방법 논문

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

DOI:

10.3791/53790

⸱

2016년 3월 20일

 , 
1The Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Plant Biology and Pathology, Rutgers, The State University of New Jersey

이 논문에서

요약

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세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

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살아있는 세포의 동적 신호 이벤트의 시각화 도전하고있다. 우리는 식물 세포 내에서 신호 전달의 공간 분포를 모니터링하기위한 시험 단백질 - 단백질 상호 작용에서 설정된 일시적 발현 시스템 담배 표피 세포에 생체 분자 형광 상보성 (BiFC) 분석을 확대. 이러한 프로토콜에서는, 상호 작용 및 애기 MAPKKK 요다와 MAPK6 간의 시그널링은 세포막에서 발생한다는 표시하도록 BiFC 분석을 사용 하였다. 골격 단백질 BASL이 공동 발현되면 요다-MAPK 상호 작용 공간적 재분배 CFP-BASL와 공동 편광. 이 변형 담배 발현 시스템은 자국어 동적 변경 (이하 4 일) 및 형광 단백질 색 (적어도 3 개)의 복수를 수용 할 수있는 신호의 신속한 시험을 허용한다. 우리는 또한 단백질 분포 (비대칭 공간 지역화, 또는 "양극화"를 정량화하는 자세한 방법을 제시) 담배 세포입니다. 이 고급 담배 발현 시스템은 살아있는 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트 퀵 테스트 널리 사용될 가능성을 가지고있다.

서론

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단백질은 예측할 수없는 셀룰러 환경에서 발생하는 거의 모든 생물학적 과정에서 중추적 인 역할을 복잡한 계층 적 네트워크와 양식 단지 내에서 상호 작용한다. 그러나 성장 반응에 공장 개발에서, 단지 신속뿐만 아니라 효율적으로 세포 내 수준에서 이러한 동적 신호 이벤트를 식별하고 모니터링 할 수 없습니다 편리한 도구의 부족이 있었다.

담배 잎 표피에 과도 단백질 발현 시스템은 살아있는 세포에 형광 단백질을 시각화 장점을 호소하고있다. 이 시스템은 번역 후 단백질 수정 및 단백질 지역화의 빠른 검사를 수 반 생체 조건을 제공합니다. 보완적인 YFP 신호를 조사함으로써, 이분자 형광 상보성 (BiFC) 분석은 식물 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 가능성을 알린다. 다른 방법, 예를 들어, 효모 두 하이브리드 (Y2H)와 공동 비교-immunoprecipitation은 (주-IP), BiFC는 단백질 - 단백질 상호 작용이 세포 내 수준에서 발생할 수있는 구획을 시각화하는 강력한 수단을 제공한다.

비대칭 세포 분열 (ACD)는 조직 / 기관의 형성을위한 새로운 유형의 세포를 생성하는 동안 세포 집단 줄기 유지 때문에 진핵 다세포 촉진하는 필수 불가결 한 장치이다. 애기 기공 발전 플랜트에서 ACD 연구를위한 모델 시스템으로 사용되고있다. 전구체 세포 meristemoid 머더 셀은 비대칭 나누고로 분화 할 수있다 (그리고 기공 계통 접지 셀 (SLGC) (가드 셀의 쌍으로 종료하기 전에 셀 형상 분열 줄기 겪게)와, meristemoid 두 가지 딸세포를 생산 제산 포장 셀), 각각 (그림 1). 기공 ACD에서, 기공 리니지에서 비대칭의 신규 단백질 속보 (BASL은)의 inc하는 분할 비대칭를 구동하기 위해 premitotically 편광lude 물리적 비대칭 세포 운명 비대칭 1. MAPKKK 요다와 MAPKs, MPK3 6로 구성된 MAPK 캐스케이드는 기공 분할 패턴과 운명 채택 2, 3, 4, 5에 대한 핵심이다.

