Method Article

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

DOI:

10.3791/53819

⸱

April 10th, 2016

 ,  , 
1Department of Advanced Technology, The MITRE Corporation, 2Center for Biomedical Engineering, Brown University, 3The MITRE Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

Abstract

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새로운 항균 단백질의 잠재적 생산자에 대한 대규모 미생물 라이브러리의 초기 평가에는 더 많은 연구 노력과 자원을 투자하기 전에 표적 효소를 스크리닝하기 위한 정성적 및 정량적 방법이 모두 필요합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 초기 평가를 수행하기 위한 두 가지 상호 보완적인 분석을 입증하는 것입니다. 마이크로슬라이드 확산 분석은 초기 또는 간단한 검출 스크린을 제공하여 생존 가능하고 열에 의해 파괴된 박테리아 표적 기질 배열에 대한 단백질 분해 활성을 정성적이고 신속하게 평가할 수 있습니다. 이에 대응하여, 염료 방출 분석법의 향상된 감도와 재현성은 단백질 항균제의 가수분해 활성에 영향을 미치는 환경적 영향을 평가하고 비교하기 위한 정량적 플랫폼을 제공합니다. Remazol brilliant blue R dye로 특정 열 사멸 세포 배양 기질을 라벨링할 수 있는 기능은 관심 있는 효소 활성을 특성화하기 위해 염료 방출 분석을 맞춤화할 수 있도록 이 기능을 확장합니다.

Introduction

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항균제는 바이러스, 곰팡이 및 박테리아와 같은 광범위한 미생물을 표적으로 하는 데 필수적인 역할을 합니다. 다양한 박테리아에 의해 생성되는 항균 활성은 임상적으로 관련된 박테리아 병원체를 포함하여 광범위한 스펙트럼에서 종 특이적에 이르기까지 표적 특이도가 다양합니다 1. 자연에서 박테리오신 및 리신과 같은 단백질 항균 화합물은 자기 방어, 복제 및 영양소 획득을 위한 미생물 무기고를 나타냅니다 2,3. 미생물 군집 내에서 개체군 역학의 매개체 역할을 하는 단백질 항생제는 생산하지 않는 민감한 종에 비해 생산 유기체에 경쟁 우위를 제공합니다 4. 재조합 효소 및 프로바이오틱스로서 이러한 단백질은 박테리아 집단 내에서 항생제 내성이 새롭게 확장될 때마다 새로운 병원체 제어 소스에 대한 필요성이 증가함에 따라 경제적, 사회적으로도 중요합니다 5.

새로 발견된 단백질 항균제에 대한 첫 번째 평가에는 효소에 내재된 기본적인 물리적 특성을 결정하는 것이 포함됩니다. 잠재적인 항균제를 신속하게 스크리닝하는 방법을 통해 원하는 표적 기질에 대해 가수분해 활성이 있는 후보 물질을 선택할 수 있습니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 정량적 염료 방출 분석법은 효소 가수분해 검출에 다양한 기질을 사용할 수 있도록 합니다. 박테리아 세포벽에 대해 활성을 가진 단백질 항균 효소의 경우, 이러한 분석의 다양성을 통해 생존 가능한 박테리아 세포(마이크로슬라이드 분석만 해당), 열 사멸 전체 박테리아 세포 기질 또는 표적 박테리아에서 정제된 펩티도글리칸에 대해 빠르고 효과적이며 정성적 및 정량적 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 이러한 분석은 대체 치료제, 식품 보충제 및 생물막 생산 억제제와 같은 분야에서 사용하기 위한 항균 효소 발견에 유용합니다.

마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 새로운 단백질 항균제의 검출 및 특성화를 위한 입증된 방법입니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법은 항균 활성에 대한 상대적(정성적) 추정치를 제공하고 효소 농도 및 활성에 대한 최소한의 추론을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하면 활성이 없는 용해 영역의 발달로 활성이 없어 영역 형성이 부족해지는 것으로 활성을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 구역 발달 속도와 구역 직경은 샘플에 존재하는 효소의 양과 순도를 나타냅니다. 그러나 이 속도와 구역 내 기질 제거의 품질은 오염 물질의 존재, 가수분해 반응의 완전성 및 기질의 유형에 의해서도 영향을 받을 수 있습니다. 간섭 오염 물질은 웰로부터의 효소 확산 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 불완전한 가수분해 또는 기질 유형의 변화는 용해 6의 혼탁 영역을 초래할 수 있습니다.

