보장하기 위해 주사기 플런저를 밀어 넣습니다. 200 μL에 볼륨을 조정합니다.
  2. 턱밑 글 랜드 덕트의 내부 구강 캐 뉼러
    참고 : 오토 클레이브 악기 절차 이전에, 뜨거운 구슬 살균기 절차 사이에 소독.
    1. 스프 라그 돌리 쥐의 무게를 측정하고, 피하 주사기에서 계산 된 케타민의 볼륨 (42 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏) / 아세 프로 마진 (1.4 ㎎ / ㎏) 혼합 분배.
    2. 검지 한 손의 엄지 손가락 사이의 꼬리의 기부를 파악하고 파악 몸체 위에 다른 손으로 밀어 동물을 억제. 엄지 손가락과 나머지 손가락으로 몸통을 누르고있는 동안 머리의 측면을 따라 색인과 중간 손가락을 휴식.
    3. 뒷다리 근육에 마취제를 주입한다. 발가락 핀치와 눈꺼풀 반사에 의한 마취의 깊이를 확인합니다. 건조의 동안을 방지하기 위해 눈 윤활제를 적용동물 마취입니다.
    4. 특수하게 설계된 플랫폼 (그림 1)에 동물을 배치하고 가로 막대의 위쪽 앞니의 치아를 참여. 아래 앞니 주위에 고무 밴드를 반복하고 플랫폼에 고정하여 아래 턱을 아래로 당깁니다.
    5. 혀를 통해 멸균 봉합을 전달하고 구강의 바닥 인상을 올립니다. 지혈과 봉합을 고정하고 가로 가로대 위를 전달합니다.
    6. 사용자 정의 내장 뺨 스프레더 (그림 1)과 함께 뺨을 확장하고 해부 현미경 입의 바닥에 설하 용의자를 찾습니다.
    7. 섬세한 집게를 사용하여 예비 성형 PE10 튜브의 테이퍼 끝을 잡고. 조심스럽게 설하 유두의 유관 구멍에 정맥의 끝을 조작 할 수 있습니다. 이 3 스레드에 의해 정맥의 위치를​​ 확인 - 덕트에 5mm를; 이 장애물없이 통과 있는지 확인합니다.
  3. 턱밑 글 랜드 Instillation
    1. 목의 목덜미에 피하 아트로핀 (0.5 ㎎ / ㎏)을 주입하고, 타액 분비의 감소를 위해 10 분을 기다립니다.
    2. 시아 노 아크릴 레이트 (접착제)의 드롭 덕트 구멍을 캐 뉼러를 고정하고, 건조 할 수 있습니다. 천천히 50 μL / 분 ~의 속도로 시린지 플런저를 가압하여 마개 (200 μL / 샘)의 용액을 주입.
    3. 지혈제와 튜브를 분쇄, 조심스럽게 주사기를 제거합니다. 동물이 의식을 회복 할 때까지 60 분 - 30 덕트에 튜브를 유지. 혀를 보유하고 봉합사를 제거합니다.
    4. 별도의 케이지에 동물을 전송하고 복구하는 동안 따뜻한 유지하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
    5. 동물이 완전히 외래되면, 음식과 물에 대한 무제한 접근 할 수있는 동식물 사육장에서 그것을 집.

