분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

요약

우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

초록

핵분열 효모 Schizosaccharomyces pombe는 유사분열 세포주기 진행의 조절, 세포 분열의 역학 및 세포 극성을 연구하는 데 매우 유용한 모델 시스템이었습니다. 더욱이, 유성 생식에 대한 고전적 실험은 DNA 재조합과 감수분열에 대한 현재의 이해에 중추적인 결과를 산출했습니다. 핵분열 효모 짝짓기에 대한 보다 최근의 분석은 외인성 자극 반응 메커니즘, 편광 세포 성장 및 세포-세포 융합에 대한 흥미로운 질문을 제기했습니다. 이러한 주제를 자세히 연구하기 위해 우리는 전체 성적 수명 주기의 현미경을 위한 간단한 프로토콜을 개발했습니다. 여기에 설명된 방법은 특정 결합 단계를 연구하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 간단히 말해서, 질소가 풍부한 배지에서 기하급수적 단계로 성장한 후, 세포 배양은 탐구될 성적 수명 주기의 단계에 적합한 기간 동안 질소가 결핍된 배지로 이동합니다. 그런 다음 세포는 이미징을 위해 쉽게 제작할 수 있는 맞춤형 아가로스 패드 챔버에 장착됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 짝짓기 시작부터 포자의 최종 형성까지 세포를 모니터링할 수 있습니다.

서론

두 셀 간의 유전자 교환 유성 생식의 중앙 이​​벤트이지만, 그것은 세포 분화를 촉진 파트너의 선택을 허용, 세포 - 세포 융합을 수행하고 유전체의 안정성을 유지하는 일련의 사건에 의존한다. 따라서 성적 기간이 발달 스위치 관련 생물학적 질문들을 연구하는 모델 시스템 자체를 제시 분열 효모 이러한 현상을 연구 성적 사이클 탐색 등의 외적 자극 세포막 융합, 염색체 분리에 반응의 이점을 가져온다 모델 시스템의 강력한 유전학, 높은 처리량 방법과 정교한 현미경을 잘 설립. 분열 효모에서 섹스는 P-셀과 별개의 결합 유형의 M 세포 사이의 이형 이벤트입니다. 두 세포 유형은 차동 분비 P- 생산 및 M-페로몬, 페로몬 수용체 map3 체크하고 Mam2뿐만 아니라 페로몬 테아위한 포함한 유전자 ^1,2-들을 표현할SES Sxa1 및 Sxa2. 이러한 일반적으로 사용 H90 균주로서 Homothallic 균주, 단일 게놈 모두 결합 타입 유전 정보를 전달 및 세포 (참조. ^3에서 검토) 분열주기에 걸쳐 결합 형 스위칭 복잡한 패턴을 겪는다. 거의 또는 전혀 결합 유형을 전환하지 heterothallic 분열 효모의 여러 균주는 일반적으로 가장 눈에 띄게, H ^{+ N} (P 형) 및....

프로토콜

분열 효모 유성 생식의 현미경 분석

1. 미디어 준비

1. 포도당 : 10g의 /의 L, KH ₂ PO ₄ : 1g / L, 염화나트륨 : 다음과 같은 구성 요소가 혼합하여 최소 포자 형성 배지 (MSL-N) ^(15)을 준비 0.1 g / L, _황산 ·을 7H ₂ O : 0.2 g / 엘. 추가 추적 요소 (10000) : 100 μL / L, 비타민 (1000 배) : 1 ㎖ / L, 0.1 M _CaCl2를   ㎖ / L. 실온 (RT)에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균.
   1. 다음과 같은 비타민을 사용 (1000 배) 재고 : 판토텐산 : 1 그램 /의 L, 니코틴산 : 10g / L, 이노시톨 : 10g / L, 비오틴 : 10 ㎎ / ℓ. 4 ℃에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균.
   2. 붕소 산 : : 5g / L, MnSO ₄ : ₄ 그램 /의 L, ZnSO ₄ · 7H ₂ O : 4g / L, 50ml을 ₂ · 6H _2....

결과

질소 소스를 제거하면 분열 효모의 성장과 결합 역학
질소 기아는 분열 효모에서 유성 생식의 시작을위한 전제 조건이기 때문에, 야생형 homothallic H90 균주는 그림 1에 설명 된 프로토콜에 따라 질소가 풍부한 질소 박탈 매체 (그림 2)에서 변화에 따라 측정 하였다. 요약하면, 세포를 , MSL + N 매체에 지수 상 (OD = 0.5 _(600))에 O / N 성장 수집, 세척 및 최종 OD ₆₀₀ = 1.5 MSL-N 액체 배지에 재현 탁 하였다. 세포의 각 2 시간 씩 스테인드 CALCOFLUOR 및 (- D 그림 2A)을 이미지화했다.

CALCOFLUOR 염색.......

토론

환경 조건, 영양 가용성은 특히 강하게 분열 효모의 생리에 영향을 미칩니다. 질소 기아는 유성 생식에 헌신 필요하고 초기에 유사 분열 세포주기 진행에 눈에 띄는 변화 (참조. ²¹ 및 그림 2)에 연결됩니다. 기하 급수적으로 증가하는 인구에서 질소 제거 후, 부문 셀 크기가 빠르게 (도 2C) 감소하고 세포의 대부분은 새로 태어난 기하 급수적으로 성장 세포 (참조. ^21,도 2D)의 길이보다 짧은 유사 분열 진행을 저지. 반대 짝짓기 종류의 세포가 유사 분열 진행을 체포으로 그들은 파트너 짝짓기 참여하고 접합체 및 sporulate (그림 2B, 2E, 2F)를 형성하기 위해 진행합니다. H90 세포를 60 % 이상의 야생형 세포의 2 차원 단층의 경우, 세포 융합 (도 2G를 받게 될 것이다 거의 모든 파트너와 결합하며 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포도	시그마-알드리치	G8270-10KG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	시그마-알드리치	71381
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
판토텐산	AppliChem	A2088,0025
니코틴산	AppliChem	A0963,0100
Inositol	AppliChem	A1716,0100
비오틴	AppliChem	A0967,0250
붕산	시그마-알드리치	B6768-1KG
MnSO4	AppliChem	A1038,0250
ZnSO4• 7H2O	시그마-알드리치	Z4750
FeCl2• 6H2O	AppliChem	A3514,0250
몰리브덴 옥사이드(VI) (MoO3)	Sigma-Aldrich	69850
KI	AppliChem	A3872,0100
CuSO4• 5H2O	AppliChem	A1034,0500
구연산	AppliChem	A2344,0500
아가로스	프로메가	V3125
(NH4)2SO4	Merck	1.01217.1000
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-100G
아데닌 헤미술파트 솔트, 미니 99%	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Uracil	시그마-알드리치	U0750
라놀린	시그마-알드리치	L7387
바셀린	리액톨랩	92045-74-4
파라핀	리액톨랩	7005600

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