염료 방출 분석은 효소로 가수분해된 기질에서 반응 상층액으로 방출되는 공유 결합 Remazol brilliant blue R 염료 생성물의 양을 정량적으로 평가합니다. 이 방법은 기질의 차이와 관련된 약간의 변동성만 가지므로 마이크로슬라이드 확산 분석과 비교하여 가수분해 검출에 대한 감도가 더 높습니다. 이러한 특성을 통해 이 방법은 효소의 생화학적 특성을 특성화하고 서로 다른 항균 효소 간의 비교를 위한 분석의 표준화에 유용성을 가질 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 기본 마이크로슬라이드 확산 분석 및 염료 방출 분석을 수행하는 방법을 제공하는 동시에 각각에 대한 검출 한계 및 변동성의 규모를 입증합니다. 이 분석은 특성화되지 않은 토양 박테리아 분리물의 배양 상등액에서 정제된 미확인 단백질 항균제에 대한 기본 평가를 수행하는 데 사용됩니다. 분석 내에서 박테리아 세포 기질에 대해 관찰된 활성을 통해 이전에는 특성화되지 않은 단백질 항균제와 대조군 단백질 분해 효소인 α-키모트립신 간의 반응 활성을 비교할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 다양한 응용 프로그램을 수용하기 위해 확장 및 수정할 수 있는 두 가지 기술의 적용을 위한 기반을 제공합니다.

Protocol

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세균 및 펩티도 글리 기판 1. 준비

주 : 전 세포 세균 펩티 기판 정제가 확산하는 마이크로 분석 및 염료 방출 분석 모두에서 효소 기질로서 사용된다. 이 기판은 효소 반응을 수행하기 전에 준비가 필요합니다. 다음 프로토콜은 자신의 준비에 대해 설명합니다.

  1. 전체 세균 세포 기질
    1. 고초균 (168)의 2 mL의 하룻밤 배양하여 영양 액체 배지 500 ㎖에 접종하여 박테리아 세포 기질을 생산 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC 23857 참조). 문화는 박테리아 문화의 두 배의 결과로 급속한 성장 단계로 정의 성장 지수 단계를 도달 할 때까지 (125 회전)을 진탕 30 ° C에서 품어. 살모넬라 엔테 subsp의 재배. 엔테 (ATCC 10708), (125 회전)을 진탕 37 ° C에서 성장 매체로 영양 국물을 사용합니다.
    2. 압력이 3 기압에서 121 ° C에서 10 분 동안 고온 가압 멸균하여 각 문화를 열-죽인다.
    3. 5000 x g에서 20 분간 원심 분리하여 가열 살해 박테리아 기판 수확. 타입 1 물과 펠렛을 세번 세척하고 소량의 물에 재현 탁. 본 연구에서는 1200 μL의 기판을 일시 중지합니다.
    4. 분취 액을 20 ℃에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 및 저장소 박테리아 세포 기질 300 μL.
  2. 정제 된 펩티도 글리 기판
    1. (재료 및 장비 표 참조) 대상 기판 박테리아 7-10에서 펩티도 글리 정화 또는 공급 업체로부터 취득. 액세서리 세포 벽 폴리머에서 원유 펩티도 글리 준비를 정화.

2. 질적하는 마이크로 확산 분석 [Lachica에서 수정, 등. 11]

주 : 마이크로 슬라이드 확산 분석은샘플에 항균성 효소의 존재를 검출하기위한 정 성적 방법. 효소는 아가로 오스 함유 매트릭스 기판을 통해 확산로서 효소가 기질을 가수 분해와 같은 정화 영역이 발생한다. 다음 프로토콜 정성 단백질 항생제의 존재를 검출하는 마이크로 확산 분석의 제조 및 성능을 설명한다.

