분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

세계 보건기구 (WHO)에서 2014 보고서에 따르면 세계 성인 인구의 39 %가 과체중이며, 13 %가 비만 ^한 것이다. 가까운 미래에, 사람들이 과체중 노인 인구의 상당 부분을 포함 할 것이다. 비만과 노화의 중요한 특징은 이환율과 ^사망률이 관련 지방의 조절 곤란하다. Adipokines는 지방 조직 (AT)에 의해 분비되는 단백질, 비만 등 대사 증후군을 유발하고 당뇨병 ^(3)를 입력 할 수 있습니다. 대사 질환은 대부분 확장 ⁴ AT의 결과 지방 세포의 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의해 발생합니다. 따라서,를 제어 할 기회를 찾기 위해 AT 원인과 확장의 분자 메커니즘을 결정 관심사이다.

위에 영양 두 가지 이벤트에 의해 조절된다 AT 확대로 이어진다 과도한 에너지 저장 지방 세포의 지질 소적으로, 공정또한 지방 세포 증식 ^5로 알려진 (지방 세포 크기 증가), 증가 된 지방 조직은 비대로 이어지는. 지방 조직은 지방 세포로 다 능성 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 분화 과정이다. 첫째, 중간 엽 줄기 세포는 확약 단계에서 전구 지방 세포로 발전. 둘째, 전구 지방 세포는 또한 성숙한 지방 세포 ^(6)의 기능적 특징을 취득 구별. 여러 전사 인자는 징크 핑거 단백질 423 (Zfp423) 초기 B 세포 인자 1 (Ebf1) 등의 지방 전구 세포 검지 마스터 레귤레이터로 확인되었다. Zfp423 초기 노력을 유도하는 반면, Ebf1은 지방 세포의 전구 세포 ^(6)의 생성이 필요합니다. 말단 분화 단단히 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ (PPARγ)의 필수 전사 인자 ^칠해진다 전사 캐스케이드에 의해 제어된다. 또한 키 전사 요소 (C CCAAT / 증강 인자 결합 단백질이다/ EBP) 가족 (즉, C / EBPα, C / EBPβ 및 C / EBPδ), 크 룹펠 같은 요인 (KLFs), 캠프 응답 요소 바인딩 단백질 (CREB) 및 초기 성장 응답 20 (Krox20) ^6.

최근에는 활성제 단백질 1 (AP-1) 패밀리는 지방 세포 분화 과정에 관여 ^8,9 것이 밝혀졌다. 는 AP-1 패밀리는에 Fos 이세 및 / 또는 활성화하는 전사 인자 (ATF) 부재로 이루어진 이량 체 단백질 복합체에 의해 형성된다. FOS 관련 항원 1 및 2 (FRA-1 및 프라-2) 지방 세포의 분화를 조절할 수있다. 훌라-1 훌라-2 제어 지방 세포 회전율 ⁹ 반면, / EBPα ⁸ C를 억제함으로써 지방 세포 분화를 저해. 훌라-2는 이에뿐만 아니라 지방 세포 분화시 PPARγ2 식을 억압하여 지방 세포의 수를 감소뿐만 아니라, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 식의 직접적인 억제를 통해 지방 세포의 세포 사멸을 감소시킨다. HIF 제품군은 HETE입니다HIF-1α, HIF-2α와 HIF-1β로 구성 rodimeric 전사 인자 복합체. 이종는 산소에 민감한 HIF-α 단백질 (HIF-1α 또는 HIF-2α)와 산소를 구분하지 HIF-1β 서브 유닛 ^(10)으로 구성되어 있습니다. normoxia 동안, HIF-α 단백질은 폴리 ubiquitinylated하고 마지막으로 프로 테아 좀 ^(11)에 의해 분해된다. 확장시 AT에서 발생하는 저산소 조건에서 HIF-α 단백질은 더 이상 수산화 없습니다. 그들은 따라서 구조적으로 표현 HIF-1β와 안정 및 양식 이합체된다. HIF 응답 소자를 제어하는 유전자의 전사 활성은 혈관 형성, 대사 및 염증 ^(12)의 조절에 관여한다. 실제로, HIF-1α는 글루코스 내성을 유도하는 에너지 비용 및 지질의 사용 억제 주변뿐만 아니라, 렙틴에 의해 레벨과 HFD 유도 간 지방증 ^(13)을 증가시킴으로써 부전 AT 촉진한다. 또한, HIF-1α는 adipocy을 조절테 세포 사멸의 생체 내 및 생체 외 ^9인치