최근 장 등. ACD 6 기공 애기 장대에서 YDA-MAPK 신호 전달 경로에 극성 단백질 BASL를 연결. 정규 요다-MAPK 경로는 MPK3 / 6를 통해, BASL을 인산화 및 편광을 활성화합니다. 인산화 BASL 발판으로 기능과 요다 (YDA) 및 MPK3 / 6 모집은 단백질 복합체를 형성하고 세포 피질 (6)의 신호를 집중합니다. MAPK 구성 요소 및 BASL과 YDA-MAPK 경로 사이의 긍정적 인 피드백 루프의 양극화는 식물 세포에서 단백질 편광위한 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 로컬 풍부한 MAPK 신호 밀접 기공 ACD 6 셀 운명의 분화 (그림 1) 연결되도록 가설된다. k 개의 중 하나이 모델을 지원 EY 실험 데이터는 BASL 6의 발현에 의해 유도 MAPKs의 공간 재배포을 보여 담배 분석에서왔다.

MAPK 분자는 종종 셀 내부의 도처 발견 되었기 때문에 MAPK 신호가 발생하는 위치를 일반적으로, 모니터링하는 것은 용이하지 않다. 본 연구에서 우리는 신호 중계 발생 여기서 제안하는 상류와 하류 키나제들 사이의 상호 작용을 시각적으로 분할 YFP 시스템을 이용했다. 우리는 추가로 BiFC 시스템의 사용을 확장 공동 발현 (단백질 - 단백질 상호 작용을 암시) 스플릿 YFP 쌍이 제 단백질 (CFP는 태깅)를 갖추고 YFP 공간적 코에 의해 변조 될 수 있는지 여부를 어떻게 시각화 CFP 단백질을 표현했다. 그렇게함으로써 우리는 담배 epiderm의 셀 피질에서 편광 패턴에 균일하게 분포에서 YDA과 MPK6, 사이의 상호 작용의 공간 재구성을 유도 CFP-BASL의 ​​공동 발현을 보여 주었다알 세포. 이 시스템은 따라서 세포 내부 또는 외부 자극에 의해 도전시 조건 하에서 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트를 모니터링하기 위해 개발 될 가능성이있다 (예를 들면, 다른 단백질, 화학적 응용 병원체 공격 또는 환경 변화 등의 공동 발현. ).

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프로토콜

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1. 플라스미드 건설

  1. 이전 1,6 설명 된대로 기술을 복제하여 구조를 생성합니다.
    1. 제 BASL의 ​​코딩 서열을 증폭하기 위하여 적절한 프라이머 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하고 YDA MPK6와 입력 벡터에 그들을 서브 클론. 7 상세한 프로토콜을 찾을 수 있습니다.
    2. (각각 DNmpk6 8 DNyda 4) MPK6 및 YDA 지배적 음수 버전을 생성하기 위해 주형으로 MPK6 및 YDA의 엔트리 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이 법 9 점 돌연변이를 도입.
  2. pH35CG (10)에 BASL를 통합하는 표준 LR (attL X의 ATTR 재조합) 반응 (7 자세한 절차)를 실시, 담배 과도 분석을위한 구조를 구축하기 위해, DNyda 및 pXNGW에 DNmpk6 및 pXCGW은 각각 11 벡터.
    1. 효소 분해 및 시퀀싱에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. 일단이야uccessful, 아그로 박테 리움이 변형 GV3101 12 투메 파시 엔스로 진 구조를 변화시키고이 28 ° C에서 선택 접시에 그들을 성장 - 삼일.

아그로 박테 리움 침투 솔루션의 2. 준비

  1. 구축 pH35CG, pXNGW 및 pXCGW 100 ㎍ / ㎖의 루리아 - 베르 타니 (LB) 적절한 항생제 배지 10 ml의 몇 가지의 갓 변환 아그로 박테 리움의 식민지를 접종 (겐타 마이신 25 ㎍ / ml의 리파 마이신 25 ㎍ / ml의 스펙 티노 마이신, 같은 농도 P19에 대한 카나마이신 50 μg의 / ㎖와 겐타 마이신과 리파 마이신 (유전자 침묵에 대한 단백질을 표현) 13.
  2. 약 16 시간 동안 200 rpm으로의 속도로 28 °의 C 통에 아그로 박테 리움 문화를 성장 후 (1.5 도달 할 것으로 추정 - 1.8)을 OD (600) 측정 (그림 2A-B)를. 10 분 동안 2,500 XG에 문화를 스핀 다운. 다시 중단하고 워싱턴의 MgCl 2 10 밀리미터 (침투 솔루션)와 세포 펠렛을 쉬.
  3. 다시 배양을 스핀 다운하고, 최종 OD = 0.5 (600) (도 2C-D)에 도달하는 침투 용액의 적당량 펠릿을 다시 일시. 3 시간 - 식물에 침투하기 전에 1 시간 동안 실온에서 세포 혼합물을 떠난다. 이 단계는 세포의 항상성을 유지하는 데 도움이됩니다.