  1. 제조사의 프로토콜에 따라 Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 키트를 사용하여 평가 될 미생물 효소의 농도를 결정한다.
  2. 효소 버퍼로서 인산 완충 식염수 (PBS)를 이용한다; 그러나 경험적으로 주어진 효소에 대한 버퍼 적절한를 결정한다.
  3. 반응 버퍼로서 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 항균성 효소의 일련의 희석을 수행한다. 이러한하는 마이크로 확산 분석에 사용 된 용액을 희석 0 페이지, 10 페이지, 100 페이지, 1 NG, 10 ng의 100 NG, 1 μg의, 1의 최종 분석 단백질 질량을 생산반응 부피 당 0 μg의.
  4. 개인의 microfuge 튜브에 단백질 질량을 분배 및 반응 우물을하는 마이크로 이외에 준비에 PBS를 사용 μL (20) 단백질의 볼륨을 조정합니다.
  5. PBS 50 ㎖로 오스 0.25 g을 용해하여 0.5 % 아가 로스 수용액을 만든다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 종기에 대한 해결책을 가열한다. 중량 용융 과정에서 손실 된 물을 결정하고이 용액에 다시 추가 할 수 있습니다.
  6. 아가로 오스 용액을 물에 10 % 아 지드 화 나트륨의 50 μL를 추가 한 수욕에서 50 ℃로, 용액의 온도를 조절한다. 소듐 아자 이드는 마이크로 슬라이드 확산 분석 배양시 세균의 증식을 억제하는 오염 첨가된다. 생존 세포를 기판으로 사용하는 경우, 아가로 오스 용액의 아 지드 화 나트륨을 생략합니다.
  7. 얼음에 열 살해 박테리아 기판을 해동.
  8. 다시 일시 약로 오스 용액 12 ㎖ 중의 세균 기판은 2.0 MCF 탁도 일치아란은 (재료 표 참조) 표준는 등가. 대략 탁도가 달성 될 때까지 아가로 세균 기판을 추가하여 솔루션을 통해, 흰색 배경에 검은 색 선을 시각화하여 용액의 탁도를 비교한다.
  9. 즉시 각 마이크로 슬라이드 (25 X 75 X 1mm 3)로 오스 - 기질 용액 3 ㎖를 피펫.
  10. 슬라이드 고화 후, 코르크 나방 (4.8 mm 직경)을 사용하는 마이크로 각각의 아가 기판 층에 세 개의 웰 펀치. 각각의 웰에 각각 조정 된 단백질 용액을 희석 20 μl를 추가합니다.
  11. 또한 음성 대조군으로 PBS (20 μL) 또는 소 혈청 알부민 (20 μl의 PBS에 5 μg의)를 사용합니다. 양성 대조군으로, 리소자임 등 같은 기판에 적합한 공지 bacteriolytic 효소를 사용한다.
  12. 37 ℃, 습도 챔버에 슬라이드 또는 효소의 최적 활성 온도 부화. 배양의 길이는 농도에 의존하고항균 효소의 특정 활동. 전형적인 반응 시간은 밤새 (약 16 시간)입니다.
  13. 배양 후 약 30cm의 초점 거리에서 60mm 렌즈와 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 현상 분석의 간접 광 캡처 이미지 아래 슬라이드를 관찰한다.
    주 : 특정 기판 용 항균 단백질의 효소 활성은 효소는 아가로 확산으로 잘 해결 형성 가수 투명한 영역의 발전과 관련된다.
  14. 효소의 활동을 한정하기 위해, 각 웰 주위에 형성 영역의 크기를 관찰합니다. 낮은 효소 활성을 정량적으로 작은 영역에 관한 동안 높은 효소 활성을 정량적으로 더 큰 영역에 관한 것이다.

3. 기판 라벨 - Remazol 브릴리언트 블루 R 염료 라벨은 [서주 (12)로부터 수정]

주 : 염료 방출 분석에서, 기판은 공유 결합이다 LINKED는 화려한 푸른 R 염료를 Remazol합니다. 다음 프로토콜 염색 효소 기질의 제조를 설명한다.

  1. 타입 I, 물 99 ㎖에 1g의 NaOH를 용해시켜 250 mM의 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을가 200㎜, Remazol 브릴리언트 블루 R 염색 (RBB) 용액을 만드는 데 사용된다.
  2. 신선한 250 mM의 NaOH 용액 (3.1 단계)의 98.75 ml의 ± 1 mL에 1.25 g의 RBB을 용해하여 200 밀리미터 RBB 솔루션을합니다.
  3. RBB 용액 30 ㎖ 중의 0.5 g 습윤 중량의 농도로 가열 살해 균체를 다시 일시. 정제 펩티 들어 RBB 용액 30 ㎖ 중의 0.3 g 습윤 중량의 농도 펩티을 다시 일시 중지.
  4. 부드럽게 혼합하면서 37 ℃에서 6 시간 동안 회전 플랫폼 삼각 플라스크 내의 반​​응 혼합물을 인큐베이션.
  5. 4 ° C 배양기에 반응 혼합물을 전송, 부드러운 혼합과 함께 추가로 12 시간 동안 배양한다.
  6. 배양 후, 3000 XG에서 원심 분리하여 염색 기판을 수확30 분 동안. 기판 펠릿의 염료 용액을 경사 분리한다.
  7. 원심 분리 유형 I의 물로 반복 (약 3 ~ 5 세척)을 염료 표지 된 세포 또는 펩티도 글리을 세척하여 기판에서 비 공유 결합 수용성 염료를 제거합니다. 각각의 물을 추가로 철저하게 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    참고 : 언 바운드, 수용성 염료가 더 이상 원심 분리 후 물 세척에서 볼 수없는 경우. 기판은 하나의 부가적인 세척을 부여한다. 마지막 세척의 상등액을 알 수있는 반면 기판은, 푸른 남아 있습니다.
  8. 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 소량의 물에 현탁 염색 기재를 저장한다.