본 프로토콜은 성인 쥐의 지방 세포 항상성의 분자 특성을 해명하는 상태에서 공부에 대한 방법을 설명합니다. 그것은 세포 사멸, 증식 및 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 분화가 저산소증에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 Fabp4-CreERT 마우스 ^(9)와 훌라-2 floxed 대립 유전자를 운반하는 쥐를 교차에 의해 생성 된 훌라-2의 지방 세포 특정 삭제와 마우스를 사용합니다. Fabp4-Cre 호텔 ERT 마우스를 사용하여 결실은 지방 세포 타목시펜 주입 ^(14)에 의한 비와 유도된다. 성인 모델의 경우 타목시펜의 내부 복강 주사 6 주 세의 나이에 시작하는 연속 5 일 동안 수행된다. 분석이 완료되기 전에 따라서, 마우스 6 주 동안 정상식이 또는 고지방식이 요법을 실시한다. 본 연구에 사용 된 마우스는 남성 같은 에스트로겐과 같은 여성 호르몬을 피하기 위해 C57BL6 배경 근거한신체 지방 분포 ^(15)를 규제하는 도시. 다른 유전 적 배경을 사용하여 인해 지질 관리 ^(16)의 변형과 관련된 차이로 대사 표현형을 변경할 수 있습니다.

이 프로토콜은 조직학을 사용하여 저산소증에서 AT를 분석하는 방법과 면역 조직 화학 및 프로파일 링 분석 유전자를 사용하여 생체 내에서 지방 세포의 세포 사멸, 증식 및 분화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저산소증에 노출에 의해 변경 주 지방 세포 분화 및 세포 사멸을 분석하는 방법을 보여주는 시험 관내 실험에 의해 완성된다.

윤리 선언문 : 동물은 독일의 동물 복지법의 지침에 따라 표준화 된 조건에서 보관되어 있습니다. 동물은 표준식이 요법과 물 광고 무제한을 공급하고 12 시간 주 / 야 사이클에 보관됩니다. 동물들과 함께 모든 실험은 지역 윤리위원회에 의해 승인된다.

성인 남성에서 지방 세포 항상성의 생체 분석 1.

1. (: 25 g을 마우스에 1.5 mg의 주사 예를 들어)을 60 밀리그램 / 인트라 복강 고체 pimonidazole 염산염 kg 체중 주입 먼저 마우스의 체중을 결정 생체 내 저산소증 정량화. Pimonidazole 단백질, 펩티드와 아미노산의 티올 그룹과 부가 물을 형성하고, 특정 항체에 의해 검출되는 유효 저산소 마커이다.
2. 쥐를 희생하고 perigonadal 지방 패드 (그림 1)를 제거합니다.
   1. 45 분 주사 후, CO ₂ 질식 이후 자궁 경부 탈구로 쥐를 희생. </ 리>
   2. (도 1에 도시 된 바와 같이) 마우스의 사지를 핀 복강을 열고. 왼쪽과 복강 내 오른쪽 perigonadal (부고환) 지방 패드를 제거합니다.
      참고도 1에 나타낸 바와 같이 지방 패드가 복막 전단에 의한 부고환에 바인딩 (perigonadal 지방 패드는 화살표로 표시된다).
   3. 지방 패드에서 성선 조직을 제거하는주의하십시오. 지방 패드 중량 (g) 체중 (g) 당 : 비를 계산하기 위해 지방 패드 가중치를 결정한다.

