방법 논문

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

DOI:

10.3791/53797

⸱

2016년 3월 5일

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, 2Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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1차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 일반적으로 신경 영양 인자를 공급하고 수명을 유지하기 위해 신경교 공급층을 필요로 합니다. 여기에서는 고밀도 뉴런 공급층(neuronal feeder layer)이 있는 곳에서 유리 커버슬립에서 초저밀도 뉴런을 배양하는 단순화된 방법을 설명하며, 이는 특정 뉴런 자율 메커니즘의 연구를 용이하게 합니다.

초록

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체외에서 차 해마 신경 세포를 배양하는 것은 신경 발달의 여러 측면의 기계적인 심문을 용이하게한다. 해리 배아 해마 신경 세포는 종종 혈청이없는 조건 하에서 고밀도로 커버 글라스에 성공적으로 성장할 수 있지만, 저밀도 문화는 일반적으로 영양 요소의 공급이 필요 시간이 소요될 수 있습니다 제조는 아교 세포 영양 세포층, 그들을 공동 배양 힘드는. 또한, 신경교의 존재는 신경 특정 메커니즘에 결과 및 해석을 배제 연구를 혼동 할 수있다. 여기서, 단순화 된 방법은 무 혈청 조건에서 아교 세포의 지원없이 매우 낮은 밀도 (~ 2,000 뉴런 / cm 2), 장기 (> 3 개월) 주 해마 신경 세포 배양에 표시됩니다. 저밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 커버 슬립 상에 성장하고, 24 웰 플레이트에서 성장 고밀도 뉴런에 대칭된다. 대신 betwee 공간을 만들기 위해 파라핀 도트를 사용N 개의 뉴런 층은, 실험자는 단순히 저밀도 신경 세포의 성장에 도움이되는 미소 공간을 만들기 위해, 고밀도 뉴런 상주하는 웰의 플라스틱 하부를 식각 할 수있다. 공동 배양을 용이하게, 따라서 이러한 뉴런의 형태 학적 및 생리 학적 연구를 촉진 저밀도 뉴런의 상당한 손실없이> 3개월 유지할 수있다. 이 성공적으로 배양 조건을 설명하기 위해 데이터를 장기간 배양 후 저밀도 세포에서 넘치 시냅스 형성을 보여주기 위해 제공됩니다. 본 공 배양 시스템은, 폴리 D 라이신 기재 따라서 autaptic 연결 형성 제도 성장 희소 개별 뉴런의 생존을 촉진한다.

서론

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시험관 조건에서 해마 신경 세포 성장하는 것은 관찰과 생체 내에서, 그렇지 않으면 가능하지 않습니다 이러한 뉴런의 실험 조작을 할 수 있습니다. 이 실험 방법은 널리 성장, 극성 신경 돌기 사양, 인신 매매와 단백질의 세포 내 현지화, 시냅스 형성과 기능 성숙 하나의 신경 메커니즘을 나타 내기 위해 사용된다. 늦은 배아 단계에서 수확 때 이러한 체외 배양 된 해마 신경 세포는 피라미드 형태 2의 (> 90 %) 글루타메이트 세포 비교적 순수한 있습니다. 신경 세포는 생체 외 조건에서 2-D 표면에서 성장 되었기 때문에,이 방법은 하나의 초점면 (3)을 통해 라이브 영상 염색 또는 면역 세포 화학 (ICC)와 같은 쉽게 관찰을 허용한다; 이러한 약물 치료 및 형질 3-6이나 조작. 고밀도로 성장하면 신경 세포 때문에 더 높은 공동의 생존의 높은 비율을 갖는 경향이성장 배지에서, 또한 돌기 때문에 접촉 의존적기구 (7)의 영양 지원 외에 분비 된 성장 인자의 ncentrations. 그러나, 저밀도 해마 뉴런 개별 뉴런은 그 전체에 이미징 또는 ICC 분석 물들 수 학적 연구를하는 것이 바람직하다. 저밀도 뉴런 인해 분비 지원의 부족....

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프로토콜

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마우스와 관련된 모든 실험 절차는 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 그리고 NIH 가이드 라인을 따른다되었다.

해마 신경 세포 문화 1. 조직 소스

  1. 해마 신경 세포 배양 태아 마우스 새끼를 생성하려면 집 (17)에서 사육되는 시간 임신 마우스 (C57BL6 / J)를 사용합니다. 질 플러그 감지와 날 E0.5로 지정됩니다. 문화에 대한 계획 수확 시간은 E16.5-E17.5이다.
    주 :이 프로토콜은 저밀도 뉴런와 공동 배양 개의 고밀도 뉴런의 24 개의 웰 플레이트의 배양 설명 (커버 슬립 (48) 전체). 더 플레이트, 재료 및 시약에 대한 대응 확장 할 수 있습니다.