4. 양적 염료 방출 분석

주 : 염료 방출 시험 동안, 반응 상층 액으로 제품을 염색 효소 반응 릴리스 RBB 염색 기질의 가수 분해. 릴리스 염료의 양의 측정은 색도계 AMO를 나타낸다특정 효소 시료 내에 존재하는 효소 활성의 UNT. 정량 방법은, 기판에 걸쳐 상이한 효소의 비교를 허용하고 효소 반응 (예, 온도, 염도, pH를)를 좌우하는 환경 조건의 변화를 허용한다. 다음 프로토콜은 정량적 단백질 항균제의 효소 활성을 검출하는 염료 방출 분석의 제조 및 성능을 설명한다.

  1. 염료 분리 분석을위한 준비
    1. 냉동 염색 기판을 실온으로 돌아가 경험적으로 주어진 효소에 대한 결정 분석 완충액 (PBS)로 두 번 세척 할 수 있습니다.
    2. 수행 될 염료 방출 분석법 숫자로 200 ㎕의 반응 부피를 곱하여 필요 기판 현탁액의 부피를 계산한다.
    3. (광학 밀도까지 4.1.2 결정 분석 완충액의 부피, 염색 기재를 첨가하여 기판 현탁액을 제조2.0 OD)를 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 달성된다. 농축 된 용액의 1 희석 : 분광 광도계의 기능적인 한계 내에서 유지하기 위해, 1 1.0과 2.0 OD 595을 측정한다. 빈으로 분석 버퍼를 사용합니다.
      주의 : 반응 기판 탁도 고효율 효소의 활동 수준에 맞게 2.0 이상으로 상승 될 수있다.
    4. 단백질 항균성을 중단하는 일 ㎎ / ㎖의 농도에서 추정 된 분석 완충액으로 평가한다.
    5. 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트의 마이크로 분석법을 이용하여 단백질 시료의 실제 농도가 정량되도록 결정한다. mL의 분석 완충액을 사용하여 / 1 mg의 재고 현탁액의 농도를 조절한다.
  2. 단백질 항균을위한 최적의 배양 조건을 결정하기 위해 염료 방출 분석을 사용하여
    1. 100 NG / μL에 주식 단백질 항균 서스펜션을 희석. 이 농도는 AF를 제공합니다볼륨 (10 μL) 당 단백질 1 μg의 원고 판의 반응 매스 분석 반응에 첨가 하였다.
    2. 열 범위를 결정하는 bacteriolytic 단백질을 평가한다. 이러한 분석에 열 범위는 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, 65 ° C를 포함했다.
    3. 0.5 ㎖의 미세 원심 분리 관에서의 반응 분석을 수행한다. 각 열 조건, 준비 기판 서스펜션의 200 μL에 주식 단백질의 10 μl를 추가합니다.
    4. 한 시간에 한 번 반전에 의해 혼합하여 8 시간 동안 열 자전거 타는 사람에 품어.
    5. 인큐베이션 후, 에탄올 25 μl를 첨가하여 반응을 정지.
    6. 2 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 소화 불용성 기재를 제거하고, 소화 기판의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 96 웰 편평 바닥 마이크로 플레이트에 각각의 반응 혼합물에 대해 반응 상등액 150 μL를 옮긴다.
    7. antimicrob 단백질의 효소 활성을 측정가용성 RBB 염료의 양을 결정함으로써 주어진 기판 IAL은 효소 가수 분해 후 기판으로부터 해리. 효소 활성을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 상층 액의 흡광도를 측정한다. 표지 기판으로부터 상층 액에 발표 된 수용성 염료로 증가 흡광도를 효소 활성의 정량적 측정이다.
      주 : 흡광도의 변화는 활성 단위 (AU)로 표시되는 경우 595 nm에서 염료 방출 반응 상청액의 광학 밀도의 증가는 0.01 AU 한 결과. 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소와 함께 배양 빈 반응은 상기 RBB 표지 기판으로부터 인해 배양에 방출하는 염료를 빼기 위해 사용된다. 최적 온도 효소 활성의 피크 부 측정을 제공한다.
    8. 반복 4.2.7 내지 4.2.1 미생물 효소에 대한 최적의 버퍼 상태를 결정하기 위해, 다양한 배양 버퍼를 사용하는 단계. t에서HESE 분석은, PBS를 사용합니다.
  3. 색소 분리 분석법을 이용하면 항균 단백질에 대한 최적의 배양 온도에서 최소 활성 농도를 결정하는
    1. 분석 완충액을 사용하여 재고 항균 단백질 현탁액의 일련의 희석을 수행한다. 희석 계열 범위 항균성 효소의 활성에 따라 달라진다. 이 분석에 사용 된 용액을 희석 0 페이지, 10 페이지, 100 페이지, 1 NG, 10 ng의 100 NG, 1 μg의, 10 μg의 최종 분석 단백질 양을 생산했다.
    2. 48 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트의 각 반응 분석을 수행합니다. 각각의 분석 조건의 경우, 준비된 기판 서스펜션의 200 μL에 각각의 단백질 현탁액의 10 μl를 추가합니다. 반응 완충액을 사용하여 10 ㎕의 반응로에 첨가 된 단백질 용액의 부피의 어떠한 변화를 조정한다.
    3. 증발에 의한 부피 변화를 방지하기 위해 플레이트 밀봉 막과 마이크로 밀봉. 결정된 최적의에서 진탕 배양기에서 품어진탕 16 시간 동안 항균 주어진 단백질 cubation 온도.
    4. 인큐베이션 후, 각각의 에탄올 25 μl를 첨가하여 반응을 정지 아니라 2 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 소화 기판을 제거한다.
    5. 소화되지 않은 기판의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 96 웰 편평 바닥 마이크로 플레이트에 각각의 반응 혼합물에 대해 반응 상등액 150 μL를 옮긴다.
    6. 효소 활성을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 상층 액의 흡광도를 측정한다. 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소와 함께 배양 빈 반응은 상기 RBB 표지 기판으로부터 인해 배양에 방출하는 염료를 빼기 위해 사용된다. 표지 기판으로부터 상층 액에 발표 된 수용성 염료로 증가 흡광도를 효소 활성을 정량적 측정을 제공합니다.
      참고 : 흡광도의 변화가 활동 단위 (AU), 1 AU 결과로 표현된다595 nm에서의 염료 방출 반응 상청액의 광학 밀도의 증가를 0.01.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