그림 1 : 마우스의 복강에 perigonadal 지방 패드의 위치. 희생 후 성인 마우스에서 perigonadal 지방 현지화의 그림입니다. Perigonadal 지방 패드는 화살표로 표시됩니다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

3. 정량적 유전자 발현 프로파일을 컴파일, RNA를 분리 한 perigonadal 지방 패드를 사용한다. 참고 : 조직이 처리 될 때까지 -80 ° C에서 액체 질소에서 RNA 안정화 솔루션에 저장 조직 샘플.
   1. 지방 패드를 균질화 구아니딘 이소 티오 시아 네이트와 페놀의 1 ㎖의 단일 - 상 용액을 지방 패드를 추가한다. (30 초 일시 중지와 함께, 2 회 20 초) 6,500 rpm으로 균질의 조직을 분쇄하기 위해 세라믹 구슬 (1.4 mm)를 포함하는 튜브를 사용합니다.
   2. (Chomczynski 및 사키 ^(17)에 의해 단일 단계 방법)는 다음과 같이 RNA를 분리.
      1. 실온에서 5 분 원심 분리기 5 분 12,000 XG에 부화, 15 초 동안 흔들어, 상을 분리 microcentrifuge 관에 균질화 지방 패드를 전송, 0.2 ml의 볼륨 클로로포름을 추가합니다. 새로운 microcentrifuge 관에 RNA를 포함하는 상 수상 (약 400 μl를), 전송합니다. 인클루드하지 마십시오 DNA를-포함보내고 계면 또는 단백질 함유 페놀 단계.
      2. (가 -20 ° C에서 밤새 배양하는 것도 가능하다) 혼합 4 ° C에서 15 분 동안 품어,의 RNA를 침전 이소프로판올 1 볼륨을 추가합니다. 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 이소프로판올 뜨는을 제거합니다. 10 분 동안 12,000 × g으로 원심 분리 단계의 75 % 에탄올로 두 번 세척 하였다.
      3. 실온에서 약 10 분 동안 침전 된 RNA를 건조시킨 후, 50 μL에 용해 H ₂ O (의 RNase가없는). 이를 용이하게하기 위해, 65 ℃에서 2 분간 배양한다.
         주 : -80 ° C에서 또는 장기간 저장을 위해 액체 질소에 75 % 에탄올에 RNA를 보관.
      4. (최적의 몫이 1.8 내지 2.2 사이이다)를 _{260/280으로} RNA 제제 정량화 및 ₂₆₀ 농도를 구한다
         
   3. DNA의 오염을 방지하기 위해, RNA 조제 1 μg의 다이제스트10 μL의 볼륨에서 37 ° C에서 30 분 동안 1 U의 DNase I와. 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화.
      참고 :이 단계는 선택 사항입니다.
   4. 정량적 PCR 응용에 적합한 단일 가닥의 cDNA를 생성하는 역전사 반응을 1 μg의 RNA를 함유하는 RNA 제제의 10 μl를 사용한다. 구성 요소 및 그 금액은 표 1에 나열되어 있습니다.
   5. 정량적 실시간 PCR 반응에 대한 PCR 마스터 믹스를 사용합니다. 전체 지방 패드의 대사 변화를 확인하려면 AT 항상성 (표 2) 표 3에 나와있는 PCR 조건에 관련된 유전자 특정 프라이머를 사용합니다.
   6. 실시간 PCR 데이타 분석.
      1. 베이스 라인 (그림 2), 형광 신호의 변화가없는 한 15 일반적으로 사이클을 정의합니다. 실시간 PCR 소프트웨어 결과 기준선 형광 및 내부 기준 ROX 염료를 특정 형광 신호를 정규화프라이머에 의해 특정 된 신호의 크기 델타 Rn의 (ΔRn).
      2. 증폭 곡선의 기하 급수적 단계에서 임계 값을 설정합니다. 교차는 임계 값주기 (CT)를 정의합니다. CT 값에 기초하여 상기 기준 식 (ΔCT) 및 배 변화 (ΔΔCt)을 계산한다 :
         
         

표 1 : 단일 가닥의 cDNA를 생성하는 역전사 반응을위한 각 볼륨 요소.

표 2 : 지방 세포의 항상성을 분석에 사용 된 각 프라이머의 서열과 유전자의 목록.

표 3 : 실시간 PCR 조건.