3. 담배 공장 및 리프 주입

  1. 잎 주입 (16 시간 조명 / 8 시간 - 어둠의 사이클 23 ° C) 표준 식물 성장 챔버 5 주령 14-4 성장 담배 식물 (담배 속의 benthamiana)를 사용합니다.
    참고 :이 단계에서 담배 식물은 일반적으로 6 잎 (2 대 2, 중, 2 작은)가 있습니다. 두 개의 중간 크기의 잎은 잎 주입합니다 (두 개의 작은 사람들은 종종 너무 젊은있는 동안 두 개의 큰 것들, 너무 오래)에 대한 최적이다.
  2. 침투 하루 전에 tobac 물을공동 식물은 토양을 포화합니다.
  3. 3 시간 - 침투 날, 1 어둠 속에서 식물을 사전 품어. 이 단계는 잎 표피 세포 내로 관통 할 때 크게 아그로을 용이하게 표피에 기공이 넓게 열 수있다.
  4. , 잎을 날짜로 표시된 색 테이프를 플래그를 사용하는 것은 침투합니다. 마크 영역은 검은 색 두꺼운 샤피 침투한다 (선택하며 침투 지역은 감염 후 볼 수 있습니다.).
  5. 아그로 박테 리움 재 현탁액의 동일한 볼륨을 가지고 부드러운 소용돌이 (그림 2E)에 의해 100 × 15mm 페트리 접시에서 그들을 섞는다. 주 : 우리의 경우에는 CFP-BASL 1 ㎖, 1-DNyda nYFP ml의 DNmpk-cYFP 1 ㎖와 P19 1 ㎖를 혼합 하였다.
  6. 침투하는 과정에서, 침투 혼합물은 3 ㎖의 무 바늘 주사기를 충전 (1-2 ㎖) 및 담배 잎 (도 2F)의 바닥면 (축외)로 누른다. 침투 있지만, 그것은 도움이됩니다푸시 한 손을 사용하고, 다른 한편으로 부드럽게 (가압력 대해 향축) 상부 측을 지원한다.
    주 : 침투 혼합물을 성공적으로 주입되면, 감염된 지역 표피에서 쉽게 인식 될 것이다. 그러나, 침투로 인해 거친 주입 (조직 손상) 또는 불충분 한 푸시 (액체가 침투)에 실패 할 수 있습니다. 각 테스트를 위해, 우리는 (다른 식물에서) 두 개의 독립적 인 잎에 두 개 이상의 주사를 제안한다.
  7. 다시 성장 챔버에 감염된 식물을 배치합니다. 일반적으로 단백질 표현은 48 시간 다음 침투 후 검출된다.