하는 마이크로 확산 분석 및 정량 염료 방출 스크리닝 분석은 새로운 단백질 항생제 초기 조사를 측정하기위한 효과적인 방법이다. 각각의 분석은 장점과 한계가 있습니다; 함께 수행하면 이들은 빠른 초기 스크리닝 및 항균제의 기본 특성을 허용한다.

하는 마이크로 확산 분석을 효율적으로 단백질 항생제를 생산하는 미생물 라이브러리의 신속한 선별을 허용한다. 효소 농도 수준이 관심사 인 경우, 검출 감도 제약 반응보다 잘 염료 방출 분석에 추가 될 효소의 더 많은 양을 필요로 분석을 제한 할 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 분석의 정성적인 특성은 관찰자가 각 웰 내에 존재하는 효소의 상대 량을 비교할 수.

"1">도 1a에 도시 된 용해의 현상 영역에서, (25 효소 μg의) 영역의 리딩 에지는 상기 기판의 혼탁 또는 불완전 분해를 표시하면서도에 가장 가까운 영역 보다 완벽한 기판 용해를 표시합니다. 이 현상은, 선단에 확산 효소의 감소하는 농도의 생성물은 영역 직경의 정확한 측정을 복잡하게한다. 그림 1에서 관찰 된 웰 B (15 μg의), C (10 μg의), D (5 μg의), E (1.0 μg의)을하고, F (0.1 μg의)로서, 완전한 용해의 영역의 직경은 멸종 발산 효소의 감소 된 양에 상관. 조건 F (0.1 μg의) 경우, 아가 내의 효소 농도는 상기 기판을 가수 분해하여, 아가로 오스를 통해 이동함에 따라 확산 효소를 시각화 할 수 있도록 한계 이하이다. 하는 마이크로 확산 분석은 정제 된 바실러스 서브 틸리 pepti를 사용하여 실행 된기판으로 doglycan (그림 2). 영역 인해 균일 아가에서 정지하는 펩티도 글리 칸의 릴럭 턴스에 전체 세포 살모넬라 엔테 관찰보다 덜 정의되어 있지만, 미지의 미생물 효소에 의해 가수 분해 펩티은 명백하다.

염료 방출 분석은 효소 반응에 영향을주는 환경 적 요인의 낮은 검출 한계와 편차를 허용하는 마이크로 슬라이드 확산 분석법보다 더 민감하고 다양한 분석이다. 대표적인 분석에서, 온도는 미생물 효소에 대한 최적의 온도를 결정하기 위해 변화시키고, 35 ℃의 PBS (도 3)으로 결정된다. 이 최적의 푸른 색상 (도 3b)과 595 nm의 (도 3A)에서의 흡광도를 측정으로부터 유도 활성 단위로 나타낸 바와 같이 증가 된 양으로 반응 상청액 분명히 알 수있다. 그만큼염료 방출 분석의 다양성은 연구자가 급속히 소정 효소의 최적 배양 조건을 결정하는 것은 온도뿐만 아니라 반응 완충액 버퍼 구성 요소뿐만 아니라 다양 할 수있다.

