담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

요약

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

살아있는 세포의 동적 신호 이벤트의 시각화 도전하고있다. 우리는 식물 세포 내에서 신호 전달의 공간 분포를 모니터링하기위한 시험 단백질 - 단백질 상호 작용에서 설정된 일시적 발현 시스템 담배 표피 세포에 생체 분자 형광 상보성 (BiFC) 분석을 확대. 이러한 프로토콜에서는, 상호 작용 및 애기 MAPKKK 요다와 MAPK6 간의 시그널링은 세포막에서 발생한다는 표시하도록 BiFC 분석을 사용 하였다. 골격 단백질 BASL이 공동 발현되면 요다-MAPK 상호 작용 공간적 재분배 CFP-BASL와 공동 편광. 이 변형 담배 발현 시스템은 자국어 동적 변경 (이하 4 일) 및 형광 단백질 색 (적어도 3 개)의 복수를 수용 할 수있는 신호의 신속한 시험을 허용한다. 우리는 또한 단백질 분포 (비대칭 공간 지역화, 또는 "양극화"를 정량화하는 자세한 방법을 제시) 담배 세포입니다. 이 고급 담배 발현 시스템은 살아있는 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트 퀵 테스트 널리 사용될 가능성을 가지고있다.

서론

단백질은 예측할 수없는 셀룰러 환경에서 발생하는 거의 모든 생물학적 과정에서 중추적 인 역할을 복잡한 계층 적 네트워크와 양식 단지 내에서 상호 작용한다. 그러나 성장 반응에 공장 개발에서, 단지 신속뿐만 아니라 효율적으로 세포 내 수준에서 이러한 동적 신호 이벤트를 식별하고 모니터링 할 수 없습니다 편리한 도구의 부족이 있었다.

담배 잎 표피에 과도 단백질 발현 시스템은 살아있는 세포에 형광 단백질을 시각화 장점을 호소하고있다. 이 시스템은 번역 후 단백질 수정 및 단백질 지역화의 빠른 검사를 수 반 생체 조건을 제공합니다. 보완적인 YFP 신호를 조사함으로써, 이분자 형광 상보성 (BiFC) 분석은 식물 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 가능성을 알린다. 다른 방법, 예를 들어, 효모 두 하이브리드 (Y2H)와 공동 비교-immunoprecipitation은 (주-IP), BiFC는 단백질 - 단백질 상호 작용이 세포 내 수준에서 발생할 수있는 구획을 시각화하는 강력한 수단을 제공한다.

비대칭 세포 분열 (ACD)는 조직 / 기관의 형성을위한 새로운 유형의 세포를 생성하는 동안 세포 집단 줄기 유지 때문에 진핵 다세포 촉진하는 필수 불가결 한 장치....

프로토콜

1. 플라스미드 건설

1. 이전 ^{1,6 설명 된대로} 기술을 복제하여 구조를 생성합니다.
   1. 제 BASL의 ​​코딩 서열을 증폭하기 위하여 적절한 프라이머 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하고 YDA MPK6와 입력 벡터에 그들을 서브 클론. ⁷ 상세한 프로토콜을 찾을 수 있습니다.
   2. (각각 DNmpk6 ⁸ DNyda ⁴⁾ MPK6 및 YDA 지배적 음수 버전을 생성하기 위해 주형으로 MPK6 및 YDA의 엔트리 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이 법 ⁹ 점 돌연변이를 도입.
2. pH35CG ^(10)에 BASL를 통합하는 표준 LR (attL X의 ATTR 재조합) 반응 ⁽⁷ 자세한 절차)를 실시, 담배 과도 분석을위한 구조를 구축하기 위해, DNyda 및 pXNGW에 DNmpk6 및 pXCGW은 각각 ¹¹ 벡터.
   1. 효소 분해 및 시퀀싱에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. 일단이야uccessful, 아그로 박테 리움이 변형 GV3101 ¹² 투메 파시 엔스로 진 구조를 변화시키고이 ....

결과

과민 MAPK 신호에 의해 유도되는 세포 사멸을 방지하기 YDA (DNyda) 및 MPK6 (DNmpk6)의 키나아제 비활성 버전 담배 세포에서 공동 발현 분석에 사용 하였다. 어느 BiFC도 CFP-BASL 자체 생성 된 불균일 한 분포 패턴 (그림 3A-B)에 의해 밝혀 DNyda과 DNmpk6 사이의 상호 작용. CFP-BASL가 DNyda-DNmpk6 상호 쌍에 도입 하였다 그러나, CFP와 YFP 신호 모두 높은 편광 방식 (도 3C)에 재분배 하였다. 이 재배포 BASL은 공간적으로 식물 세포에서 MAPK 신호 전달 경로를 다시 구성 할 YDA 및 MPK6와 상호 작용하는 것이 좋습니다. 포스 포 결핍 버전이 약한 활동 ^(6)을 보여 주었다 반면, 매우 강한 극성 생성 BASL의 포스 흉내 버전 : BASL의 인산화 상태는 MAPK 신호의 극성 정도에 차등 영향이 있습니다. 이러.......

토론

일반 사용 및 신호 전달에 대한 담배 과도 식 시스템의 가능한 수정 : 형광 단백질의 과발현 (FP)는 성공적으로 식물 세포에서 단백질의 세포 내 지역화의 빠른 검사를 위해 사용 된 담배 표피에있는 단백질을 -tagged. 그러나, 란타 단백질 복합체의 동적 시그널링 분포를 연구하기 때문에 복잡한 세포 내 컨텍스트 과도 단백질 - 단백질 상호 작용 및 신호 전달 사건 어려운 주제이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 MAPK 신호 이벤트를 검사 할 BiFC 시스템을 이용했다. 공동 발현 YDA-nYFP 및 MPK6-cYFP을 회수하여 YFP 신호는 MAPK 신호 중계의 활성화는 세포막에서 발생할 수있는 것으로 나타났다.

그것은하는 것이 이상적 일 것이다 공동 명시 형광 YDA 및 MPK6는 애기 장대에서 생체 내에서 동적 MAPK 신호를 검사하는 태그. 그러나 GE의형질 전환 식물체를 nerati.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Phusion DNA 중합효소	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트	애질런트 기술	200521
LB 육수	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
겐타마이신	시그마-알드리치	G3632-1G
리팜피신	시그마-알드리치	R3501-1G
카나마이신	시그마-알드리치	K4000-25G
스펙티노마이신	시그마-알드리치	S4014-5G
MgCl<>2	시그마-알드리치	M8266-100G
25 x 75mm 슬라이드	VWR	16004-382
24 x 50 mm 커버 유리	VWR	48393-241
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite 소프트웨어
40X 대물 렌즈	Leica	HCX  APO 계획	HCX  Plan APO, NA 1.30
원심분리기	Thermo Scientific	SORVALL 6+
홀 펀처	스테이플 50ml
팔콘 튜브	Genesee Scientific	21-108
No. 5 집게	Canemco & Marivac	205EQA-사양