4. 공 촛점 이미징

  1. (- 4 디스크 / 영역이 생성 될 수 일반적으로 3) (그림 2G) 48 시간 포스트 침투에서 주입 된 지역에서 잎 디스크를 절제하는 홀 펀칭기를 사용합니다. 부드럽게 물 방울을 슬라이드 (위쪽 배축 측)에 잎 디스크를 전송하고 마운트 핀셋을 사용합니다. 너무하겠다 눌러 피커버 슬립에 d를 압착 / 손상된 세포는 공 초점 현미경 (그림 2H)에서 잘 표시되지 않습니다 때문이다.
  2. 촛점 촬상 전에, 발현 수준을 확인하기 위해 에피 형광 화합물 현미경에 장착 된 시료를 검사한다. 참고 : 우리의 경험에 기초하여, 중간 발현 표시 셀 가장 공 초점 현미경으로 표현된다.
  3. 공 초점 현미경에 40X (NA 1.3) 렌즈로 시작합니다. 형광 단백질의 중간 레벨을 발현하는 세포를 중심으로 유지되도록 슬라이드를 원하는 위치로 조정한다. CFP와 YFP의 여기 / 발광 스펙트럼은 458 nm의 /이다 480-500 nm의 514 나노 미터 / 520 - 각각 540 nm의,.
  4. 이미지가 다음 가장 균형 잡힌 형광 강도 / 노이즈 비율에 대한 레이저 강도 및 스마트 게인을 조정 미리 볼 수있는 "라이브"버튼을 활성화합니다. 이미징 품질을 향상 주사 픽셀 및 / 또는 프레임 / 라인 평균 증가한다. 마지막으로, 정말이에요에 초점 노브를 조정채널 중간 초점면과 이미지를 데리고 "캡처"를 클릭합니다.
    참고 : CFP와 YFP 이미지 또는 각각 "순차적"스캔 모드의 옵션을 해제 확인하여 순차적으로 또는 동시에 캡처 할 수 있습니다.
  5. Z-돌기 세포의 심층보기를 원할 때, 주사 범위의 깊이를 정의하고, "XYZ"촬상 모드를 선택 (10-15 μm의)과 타겟 셀의 상단과 하단까지의 이미지를 수집 할 . 선택 .TIFF 파일로 "이름 바꾸기"수출 이미지에 이미지 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 라이카 소프트웨어를 사용하여 얻은 이미지를 컴파일합니다.
  6. 이미지 30 - 정량 분석​​을위한 40 세포.

5. 이미지 처리 및 정량 분석

  1. 이미지를 처리​​하고 정량을 실시 피지 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용합니다.
    1. 형광 강도의 그래프를 플롯.
      1. 더 CFP / YFP 표현인지 여부를 시각화하는 방법균일 분포, 셀 주변을 따라 CFP 및 YFP의 신호 강도를 보여 피지를 사용한다. 이를 위해 먼저 피지는 다음 이미지를 시작하려면 "파일"및 "열기"를 선택하여 실행합니다. 도구 메뉴에서 "라인"을 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 해 "분단 라인"을 선택합니다. 관심 영역을 결정하고, CFP 또는 YFP 신호 (그림 3A-C)를 추적하는 셀 주변을 따라 선을 그립니다.
        주 : 피지가 분할 선을 따라 절대 형광 강도 값을 측정한다.
      2. 분할 선을 따라 CFP / YFP의 수준을 나타내는 위치와 강도 값으로 그래프를 생성하는 드롭 다운 메뉴 "분석"과 "플롯 프로필"을 선택합니다. 원하는 경우, 유사한 강도 그래프를 생성하는 엑셀이나 다른 그래픽 소프트웨어에 (메뉴 "복사"를 선택하여) 강도 값을 중복.
    2. 극성의 정도를 정량화.
      1. 약 20 represen를 수집3 복제 실험에서 tative 세포는 담배 세포에서 CFP와 YFP의 극성의 정도를 평가합니다. (L로서 정의) 낮은 형광 강도 이상 (H로 정의)이 높은 형광 강도의 비에 기초하여 극성도를 계산한다. 주 : 정량 방법은도 3에 설명한다.
        1. 가 H와 L 값을 측정하기 위해, "측정"을 드롭 다운 메뉴에서 "분석"을 선택한 후, 선택, 클릭 (전술) 셀 주변의 관심 영역에 따라 분할 선을 그립니다. 는 "결과"창이 뜨면, 사용 정량을 수행하기 위해 값을 "평균".
        2. 예를 들어, CFP와 YFP의 비교적 균일 한 표현을 표시하는 세포에서, CFP-BASL (그림 3A) 또는 YFP는 측정하여 H와 L의 값을 구 DNyda-nYFP 및 DNmpk6-cYFP (그림 3B)의 공동 발현에서 보완 이 무작위로 동일한 길이로 주변 세그먼트를 선택했습니다.
          3. <리>이 경우, 형광 단백질의 명확한 극성 축적을 나타내는 세포로부터, CFP-BASL, DNyda-nYFP 및 DNmpk6-cYFP (도 3c)의 공동 발현은 농축 된 형광 신호와 상기 주변 영역에서 H 값을 수집 저 / 아니오 형광 축적 지역에서 LS.
        3. 정규 분포에 대한 (20) 함께 세포 시험에서 H / L의 결과 비율 수영장. (정규 분포의 경우) 학생 t 테스트에 의해 P 값 또는 (비 정규 분포의 경우) 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 (KS) 테스트를 계산합니다.