미지의 미생물 효소 (도 4) 및 α-키모 트립신 제어 효소 (도 5)의 활동 수준이 RBB 표지 고초균 열 킬드 기판 대 PBS에 35 ° C의 결정된 최적의 배양 온도에서 측정 하였다. 도 4 및도 5의 결과의 비교는 미지의 미생물 효소는 B. 거의 두 배의 친화력이 것을 나타낸다 서브 틸리 기판. 또한, α-키모 트립신 제어 완전히 열 살해 B. 다이제스트 않았다 웰 내의 서브 틸리 기판 (데이터는 보이지 않음). 키모 트립신, α-제어의 활성 플레이트 시작AU 약 0.3 μg의 미지의 미생물 효소 (도 4 및도 5)에 대한 모든 효소의 양에 걸쳐 활성 단위의 지속적인 상승과 비교. 이는 미지의 효소를 더 지속 활성을 갖는 것이거나 B. 내의 효소 절단 부위 가능한 더 많은 수 있다는 것을 나타낼 수있다 서브 틸리 기판.

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그림 1. 살모넬라 엔테 전체 셀 기판에 대하여 효소 활동하는 마이크로 확산 분석은 정 성적으로 가열 사망 살모넬라 엔테 subsp 대하여 미지의 단백질의 항균 활성을 평가 하였다 엔테를 (ATCC 10708).. 의 각각의 웰에 첨가하고 인산 완충 식염수 (PBS)에 현탁하고, 미지의 미생물의 단백질 질량슬라이드 포함 25 μg의 (물론 A), μg의 (물론 B), 10 μg의 15 (물론 C), 5 μg의 (물론 D), 1 μg의 (물론 E), 0.1 μg의 (물론 F). PBS 단독 분석법의 음성 대조군에 사용 하였다. 용해의 영역은 6 시간 배양 후 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 효소 활성 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)에 대해는 펩티도 글리 칸 세포 벽하는 마이크로 확산 분석은 정 성적으로 바실러스 서브 틸리 스 (168)의 펩티도 글리 칸에 대해 미지의 단백질의 항균 활성을 평가 하였다. PBS의 20 μL, 알 수없는 항균 10 μg의 현탁 잘 상기 microslides의 추가되었습니다. PBS 단독으로 음극으로서 사용했다분석 (물론 B)에 대한 제어 할 수 있습니다. 용해의 영역이 37 ° C에서 6 시간 배양 후 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 3 :. 프로틴의 최적 반응 온도는 항균 염료 방출 분석의 다양성 관심 (6)의 효소의 활성에 대한 그들의 영향을 결정하기 위해 그러한 배양 온도 및 버퍼와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 허용한다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 미지의 단백질의 항균 (1 μg의)의 활성은 배양 온도 범위하에 RBB 표지 열 살해 고초균 PBS에 대해 평가 하였다. 활성 단위 (AU) (A), RBB-B의 흡광도로 표시가수 분해를 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 측정 한 후 운드, 제품 상등액으로 방출. 각 온도 조건에서 첨가없이 효소 반응은 다양한 온도에서 항온 처리에 기인하는 방출 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각각의 배양 온도에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
도 4 :. 단백질 활동 범위는 항균 미지의 단백질을 미생물의 활동 범위는 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1000 ng의 하룻밤 배양 후 활성 단위로 측정했다 상기 BCA에 의해 측정 PROTEIN 분석 (A). 이러한 반응을위한 상기 RBB 표지 B. 서브 틸리 기판 레벨은 효소 (1000 NG)의 최대 양, 반응이 완전히 반응 잠복기 내의 모든 가능한 기판을 가수 분해하지 않도록 595 nm에서 5.0의 광학 밀도를 제공하기 위해 증가되었다. 첨가의 효소 반응을 제어 단독 배양로 인한 해제 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각 효소의 양에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5 :. α-키모 트립신에 대한 α-키모 트립신 활동 범위에 대한 활동 범위는 액티브로 측정 하였다밤새 배양 한 후 성만 단위 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 및 효소 (A)의 천 NG. 이러한 반응을위한 상기 RBB 표지 B. 서브 틸리 기판 레벨은 효소 (1000 NG)의 최대 양, 반응이 완전히 반응 잠복기 내의 모든 가능한 기판을 가수 분해하지 않도록 595 nm에서 5.0의 광학 밀도를 제공하기 위해 증가되었다. 첨가의 효소 반응을 제어 단독 배양로 인한 해제 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각 효소의 양에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

하는 마이크로 확산 분석 및 염료 방출 분석은 이전에 검출 및 미확인 된 단백질을 특성화 항생제 효과를 제공한다. 이 신속하고 민감한 방법은 더 많은 연구 자원을 투자하기 전에 관심이 효소의 식별을위한 생물 소스 라이브러리의 높은 처리량 검사를 할 수 있습니다. 명확한 표적 효소가 발견되기 때문에, 검출 분석의 변형이 급격히 효소를 검출하거나 효소의 생화학 적 특성을 결정하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다단계 단백질 정제 기법 중에 확산하는 마이크로 분석 급속 관심 효소를 함유하는 분획을 검출 할 수있다. 또한, 효소 반응 OPTIMA 염료 방출 분석에서 반응 버퍼 및 배양 온도 변화에 의해 결정될 수있다.