고밀도 신경 문화 2. 24 웰 플레이트 준비

참고 : 배아의 계획 수확하기 전에 다음 단계 (2 ~ 3에게) 일을 수행합니다.

  1. 두 개의 24도를 가져와세포 배양 후드로 플레이트는 개별 포장을 연다.
  2. 1 ml의 플라스틱 일회용 주사기로 18 G 주사기 바늘을 연결합니다.
  3. 주사기를 잡고 웰의 바닥의 중앙 왼쪽 ~ 1mm의 바늘 끝을 ....

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결과

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여기에 설명 된 프로토콜은 급전 층으로서 신경교 세​​포 없이도 성공적인 초 저밀도 순수한 글루타메이트 성 신경 세포의 장기간 배양 할 수있다. 프로토콜은 수 단품 (폴리 D 라이신 코팅 된 커버 글라스에) (24 웰 코팅 폴리 D 라이신)에 고밀도의 제조 저밀도 뉴런을 포함한다도 1에 도식화하고 후속 공동 문화 3 개월까지 유지 될 수있다.

도 2a 및도 2b는 도금 후 5 일에 고밀도 및 저밀도 뉴런의 도면이다. 저밀도 문화는 밀도의 약 30 배 이하이다. Kaech와 뱅커 (2006)에 의해 설명 된대로 두 신경 세포는 전형적인 발달 단계를 겪는다. DIC 이미지 (도 2C에 의해 계시 14 일째에, 고밀도 및 저밀도 뉴런 모두 정교한.......

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토론

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우리는 무 혈청 조건에서 매우 낮은 밀도 해마 글루타메이트 신경 세포의 장기 문화에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 뉴런 ~ 2,000 / cm 2, 밀도 또는 기존 문헌에서보고 2,3,11,13,14 신경교 지원없이 대부분 '저밀도'배양 제제보다 적어도 두 배 더 낮다에서. 초 저밀도 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 소설과 두 개 더 가지 방법으로 중요하다. 저밀도 뉴런 가까운 물리적 근접도 내에 고밀도 뉴런 영양 인자 지원을받는 첫째, 더 신경교 세​​포층 더 시냅스 연결하거나 상이한 밀도에서 배양 한 신경 세포 간의 직접적인 접촉이 없더라도 필요하지 않다. 이 프로토콜은 미리 계획된 배양 실험 아교 세포 단층을 준비하기위한 필요성을 제거하고, 고밀도 및 저밀도의 배양이 동시에 증가 할 수있다. 아교 세포 단층의 제조 시간과 L 일 수있다aborious, 대부분의 문헌은 신생아 쥐 강아지 피질 (2)를 사용합니다. 따라서, 단지 마우스로 작업 실험실, .......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 S.Q.에 대한 NIH/NIMH 보조금의 지원을 받았습니다(R00MH087628).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Neurobasal 매체Life Technologies21103-049빛으로부터 보호
B27 보충제Life Technologies17504-044분주액, 0.6ml 크기에 보관
GlutaMAX-ILife Technologies35050-061희석 100X 
항생제-항진균제 (AA)Life Technologies15240-096희석 100X 
완전한 배양 배지1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash 매체'Neurobasal 배지'와 동일
공급 매체Neurobasal 1X B27 보충제
DNAse ISigma-AldrichD5025MW에서 100X 재고 준비
70000-150000
붕산염 완충액Sigma-AldrichB6768 (붕산); 71997 (붕사)1.24g 붕산 및 1.9g 붕사 400ml H2O, pH 8.5 HCl
12mm 원형 유리 커버 슬립Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH1001/12No. 1 유리, Carolina Biological Supply
proFection transfection kitPromegaE1200자세한
내용은 프로토콜 참조2X HEPES 완충 식염수 (HBS)PromegaE1200세부 사항 프로토콜 참조
주사기 필터Pall Corporation41920.2um 기공 크기
Endofree 플라스미드 준비 키트Qiagen12362transfection 등급 플라스미드 DNA
anti-MAP2 항체MilliporeMAB3418마우스 항체, 클론 AP20
anti-p-Tau 항체MilliporeAB10417토끼 다클론 항체
항-NR1 항체MilliporeMAB1586마우스 항체, 클론 R1JHL
항-GluR1 항체MilliporeAB1504토끼 다클론 항체
Hank's balanced salt solutionThermoFisher14025092500ml 크기
0.6mg/ml poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 사용 에서 구매

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G.

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재인쇄 및 허가

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태그

Primary Hippocampal Neuron CultureUltra Low Density NeuronsPoly D Lysine CoatingGlial Feeder LayerNeuronal Co CultureSynapse Formation AnalysisImmunocytochemistry LabelingAutaptic Neuron FormationLong Term Neuron CultureEmbryonic Hippocampal Dissection

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