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결과

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과민 MAPK 신호에 의해 유도되는 세포 사멸을 방지하기 YDA (DNyda) 및 MPK6 (DNmpk6)의 키나아제 비활성 버전 담배 세포에서 공동 발현 분석에 사용 하였다. 어느 BiFC도 CFP-BASL 자체 생성 된 불균일 한 분포 패턴 (그림 3A-B)에 의해 밝혀 DNyda과 DNmpk6 사이의 상호 작용. CFP-BASL가 DNyda-DNmpk6 상호 쌍에 도입 하였다 그러나, CFP와 YFP 신호 모두 높은 편광 방식 (도 3C)에 재분배 하였다. 이 재배포 BASL은 공간적으로 식물 세포에서 MAPK 신호 전달 경로를 다시 구성 할 YDA 및 MPK6와 상호 작용하는 것이 좋습니다. 포스 포 결핍 버전이 약한 활동 (6)을 보여 주었다 반면, 매우 강한 극성 생성 BASL의 포스 흉내 버전 : BASL의 인산화 상태는 MAPK 신호의 극성 정도에 차등 영향이 있습니다. 이러...

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토론

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일반 사용 및 신호 전달에 대한 담배 과도 식 시스템의 가능한 수정 : 형광 단백질의 과발현 (FP)는 성공적으로 식물 세포에서 단백질의 세포 내 지역화의 빠른 검사를 위해 사용 된 담배 표피에있는 단백질을 -tagged. 그러나, 란타 단백질 복합체의 동적 시그널링 분포를 연구하기 때문에 복잡한 세포 내 컨텍스트 과도 단백질 - 단백질 상호 작용 및 신호 전달 사건 어려운 주제이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 MAPK 신호 이벤트를 검사 할 BiFC 시스템을 이용했다. 공동 발현 YDA-nYFP 및 MPK6-cYFP을 회수하여 YFP 신호는 MAPK 신호 중계의 활성화는 세포막에서 발생할 수있는 것으로 나타났다.

그것은하는 것이 이상적 일 것이다 공동 명시 형광 YDA 및 MPK6는 애기 장대에서 생체 내에서 동적 MAPK 신호를 검사하는 태그. 그러나 GE의형질 전환 식물체를 nerati...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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원고 교정에 응해주신 Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University)님께 감사드립니다. BASL 극성 형성에 대한 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)가 J.D.(R01GM109080) 및 럿거스 대학(Rutgers University)에 수여하는 보조금의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Phusion DNA 중합효소New England BiolabsM0530S
pENTR/D/TOPOLife TechnologiesK2400-20
QuickChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트애질런트 기술200521
LB 육수AMRESCOJ106-2KG
Bacto AgarAMRESCOJ673-1KG
겐타마이신시그마-알드리치G3632-1G
리팜피신시그마-알드리치R3501-1G
카나마이신시그마-알드리치K4000-25G
스펙티노마이신시그마-알드리치S4014-5G
MgCl<>2시그마-알드리치M8266-100G
25 x 75mm 슬라이드VWR16004-382
24 x 50 mm 커버 유리VWR48393-241
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Leica TCS SP5 IILAS AF Lite 소프트웨어
40X 대물 렌즈LeicaHCX  APO 계획 HCX  Plan APO, NA 1.30
원심분리기Thermo ScientificSORVALL 6+
홀 펀처스테이플 50ml
팔콘 튜브Genesee Scientific21-108
No. 5 집게Canemco & Marivac205EQA-사양

참고문헌

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  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

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