하는 마이크로 확산 분석에서의 검출에 필요한 효소 질량의 범위는 효소 c​​haracteri의 함수stics. 분석의 검출 한계는 일반적으로 염료를 방출 분석법보다 더 많은 양의 효소의 사용을 필요로한다. 이 연구에서, 상기 염료 방출 분석 (도 4)로하는 마이크로 확산 분석 (도 1)의 검출 한계 비교를하는 마이크로 확산 분석법 염료 방출 분석보다 덜 민감한 기술임을 도시. 효소 농도가 중요하지 않은 경우, 마이크로 슬라이드 분석은 낮은 노동 및 설비 요구에 대하여 타깃 기판 단백질 항균제의 제조를위한 라이브러리의 신속한 초기 선별을 허용한다. 많은 노력과 장비를 필요로하지만, 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 동일하거나 상이한 효소 염료 방출 분석법 간의 비교를 정량적 결과를 얻었다 더 민감하고 재현성이다. 두 가지 방법을 쉽게 고도의 전문 장비 필요없이 대부분의 미생물 실험실에서 수행된다. representa에서하는 마이크로 확산 분석에서 검출 된 상기 최소한 1 μg의 (도시되지 않은 데이터) 동안적인 분석은, 제어 효소 α-키모 트립신은 염료 방출 분석을 이용하여 100 NG (도 5)의 낮은 양으로 발견되었다.

항균성 효소 질적 검출법으로 유틸리티를 제공 확산 분석의 다수의 변형 11,13보고되었다. 이러한 분석을 검토에서하는 마이크로 확산 분석은 초기 화면으로 상대적으로 높은 감도와 반응 준수의 용이성을 위해 개발되었다. 단백질은으로 우물에서 확산로 아가 오버레이 포도상 구균 균주에 의해 뉴 클레아 제의 생산을 검출하기 위해 사용 된에 Lachica 외. (11)의 작업에서 수정 상기 마이크로 슬라이드 확산 분석법 방사상 면역 확산 방법 (14)와 유사하게 작동 아가로 기판을 포함. 반경 방향 immunodiffu시스템은 아가 내의 확산 항원과 항체 간의 복합체 형성의 평형에 도달 할 때 시온 방법은 면역의 영역의 확장을 중지. 대조적으로, 마이크로 슬라이드 확산 분석의 기판은 초기에 잘 용해 주변의 계속 확장 영역에서 확산 항균 단백질에 의해 분해된다. 효소가 활성을 잃는다 또는 기판이 소진 될 때까지 영역의 증가 직경이 계속됩니다. 용해 구역의 생산 속도는 효소의 순도, 따라서 특정 활동으로 소생 또는 효소의 농도가 증가 웰에 첨가 하였다.

정량적 열 사망 단백질 B. 대해 항균제의 효소 활성을 평가하기위한 서브 틸리 스, 염료 자료 분석은 선택되었다. Remazol 화려한 푸른 R 염료 (RBB)를 사용하여 비색 분석은 기질 단백질 항균 activi의 다양하고 중요한 평가를 할 수 - 표지타이. 쉽게 595 nm에서 분광 광도계로 측정 할 수 가용성 청색 제품 릴리스 RBB 표지 기판 결과의 효소 가수 분해. 다른 항균 단백질 효소의 특성을 개발 RBB 염료 방출 분석의 여러 변형, 다른 기판과 응용 프로그램이 분석의 유연성을 보여준다. 예를 들어, 활성 bacteriolytic lysostaphin의 효과를 결정하는데, 저우, 등., RBB 염색 포도상 구균 세포 및 기판 (12)을 이용하여 포도상 구균 펩티 색소 분리 분석법을보고 하였다. 이 RBB 염료 방출 분석의 응용 예의 변형 예에서, RBB 표지 마이크로 코커스 루 테우스 (Micrococcus luteus) 기판은 세균성 감염과 악성 종양의 존재와 같은 질병을 진단하기위한 빠르고 민감한 방법으로 사용 스크린 제안 된 수 혈청 15 인간 리소자임 발현 수준과 상관 될 수있다. 또한, RBB 표지 된 박테리아 세포 기질을 가지고LSO 리소자임 (16)의 검출을위한 방법 zymogram 사용되고.

