여기에서는 운명 지도와 계통 추적자를 사용하여 Xenopus laevis 배아의 신장을 생성하는 개별 할구에 주입하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제노 laevis의 (개구리)에 pronephros의 배아 신장은 하나의 네프론 구성 및 신장 질환에 대한 모델로서 사용될 수있다. 제노 배아 외부 개발 크고, 쉽게 미세 주입 또는 외과 수술에 의해 조작 될 수있다. 또한, 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립되었습니다. 결국 기관 또는 조직의 관심을 야기한다 개별 할구로 타겟 마이크로 인젝션 선택적 배아의 나머지의 차 효과를 감소 또는 과발현이 제한된 영역 내에서 유전자 발현을 녹아웃하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 4 - 8 세포 배아의 특정 할구에 미세 주입을 통해 개발 Xenopus의 신장합니다 (pronephros)를 대상으로 설립 Xenopus의 운명 맵을 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 계보 추적자의 주입은 주입의 구체적인 타겟팅의 확인을 할 수 있습니다.배아 38 무대 개발 후 - 40 전체 마운트 면역 염색을 pronephric 개발 시각화 사용되고 pronephros 타겟팅 세포에 의한 기여가 평가 될 수있다. 동일한 기술은 pronephros 외에 다른 조직 유형을 표적으로하도록 할 수있다.
서론
Xenopus의 배아 신장의 pronephros은 신장 개발 및 질병 연구를위한 좋은 모델입니다. 배아 외부 개발 크기가 크며, 대량으로 제조 할 수 있고, 용이하게 미세 주사 또는 수술을 통해 조작된다. 또한, 포유류와 양서류의 신장 발달을 지배하는 유전자가 보존되어있다. 배아 양서류가 pronephros이 성인 양서류가 metanephros을하면서 pronephros, mesonephros 및 metanephros 1 : 포유류의 신장은 세 단계를 통해 진행. 이러한 신장 형태의 기본 필터링 유닛 네프론이며, 포유류 양서류 모두 nephrogenesis (2, 3)를 거쳐 동일한 시그널링 캐스케이드 및 유도 이벤트를 요구한다. 아프리카 발톱 개구리 pronephros는 근위, 중간의 선단과 세관의 접속 이루어지는 단일 네프론 포함 및 (포유 동물 사구체와 유사)는 사구 1, 4-6 (그림 1 ). Xenopus의의 pronephros에서 하나의 큰 네프론 존재는 신장 개발 및 질병 과정에 관여하는 유전자의 연구에 대한 간단한 모델로 적합합니다.
세포 운명의지도는 초기 Xenopus....
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프로토콜
(: HSC-AWC-13-135 프로토콜 #) 다음 프로토콜은 기관 관리 및 사용위원회의 역할을 실험 동물 의학 동물 복지위원회, 휴스턴의 센터에서 텍사스 건강 과학 센터의 대학에 의해 승인되었습니다.
신장 타겟 주사에 대한 Blastomeres을 1. 식별 및 선택
- 배아를 생성하기 전에, 배아의 초기 세포 분열의 배향을 이해 Xenopus의 개발 (21)의 정상 표를 사용한다. 또한, Xenbase 11 Xenopus의 초기 발달 단계의 액세스도.
- 마이크로 인젝션 대상이 될 할구 선택 Xenbase (11)의 상호 작용 Xenopus의 세포 운명의지도에 액세스 할 수 있습니다.
- 단세포 배아가 어둡게 착색 된 동물 극과 흰색과 노른자위의 인 식물 극을 가지고 있음을 관찰한다. 참고 난황 전자로 알려진 보호막,nvelope, 배아를 다루고 있습니다.
- 제 절단은 전형적으로 배아의 왼쪽과 오른쪽 사이에서 발생하는 것을 알 수 있습니다. 이러한 세포는 pronephric 리니지 동등 기여한다.
- 두 번째 분열은 4 셀 배아로 이어지는, 지느러미 및 배아의 복부 절반을 분할합니다. 지느러미 ....