그림 2 :. 실시간 PCR 증폭 곡선의 특성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 지방 세포의 항상성의 조직 학적 분석을 수행하려면 두 번째 perigonadal 지방 패드를 사용합니다. 조직을 건조하는하지 마십시오!
   1. 3.7 %에 파라핀에 포함 하룻밤 PBS 버퍼 포름 알데히드, 지방 패드를 고정 (다른 곳에서 ¹⁸ 설명 된대로 지침에 따라) 및 2-5 μm의 두께 섹션 (최대 5 μm의)에 포함 된 조직을 잘라.
   2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 후 밝은 필드 현미경 필드와 지방 세포의 크기에 따라 지방 세포의 수를 결정합니다 <올>
   3. 자일 렌에서 5 분간 3 회 세척 100 % 에탄올에서 2 분 96 % 에탄올에 2 분 2 회 섹션 2 번 재수에 의해 Deparaffinize 섹션. 마지막 5 분 동안 증류수 H ₂ O에 섹션을 씻는다.
   4. 실온에서 10 분 동안 증류수로 H ₂ O 5, 5 분 동안 H ₂ O로 세척 : 헤 마톡 실린으로 염색 1 희석. 에오신 용액으로 30 초 동안 염색 (20 ㎖, 5 % 에오신 Y는 / 210 ml의 H ₂ O / 25 μL의 빙초산을 증류수)와 5 분 동안 H ₂ O로 다시 세척 하였다.
   5. 5 분 동안 2 분, 크실렌을 3 회 96 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 2 회 반복하여 각 부분을 탈수. 무수 장착 에이전트 섹션을 탑재합니다.
   6. 밝은 필드 현미경 섹션을 평가합니다. ImageJ에 1.48v ¹⁹ 지방 세포를 분석하는 방법의 대표적인 예를 도시한다. 3 : 면적당 세포 (μm의 ^2)의 수를 셀 영역 (× ¹⁰³ μm의 ²
   7. ImageJ에의 1.48v와 섹션의 사진을 엽니 다. 영상의 파라미터가 아닌 길이의 부 화소에 표시하는 경우, 배율을 조정한다.
   8. 도구 모음에서 * 직선 *을 선택하고 규모 모음을 참조하여 알려진 거리에 선을 조정합니다. 분석으로 이동 -> 설정 스케일 라인의 거리를 픽셀 단위로 표시된다. 알려진 거리와 길이의 단위, 예를 들어, μm의를 추가합니다. OK를 눌러 확인합니다. 화상의 크기 및 매개 변수 분석을 소정 길이의 단위로 표시된다.
   9. 지방 세포의 매개 변수를 확인하려면 임계 값을 조정합니다. 이미지로 이동 -> 조정 -> 임계 값이 임계 값 창을 엽니 다. 다음 설정을 선택 임계 화 방법 : 기본, 임계 값 색상 : B & W를, 색 공간 : HSB를. 그림은 이제 흑백 나타낸다. 조정밝기는 흰색 지방 세포를 취소도 같이 검은 세포 간 공간을 닫습니다. 도 3b.
   10. 도구 모음의 * 멀티 포인트 * 선택과 μm의 ² (그림 3E) 당 지방 세포의 수를 계산하고 계산을위한 각 셀을 표시합니다.
   11. 지방 세포의 크기를 확인하려면 도구 모음에서 다시 * 직선 *를 선택하고 지방 세포 (도 3c)의 직경을 그립니다. 분석으로 이동 -> 측정 및 새 창이 나타납니다 μm의에서 지름의 길이.
   12. 지방 세포 영역을 확인하려면, * 지팡이 (추적) 도구 *를 선택하고 지방 세포 내부를 클릭합니다. 지방 세포의 내벽은 적색 (도 3d)으로 선택된다. 분석으로 이동 -> 측정 및 새 창이 나타납니다 μm의 ^2에서이 지방 세포의 면적.

도 3. 지방 패드 부에서 지방 세포의 특성을 분석하는 명 시야 현미경으로 고지방식이 (HFD) 또는 일반식이 (ND)으로 처리 수컷 생쥐 perigonadal 지방 패드의 단면 사진 (a); ImageJ에의 1.48v로 정량화, 영역 (D) 및 mm ² (E) 당 지방 세포의 세포 수, 임계 값은 검은 색과 (b)는 흰색과 지방 세포의 크기 (C 길이)로 조정된다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 4 : AT 섹션의 면역 조직 염색에 사용되는 각각의 희석 된 항체.

