방법 논문

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

DOI:

10.3791/53790

⸱

2016년 3월 20일

 , 
1The Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Plant Biology and Pathology, Rutgers, The State University of New Jersey

이 논문에서

요약

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세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

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살아있는 세포의 동적 신호 이벤트의 시각화 도전하고있다. 우리는 식물 세포 내에서 신호 전달의 공간 분포를 모니터링하기위한 시험 단백질 - 단백질 상호 작용에서 설정된 일시적 발현 시스템 담배 표피 세포에 생체 분자 형광 상보성 (BiFC) 분석을 확대. 이러한 프로토콜에서는, 상호 작용 및 애기 MAPKKK 요다와 MAPK6 간의 시그널링은 세포막에서 발생한다는 표시하도록 BiFC 분석을 사용 하였다. 골격 단백질 BASL이 공동 발현되면 요다-MAPK 상호 작용 공간적 재분배 CFP-BASL와 공동 편광. 이 변형 담배 발현 시스템은 자국어 동적 변경 (이하 4 일) 및 형광 단백질 색 (적어도 3 개)의 복수를 수용 할 수있는 신호의 신속한 시험을 허용한다. 우리는 또한 단백질 분포 (비대칭 공간 지역화, 또는 "양극화"를 정량화하는 자세한 방법을 제시) 담배 세포입니다. 이 고급 담배 발현 시스템은 살아있는 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트 퀵 테스트 널리 사용될 가능성을 가지고있다.

서론

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단백질은 예측할 수없는 셀룰러 환경에서 발생하는 거의 모든 생물학적 과정에서 중추적 인 역할을 복잡한 계층 적 네트워크와 양식 단지 내에서 상호 작용한다. 그러나 성장 반응에 공장 개발에서, 단지 신속뿐만 아니라 효율적으로 세포 내 수준에서 이러한 동적 신호 이벤트를 식별하고 모니터링 할 수 없습니다 편리한 도구의 부족이 있었다.

담배 잎 표피에 과도 단백질 발현 시스템은 살아있는 세포에 형광 단백질을 시각화 장점을 호소하고있다. 이 시스템은 번역 후 단백질 수정 및 단백질 지역화의 빠른 검사를 수 반 생체 조건을 제공합니다. 보완적인 YFP 신호를 조사함으로써, 이분자 형광 상보성 (BiFC) 분석은 식물 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 가능성을 알린다. 다른 방법, 예를 들어, 효모 두 하이브리드 (Y2H)와 공동 비교-immunoprecipitation은 (주-IP), BiFC는 단백질 - 단백질 상호 작용이 세포 내 수준에서 발생할 수있는 구획을 시각화하는 강력한 수단을 제공한다.

비대칭 세포 분열 (ACD)는 조직 / 기관의 형성을위한 새로운 유형의 세포를 생성하는 동안 세포 집단 줄기 유지 때문에 진핵 다세포 촉진하는 필수 불가결 한 장치....

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프로토콜

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1. 플라스미드 건설

  1. 이전 1,6 설명 된대로 기술을 복제하여 구조를 생성합니다.
    1. 제 BASL의 ​​코딩 서열을 증폭하기 위하여 적절한 프라이머 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하고 YDA MPK6와 입력 벡터에 그들을 서브 클론. 7 상세한 프로토콜을 찾을 수 있습니다.
    2. (각각 DNmpk6 8 DNyda 4) MPK6 및 YDA 지배적 음수 버전을 생성하기 위해 주형으로 MPK6 및 YDA의 엔트리 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이 법 9 점 돌연변이를 도입.
  2. pH35CG (10)에 BASL를 통합하는 표준 LR (attL X의 ATTR 재조합) 반응 (7 자세한 절차)를 실시, 담배 과도 분석을위한 구조를 구축하기 위해, DNyda 및 pXNGW에 DNmpk6 및 pXCGW은 각각 11 벡터.
    1. 효소 분해 및 시퀀싱에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. 일단이야uccessful, 아그로 박테 리움이 변형 GV3101 12 투메 파시 엔스로 진 구조를 변화시키고이 ....

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결과

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과민 MAPK 신호에 의해 유도되는 세포 사멸을 방지하기 YDA (DNyda) 및 MPK6 (DNmpk6)의 키나아제 비활성 버전 담배 세포에서 공동 발현 분석에 사용 하였다. 어느 BiFC도 CFP-BASL 자체 생성 된 불균일 한 분포 패턴 (그림 3A-B)에 의해 밝혀 DNyda과 DNmpk6 사이의 상호 작용. CFP-BASL가 DNyda-DNmpk6 상호 쌍에 도입 하였다 그러나, CFP와 YFP 신호 모두 높은 편광 방식 (도 3C)에 재분배 하였다. 이 재배포 BASL은 공간적으로 식물 세포에서 MAPK 신호 전달 경로를 다시 구성 할 YDA 및 MPK6와 상호 작용하는 것이 좋습니다. 포스 포 결핍 버전이 약한 활동 (6)을 보여 주었다 반면, 매우 강한 극성 생성 BASL의 포스 흉내 버전 : BASL의 인산화 상태는 MAPK 신호의 극성 정도에 차등 영향이 있습니다. 이러.......

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토론

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일반 사용 및 신호 전달에 대한 담배 과도 식 시스템의 가능한 수정 : 형광 단백질의 과발현 (FP)는 성공적으로 식물 세포에서 단백질의 세포 내 지역화의 빠른 검사를 위해 사용 된 담배 표피에있는 단백질을 -tagged. 그러나, 란타 단백질 복합체의 동적 시그널링 분포를 연구하기 때문에 복잡한 세포 내 컨텍스트 과도 단백질 - 단백질 상호 작용 및 신호 전달 사건 어려운 주제이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 MAPK 신호 이벤트를 검사 할 BiFC 시스템을 이용했다. 공동 발현 YDA-nYFP 및 MPK6-cYFP을 회수하여 YFP 신호는 MAPK 신호 중계의 활성화는 세포막에서 발생할 수있는 것으로 나타났다.

그것은하는 것이 이상적 일 것이다 공동 명시 형광 YDA 및 MPK6는 애기 장대에서 생체 내에서 동적 MAPK 신호를 검사하는 태그. 그러나 GE의형질 전환 식물체를 nerati.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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원고 교정에 응해주신 Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University)님께 감사드립니다. BASL 극성 형성에 대한 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)가 J.D.(R01GM109080) 및 럿거스 대학(Rutgers University)에 수여하는 보조금의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Phusion DNA 중합효소New England BiolabsM0530S
pENTR/D/TOPOLife TechnologiesK2400-20
QuickChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트애질런트 기술200521
LB 육수AMRESCOJ106-2KG
Bacto AgarAMRESCOJ673-1KG
겐타마이신시그마-알드리치G3632-1G
리팜피신시그마-알드리치R3501-1G
카나마이신시그마-알드리치K4000-25G
스펙티노마이신시그마-알드리치S4014-5G
MgCl<>2시그마-알드리치M8266-100G
25 x 75mm 슬라이드VWR16004-382
24 x 50 mm 커버 유리VWR48393-241
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Leica TCS SP5 IILAS AF Lite 소프트웨어
40X 대물 렌즈LeicaHCX  APO 계획 HCX  Plan APO, NA 1.30
원심분리기Thermo ScientificSORVALL 6+
홀 펀처스테이플 50ml
팔콘 튜브Genesee Scientific21-108
No. 5 집게Canemco & Marivac205EQA-사양

참고문헌

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  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (200....

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재인쇄 및 허가

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태그

BiFCBASL

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