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결과
MEM-RFP의 mRNA와 4- 및 8 셀 Xenopus의 배아의 Microinjections는 pronephros을 대상으로 서로 다른 수준을 보여줍니다.도 4 단계 올바른 MEM-RFP mRNA 발현 패턴 (40) 배아 그림. 배아는 왼쪽 복부 할구 (그림 4A)에 주입하고, MEM-RFP의 mRNA의 적절한 발현 패턴 분류 하였다. 중간 근위 말단에서 MEM-RFP를 발현하고, 신장 세관의 접속뿐만 아니라, 적절하게 주입 배아 머리, 몸통 및 꼬리 표피에서 형광을 표시 할 것으로 기대된다. 그들은 또한 otocyst에 형광, 시멘트 선, proctodeum 및 somites (그림 4C)를 표시해야합니다. 8 적절히 주입 배아 신장 MEM-RFP 형광의 분포 형광 실체 현미경 (도 4b)로 측정 하.......
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토론
Xenopus의 배아를 개발하는 pronephros을 타겟팅 확인하고 올바른 할구 주입에 의존합니다. 8 셀 배아의 V2의 할구의 주입 왼쪽 pronephros (18)을 목표로하고있다. 이 내부 통제와 반대편 오른쪽 pronephros을 떠난다. 모르가 녹다운 또는 RNA 과발현이 신장 개발을 변경하는 데 사용되는 경우, 반대측 pronephros 오른쪽 왼쪽 pronephros에 유전자 녹다운 또는 과발현의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 이 경우, 이러한 불일치 제어 모르 지배적 네거티브 RNA 구조체와 같은 적절한 제어 유전자 발현의 변화의 결과를 분석하는 반대쪽 내부 제어에 부가하여 사용해야한다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 신장 결함 쉽게 여러 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 예를 들어, 유전자 녹다운 또는 과발현은 단순히 배아 pronephric 인덱스를 산출함으로써 정량 할 수있다배아의 분사 제어 측면에서 근위 세뇨관의 개발을 비교 항체.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 텍사스 맥거번 의과 대학 소아과에서 건강 NIDDK 부여 (K01DK092320) 및 시작 기금의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 칼륨 염화 | Fisher | P217-500 | |
| 마그네슘 황산염 | Fisher | M63-500 | |
| 염화칼슘 | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| 겐타마이신 용액, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100mm x 15mm 페트리 접시 | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel 260009 | 배아용 벤치탑 인큐베이터. | |
| Gap43-RFP 플라스미드 | 추적자 RNA 제조용. 참조: Davidson et al., 2006. | ||
| 로다 민 덱스트란, 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | 트레이서. |
| 분자 생물학 등급, USP 멸균 정제 | Corning | 46-000-CI | |
| 7" 드러먼드 교체 튜브 | 드러먼드 | 3-000-203-G/XL | 마이크로 주입 바늘. |
| 바늘 풀러 | Sutter Instruments | P-30 | |
| 미세 집게 | Dumont | 11252-30 | 미세 주입 바늘 팁을 파괴하기 위해. |
| Nanoject II | 드러먼드 | 3-000-204 | 마이크로인젝터. |
| 미네랄 오일, 바늘 용 무거운 | 피셔 | CAS 8042-47-5 | 오일. |
| 27 G Monoject 피하 주사 바늘 | Covidien | 8881200508 | microinjection 바늘로 광유 적재를 위해. |
| 5ml Luer-Lok 주사기 | BD | 309646 | 마이크로 주입 바늘에 미네랄 오일을 적재합니다. |
| 60mm x 15mm 페트리 접시 | Fisher | FB0875713A | |
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| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
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| 15 mm x 45 mm 나사산 바이알 | Fisher | 03-339-25B | 배아 고정, 염색 및 보관용. |
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| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| 에탄올 | Fisher | BP2818-4 | |
| 메탄올 | Fisher | A412-4 | |
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| 단클론 4A6 항체 | European Xenopus Resource Centre | 중간, 원위 및 연결 세뇨관을 라벨링하는 1차 항체. | |
| anti-RFP pAb, 정제된 IgG/rabbit | MBL | PM005 | Gap43-RFP 추적자를 표지하는 1차 항체. |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG | Life Technologies | A11001 | 신장 세뇨관 라벨링에 대한 2차 항체. |
| Alexa Fluor 555 염소 항토끼 IgG | Life Technologies | A21428 | Gap43-RFP 추적자 표지 2차 항체. |
| 9 캐비티 스폿 플레이트 | Corning | 7220-85 | |
| 벤질 벤조 에이 | 피셔 | 105862500 | 옵션 - 배아 제거 용 |
| 벤질 알코올 | Fisher | A396-500 | 옵션 - 배아 제거 용 |
참고문헌
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W.
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재인쇄 및 허가