표 5 : 면역 조직 염색에 사용되는 희석과 이차 항체.

지방 세포 항상성의 생체 외 분석 2. 저산소증의 영향

1. 쥐를 희생하고 피하 지방 조직을 제거합니다.
   1. CO ₂ 질식 이후 경추 탈구로 쥐를 희생.
   2. 그림 4에 도시 된 바와 같이. 생쥐의 사지를 고정 상부 다리, 허리 및 측면에서 피부를 분리하고 그림 4와 같이 바늘을 아래로 핀. 다음의 기지에 후방있는 피하 지방 조직을 제거 도 4에 도시 된 바와 같이 (사타구니 림프절 주변 뒷다리, 좌 : 피하 지방 패드화살표로 나타내는 s는; 우 : 화살표 서혜부 림프절).

그림 4 : 피하 지방 패드의 위치. 피하 지방 패드의 사진; 왼쪽 화살표 피하 지방 패드를 표시하고 오른쪽 화살표가 서혜부 림프절을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 분리 된 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)는 앞서 설명한 ^20.
3. 시드 ADSC 이글 개변 둘 베코 4,000 세포 / cm ² 중간 햄 F-12 10 % 정상 송아지 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.5 % 암포 테리 신 B, 16 μM 바이오틴 18 μM 판토텐산 100 μM 아스코르브 산 보충 및 약 70 ~ 80을 합류하는 문화를 성장문화의 4 ~ 6 일 후에 도달 %.
4. 지방 세포 분화를 유도한다.
   1. 치료 트립신 표면으로부터 부착 ADSC를 제거합니다.
      1. (세포 표면에서 분리 될 때까지), 매체를 제거 PBS로 씻어 0.025 % 트립신 솔루션을 추가 2 분 (37 ° C로 예열). 즉시 매체를 추가하고 세포를 씻는다.
   2. 노이 바 우어 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
      1. 노이 바 우어 챔버의 중앙 영역에 유리 덮개를 넣는다. 세포 현탁액 1:10 희석 세포 현탁액 희석 10 μl를 함께 실을로드합니다. 코너에 위치한 4 개의 사각형, 16 작은 사각형으로 구성된 각 셀을 계산합니다. ml의 당 세포 수를 계산 :
         