2. 현지화 된 분획 조사턱밑 글 랜드의

  1. 전술 한 바와 같이 동물을 억제하고, 뒷다리의 근육 내 케타민의 투여 (33 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (6 ㎎ / ㎏) / 아세 프로 마진 (1 ㎎ / ㎏)으로 마취 믹스. 마취의 깊이를 확인하고 눈에 윤활제를 적용합니다.
  2. 선형 가속기 탁상에 동물 부정사를 놓고 머리를 기울여 목을 확장합니다. 흉골의 상단 하악골의 하부 경계에서의 영역을 포함하는 방사선 필드 (3cm 슬릿 폭)을 시준.
  3. 이 지역에 걸쳐 1cm 조직 - 상응하는 덩어리를 놓고 방사선 소스와 100cm에 덩어리의 상단 사이의 거리를 조정합니다.
  4. 선형 가속기의 6 MV 광자 빔을 사용하여 동물 (2.5 Gy의)을 조사한다. 노출 시간을 지시한다 표면 루스하도록 방사선 소스로부터 레이트, 필드 크기 및 거리 복용량. 설정된 전류, 동물 ~ 1 Gy의 / 분의 투여 량 비율을 조사 하였다.
  5. 노출을 반복; 8 개의 2.5 Gy의 / 일일; 사일 / 사이에 2 일 간격으로 주. 복구하는 동안 동물을 따뜻하게 유지. 완전히 외래 후 사육장으로 동물을 이동.
  6. 선 기능 (14)을 측정하는 방사선 후 자극 턱밑 글 랜드 타액 8 주 수집합니다. 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 / 인산염 완충 식염수 산도 7.2의 심장 재관류에 의해 마취하에 동물을 안락사. 조직 학적 및 면역 조직 화학 (14)를 분석하기위한 턱밑 샘을 근절.

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결과

최소한의 침습적 sialography 기술을 적응, 주요 침샘의 지역 치료는 가능하다. 쥐 턱밑 침샘에서 Retroductal 정부는 와튼의 덕트의 내부 경구 삽관 (그림 2)에 의해 시도되었다. 입의 바닥에있는 하위 언어 용의자에 열려 와튼의 타액 덕트,하지만 구멍은 쉽게 볼 수 없습니다. 캐 뉼러의 삽입은, 그러므로, 부드러운 프로빙에 의해 수행되었다. 캐 뉼러를 배치하는 동안 부적당 한 출혈 또는 덕트 천공을 방지하기 위해, 더 힘이 사용되지 않았다. 덕트의 캐 뉼러의 부드러운 저항 자유 통로는 튜브의 부드러운 전후 이동에 의해 확인되었다.

초기 실험 중 삽관 (그림 3) 헤 마톡 실린 또는 트리 판 블루 용액으로 선을 주입하고, 안락사 동물에서 선 염색을 평가하여 확인 하였다. 미군 병사볼륨이...

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토론

침샘은 종종 머리 목 암, 목 노드의 선택 과목 절제, 또는 지역 혈액 종양에 대한 방사선 치료를받은 환자에서 조직 복구의 임계 값을 초과 방사선 량을받을 수 있습니다. 그랜드 유체 분비 선포 세포는 말기 분화되어 있지만, 이들은 역설적 방사선에 민감하다. 분비 기능은 만성 낮은 타액 출력에 복사하고, 돌이킬 수없는 선 피해 결과의 첫 주 이내에 삭제합니다. 가난한 선 기능과 계속된다 구강 건조를 방지하기 위해, 보존 또는 분비 기능의 회복은 매우 중요하다. 방사선 손상을 방지 또는 복구하는 소설 요법, 16 ~ 20는 1 8-11 연구되고있다.

치료의 전신 투여가 아닌 대상 조직에서 원치 않는 효과의 고유 위험을 운반합니다. 침 분비하는 것을 목표로 배달 이러한 위험을 감소. Retroductal 유전자 치료 또는 예방에 효과적방사선 관련 침샘의 고통 1, 9, 11, 16,17,20 또는 치료. 그러나, 동일한 기술을 사용하여, 침샘...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

방사선량 측정에 도움을 주신 Dr. John Chang(LSU Health Science Center, 방사선 종양학)에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 학회(American Cancer Society, 보조금 번호: 116945-RSG-09-038-01-CCE), 미국 국립보건원(National Institute of Health, 보조금 번호: R21CA173162) 및 파이스트-바일러 암 센터(Feist-Weiller Cancer Center)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인트라메딕 폴리에틸렌 튜빙 (PE10)Becton Dickson427401
1/2 cc 인슐린 주사기 U-100Becton Dickson309306
인공 눈물밀러 수의사 공급 5098-9840-64
핫 비드 살균기정밀 과학 도구18000-45
Perma-Hand 실크 봉합EthiconK833H
Graefe forcepFine Science Tools11051-10
Olympus SZX16 스테레오 현미경헌트 광학 및 이미징
6 MV 선형 가속기Elekta
볼루스 - 스킨리스 CivcoMTCB410
열 램프Braintree ScientificHL-1  110볼트
사

참고문헌

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