우리는 효소 생산을위한 빠른 라이브러리 스크리닝을 허용, 염료 자료 분석의 저하 검출 한계, 편리 성 및 재현성을 보여줍니다. 분석의 수정은 온도, pH, 염분의 효과뿐만 아니라 항균 단백질 (6)의 활성에 다른 단백질 분해 효소의 효과를 포함 하류 정량적 생화학 적 특성 분석을 위해 수 있습니다. 또한, 정량적 인 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 여러 효소의 활성을 비교하기 위해 사용될 수있다. RBB 염료 자료 분석은 특성화 및 단백질 항균제 검출 외에 다당류에 대한 활성을 갖는 효소 유틸리티를보고했습니다. Pettersson이와 에릭손은 셀룰로스, 자일란, 만난 및 전표의 비정질, RBB 염색 폴리 사카 라이드 비드를 사용하여 endoglycanase 활동을 검출하는 분석보고십칠인치 이러한 연구 결과의 확장에서, 바실러스 투 린지 엔시스 비티-107에 의해 생성 키티 나제 효소의 검출을위한 중요한 방법은 RBB (18)로 표지 콜로 이달 키틴을 사용하여 개발되었다. 이들과 다른 연구, RBB 염색 기판 시판 소스 케라틴, 아밀로펙틴, 아밀로스, 글리코겐, 라미 나린, D- 자일란, 아조 - 보리 글루칸 전분 대 포함한 당분 활성의 검출에 사용 나왔다.

본 연구에서는 비색 결과를 생성하는 데 필요한 RBB 표지 된 기질 및 효소의 양을 감소시키는, 마이크로 포맷 염료 방출 분석의 유용성을 입증한다. 도 4 및도 5에 도시 된 바와 같이, 마이크로 염료 방출 분석은 효소 활성 검출 용 마이크로 슬라이드 확산 분석법보다 더 낮은 검출 한계를 제공한다. 해석의 신속한 사용에 관하여, 노동의 보존, 그리고 쉽게, 마이크roslide 확산 분석은 항균 활성의 존재뿐만 아니라 다운 스트림 단백질 분리 및 정제 단계에서 항균 단백질 존재의 표시에 대한 초기 높은 처리량 화면에서 유틸리티를 제공합니다. 두 분석의 조합은 신규 한 단백질 항균제의 초기 스크리닝 및 특성화 궁극적으로 서로를 보완

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다. MITRE Corporation은 여러 연방 정부의 재정 지원 연구 개발 센터 (FFRDCs)를 작동하는 비영리 회사입니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 MITRE Innovation Program(Project 25MSR621-CA)을 통해 The MITRE Corporation에서 자금을 지원받았습니다. 저자는 이 작업에 대한 지원과 검토에 대해 Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D. 및 Caroline Gary에게 감사의 뜻

을 전합니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
저증발 뚜껑이 있는 48웰 평면 바닥 마이크로플레이트Becton Dickinson3078
96웰 평면 바닥 마이크로플레이트(Costar 3595)Corning, Inc.3595
아가로스피셔 사이언티픽BP162-100
&알파;-키모트립신MP 바이오메디컬215227205
바실러스 서브틸리스 168미국형 배양 컬렉션23857
C1000 터치 써멀 사이클러Bio-Rad
코르크 보어훔볼트H-9661
라이소자임Sigma-AldrichL6876-1G
McFarland 동등성 표준(2.0)Fisher ScientificR20412
마이크로슬라이드Fisher Scientific22-38-103
영양 육수Fisher ScientificS25959B
펩티도글리칸 Bacillus subtilis 168Sigma-Aldrich69554-10MG-F
인산염 완충 식염수(1x)TeknovaP0200
Pierce BCA 단백질 분석 키트Life Technologies23227
Synergy HT 마이크로플레이트 분광 광도계BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB)Sigma-AldrichR8001
Salmonella enterica subsp. entericaAmerican Type Culture Collection10708
아지드화나트륨Fisher ScientificS227-100
수산화나트륨(NaOH)Fisher ScientificS318-500
역가 상판 사전 절단 접착 폴리에틸렌 필름다양한 생명공학T-TOPS-50
UltraPure 증류수Invitrogen10977-015
NameCompany카탈로그 번호Comments
Solution
아가로스 용액
50ml PBS
0.25g 아가로스		융된 PBS/아가로스 용액에 10% 아지드화나트륨 첨가
영양 육수 매체
영양 육수 4g
500ml I형 물
250mM 수산화나트륨(NaOH) 용액
NaOH
99ml 유형 I 물
200 mM Remazol 브릴리언트 블루 R 염료 (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH 용액
용

References

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