   3. (4-6 일 후에 도달) 12- 웰 배양 플레이트 (2.2 점에서 설명)과 약 70 내지 80 %가 합류하는 배양 성장 시드 ADSC.
   4. adipoge을 유도5 μg의 / ㎖ 인슐린, 1 μM 덱사메타손 및 배양 5 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 (IBMX)을​​ 첨가하여 분화 NIC. 2 일마다 배지를 갱신. 세포는 완전히 7 일 후 차별화됩니다.
5. 지방 세포 분화, 성숙 지방 세포의 중성 지방을 얼룩 오일 레드 O와 얼룩을 분석합니다.
   참고 : 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다!
   1. , 매체를 제거 PBS로 부드럽게 지방 세포를 씻어 2 ml의 10 % 포르말린 60 분 동안 세포를 고정합니다.
   2. 오일 레드 O 염색 용액을 조제 증류수 2 부와 적색 오일 O 스톡 용액 (100 ㎖ 99 %의 이소프로판올에 용해 된 300 mg의 적색 오일 O 분말) H ₂ O 3 부를 혼합하고, 실온에서 10 분 동안 배양. 0.2 μm의 주입 필터를 통해 오일 레드 O 작업 솔루션을 필터링합니다.
      참고 : 작업 용액을 2 시간 동안 안정하다.
   3. 석유 레드 O 염색 들어, 포르말린을 제거 H ₂ 지방 세포를 씻어
   4. 100 배 배율의 위상차 현미경 판을 평가한다. 지방 세포의 지질이 빨간색으로 표시되고 핵은 파란색 표시됩니다.
6. 선택 단계 : shRNA를 가진 형질 전환에 의해 관심의 유전자를 침묵입니다.
   1. 매체를 변경하고 무 혈청 배지를 추가합니다.
   2. 지방 세포의 형질를 들어, 리포 펙을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 12 웰 조직 접시 당 1 μg의 shRNA를 사용합니다. 지질-DNA 복합체의 첨가 후, 37 ° C에서 48 시간 동안 지방 세포를 배양한다.
7. 저산소증 실시 지방 세포를 분석하는, 저산소 조건 하에서 세포를 유지하는 저산소 워크 스테이션 또는 저산소 배양기를 사용한다. 연구의 따라, 저산소증의 C0.5, 1 또는 2 %의 산소 수 울드.
   1. FITC 표지 넥신 V 및 세포 계측법 분석 이후의 흐름에 의해 세포 사멸을 분석합니다.
      1. , 여분의 소프트 셀 스크레이퍼로 지방 세포를 수집 PBS로 세척하고 100 μL의 넥신 V 결합 버퍼에 1 × 10 ⁶ 세포를 추가 (10 mM의 헤 페스 / 수산화 나트륨, pH 7.4의 140 mM의 NaCl을 2.5 mM의 염화칼슘 _2). 제조자가 권장 넥신 V-FITC의 양을 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
      2. 측정 유동 세포 계측법를 들어, 아 넥신 V 결합 버퍼 μL (200)를 추가하고 핵 Counterstain과의 1 μM. 녹색과 보라색 채널에서 형광을 결정합니다. 아 넥신 V ⁺ / 핵 Counterstain과 ⁺ 세포는 보조 괴사 및 아 넥신 V ⁺ / 핵 Counterstain과 같이 정의된다 ^- 세포 사멸 세포로 정의된다 (그림 5).
   2. 정량적 저산소 조건에서 항상성을 결정하는 지방 세포 RN​​A의 수준을 분석한다.
      1. 더하다1 ml의 단상 아니라 각 구아니딘 이소 티오 시아 네이트와 페놀의 솔루션 및 1.3.5.2에) Chomczynski와 사키 ^(17)에 의해 단일 단계 방법 (단계 1.3.2)를 사용하여 상기 RNA를 분리하고 단계 1.3.2.1에서와 같이 진행) .

그림 5 : 유동 세포 계측법에 의해 지방 세포 사멸 분석. V-FITC와 지방 세포의 TO-PRO-3 염색 넥신.에 대한 FACS의 도트 플롯 프리젠 테이션 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

우리의 예를 사용하여 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 항상성을 결정하는 방법을 보여 훌라을-2 FL / FL 야생형 한배 새끼에 비해 Fabp4-CreERT 마우스. 우리의 프로토콜은 증가 된 지방 세포의 세포 사멸에 의해 지시 된 바와 같이 저산소증에 의해 증가 HIF의 발현이 지방 세포의 기능 장애와 관련되는 방법을 정의합니다.

고지방 다이어트에 증가 된 지방 세포의 크기와 영역 (HFD) 처리 된 마우스

과잉 영양, 다른 요인들, 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포의 비대, 발생합니다. 지방 세포의 크기와 영역은 비대의 지표이다. 정상에서 지방 패드의 섹션 (ND;도 6a)와 높은 지방 다이어트 (HFD도 6B) 육주 후 지방 세포의 크기와 지역의 마우스뿐만 아니라 정량화 명확하게 표시 지방 세포의 비대HFD 처리 된 마우스 (도 6c 및 d) 증가 지방 세포의 크기에 의해 표시된다 HFD의 S.

성인의 지방 조직 (AT)에서 증가 저산소증 프라 -2- FL / FL-Fabp4 CreERT 마우스 증가 HIF-1α의 레벨 및 지방 세포 자멸사에 이르게

AT에서 저산소증의 생체 상태를 확인하려면 훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 12 주 세의 나이에 훌라-2 삭제 후 육주 분석 야생형 한배 새끼와 비교된다. Pimonidazole 복강 효과적인 저산소증 마커와 마우스에 투여; 그 독성 및 AT에 분배 할 수있다. 생체 내에서 AT에서 저산소 지방 세포는 면역 항체 염색 (도 7a)에 의해 정의된다. 또한, 쥐에서의 증가 된 AT 저산소 상태가 증가 HIF-1α 긍정적 ADIP 수반HIF-1α 발현 및 대상 유전자 (9)의 정량화에 의해 확인 된 면역 염색도 7b)로 나타낸 바와 같이 ocytes. 또한, 훌라-2에서 AT 섹션의 TUNEL 염색 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼 (그림 7C) 지방 세포의 세포 사멸이 저산소증과 HIF-1α 식의 존재와 상관 관계가 증가 보여줍니다.

저산소증에 의한 지방 세포의 세포 사멸을 통해 차 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가

다른 20 바와 같이 시험 관내 지방 세포 사멸을 분석하기 위해 피하 지방 패드에서 생성 된 지방 세포를 사용한다. 예상대로, 지방 세포에서 HIF-1α 발현은 저산소증 (그림 8a)의 24 시간 후에 증가한다. 상기 HIF-1α 활동 HIF 표적 RNA의 수준을 분석이러한 iNOS의 (유도 성 산화 질소 합성 효소)와 같은 유전자 qPCR에 의해 정량화된다.도 8b는 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현 증가는 iNOS의 mRNA 발현 증가에 이르게 것을 보여줍니다. 우리가 이미 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 지방 세포의 세포 사멸과 관련이 증가 생체 내 (그림 8)에 도시 한 이후, 세포 사멸은 저산소 조건에서 넥신 V 염색으로 체외 문화에서 계량입니다. 생체 데이터 (도 7)과 일치하는, 증가 된 HIF-1α의 레벨은 저산소 조건에 의해 유도되는 증가 된 지방 세포가 아폽토시스 (도 8b)를 수반한다. 또한, 그 저산소에 의한 세포 사멸을 증명하는 HIF-의존; HIF-1α 또는 HIF-2α는 야생형 또는 훌라-2 결핍 생쥐에서 파생 된 지방 세포에 RNA 간섭에 의해 침묵된다. 넥신 같이 증가 된 지방 세포 사멸은 HIF-1α 또는 HIF-2α 입을 의해 복원 저산소증 센서 HIF-α는 지방 세포 사멸을 조절하는 것을 증명도 8b에 V 염색.

그림 6 : 높은 지방 다이어트 (HFD) 쥐의 지방 세포의 크기와 면적 증가 정상적인 다이어트 (ND)가 공급 남성 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 섹션 (A, B) H & E 염색 (a) 또는 높은. 지방질 다이어트 (HFD) (b)에 육주합니다. 바는 500 μm의를 나타냅니다. (c, d) (b) 6- 주 ND (a) 또는 HFD가 공급 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 지방 세포의 크기 (C) 및 영역 (D)의 정량화. N = 10 데이터는 SEM ±로 평균 값을 나타낸다. 통계 분석은 Student's의 t -test를 사용하여 수행 하였다. *** p <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 성인의 지방 세포에서 증가 HIF-1α 수준 및 세포 사멸 그림 7. 저산소증 (a)와 HIF-1α 남성 훌라-2 FL / FL Fabp4-creERT 마우스 남성 제어 한배 새끼 육주 후 타목시펜 주입의 AT (b)에서 염색. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 저산소 영역과 HIF-1α 양성 세포를 나타냅니다. (c)에서 TUNEL 염색 훌라-2 FL / FL 타목시펜 주입 후 6 주에 Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 이 수치는 루터 등에서 수정되었습니다알. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 8. 저산소증에 의한 차 지방 세포에서 증가 HIF-1α 발현 및 지방 세포 자멸사 저산소 챔버에 넣고 차 지방 세포에서 HIF-1α와 HIFs 대상 iNOS의 mRNA 수준의 (a) 실시간 PCR 분석은 지정된 시점에서 분석 하였다. 분리 주 지방 세포에서 넥신 V FACS 염색에 의한 세포 사멸의 (b)에 정량 훌라-2 FL / 플라이 쉬 제어 또는 HIF-1α 또는 HIF-2α에 대한 쉬 플라스미드로 형질과 저산소증 아래에 배치 Fabp4-CreERT 마우스 또는 야생 형 제어 24 시간 동안 (1 % O 2). 이 수치는 루터 등의 알에서 수정되었습니다. T- 테스트를 사용하여 수행 하였다 ±로 평균 값을 나타낸다. * P <0.05 ** P <0.01 상당한으로 인정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 아무것도 없어.