방법 논문

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

14.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53828

⸱

2016년 2월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, The University of Melbourne, 2Melbourne School of Engineering, The University of Melbourne, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 성체 마우스에서 결장 운동성의 신경 조절 변화를 식별하기 위한 비디오 이미징 기술과 고해상도 시공간 매핑에 대해 설명합니다. 위장관(GI) 기능에 대한 미묘한 영향은 위장관 질환에 대한 이해를 증진하기 위해 분리된 조직 제제에서 이 접근법을 사용하여 감지할 수 있습니다.

초록

장용성 신경계 (ENS)가 위장관 운동성 조절에 중요​​한 역할을 독립적 중추 신경계 기능 할 수있다. ENS 기능의 변화는 GI 증상과 질병의 주요 원인이며, 자폐증을 포함한 신경 장애에보고 GI 증상에 기여할 수있다. 잘 격리 대장 세그먼트 대장 이주 모터 단지 (CMMCs)로 알려진 자연, 리듬 수축을 생성하는 것으로 설정됩니다. 절차는 마우스 콜론의 생체 준비가 설명되어 전에서 CMMCs의 장 신경 규제를 분석합니다. 콜론은 동물로부터 해부 이전 기관 화장실에서 유관되기 배설물 콘텐츠를 삭제 플러시됩니다. 데이터는 장기 조 위에 배치 비디오 카메라를 통해 취득한 실내 소프트웨어 패키지를 통해 고해상도 시공간지도로 변환된다. 이 기술 기준 수축 패턴과 대장의에서 ENS 기능에 약리학 적 효과 사용egments은 3 ~ 4 시간에 걸쳐 비교 될 수있다. 또한 CMMCs 전파 길이 및 속도 장 직경 수축 주파수의 변화뿐만 아니라, 기록 될 수있다. 이 기술은 형질 전환 마우스 모델 (쥐와 기니피그를 포함하여 다른 종에서) 위장관 운동 패턴을 특성화하는 데 유용합니다. 이러한 방식으로, CMMCs의 약리학 유발 변화는 야생형 마우스와 자폐증 Neuroligin -3- R451C 마우스 모델에 기록된다. 또한,이 기술은 십이지장, 공장과 회장과 쥐를 포함하여 다른 발달 연령대 위장관의 다른 영역에 적용될 수있다.

서론

장용성 신경계 (ENS)가 위장관 극한 신경 네트워크 인 장과 같은 내용의 소화, 영양소의 흡수 및 분비 유체의 재 흡수와 같은 다양한 기능을 변조한다. ENS의 뉴런은 myenteric 및 점막하 plexuses에 있습니다. myenteric 신경 얼기는 점막하 신경총 반면 위장관 운동 1 조절에 중요한 역할을 분비 2,3의 제어에 주로 참여하고있다. myenteric 신경 얼기는 위장 벽의 길이 원형 근육 층 사이에 위치해 있습니다. 장 벽의 평활근 층의 수축 활성 혼합 부위 (3)의 길이 방향을 따라 장 콘텐츠를 추진하여 위장관의 주요 기능을 용이하게한다. CNS에서 위장관에 외부 신경 공급 장치는 생체 내에서 위장 기능에 기여하지만상기 ENS 독립적 위장 기능을 조절할 수있다. 이 독특한 특징은 기능성 장 신경 회로의 조사 및 생체 위장관 운동에 기여를 할 수 있습니다.

대장 마이그레이션 모터 단지 (CMMCs)는 배설물 펠렛 4-9의 부재에 고립 된 마우스 콜론에서 관찰 된 주된 모터 패턴입니다 자연, 신경 인성 이벤트입니다. CMMCs는 10 (직장에 맹장에서, 예) 적어도 콜론의 절반 전체 길이의 수평 거리를 따라 전파 리듬 수축으로 정의됩니다. CMMCs 분변 펠릿 추진 수축 패턴 사이의 관계가 아직 명확하게 확립 될 그러나 일부 약리학 차이 (11)이보고되었다. 그럼에도 불구하고, CNS 독립적으로 기능 할 ENS의 능력 IS에 신경 매개 모터 패턴의 존재olated 대장은 기본 ENS 장애로 인한 운동에 장애를 검사 할 수있는 이상적인 분석 시스템을 제공한다. 위장 운동 패턴의 자발성은 약리학 적 자극에 응답 기능 변화가 평가 될 수 있습니다.

비디오 이미징 시공간 맵핑의 사용 제 정량적 기니피그 12 소장의 연동 운동을 조사하기 위해 개발되었다. 여기서, 생체 외 기술은 고해상도를 구성하는 비디오 이미징이 녹화 분석을 사용하여 마우스 대장 운동 패턴 조사를 가능하게한다는 설명 (~ 100 μm의 33 밀리 초) 결장을 따라 위치의 함수로서 대장 직경 맵 시간 (시공간지도)의. 사내 에지 검출 소프트웨어 사용 (Analyse2, 요청시 제공)을 실시간으로 계약 전체 길이 대장 세그먼트의 데이터는 각 실험에 대한 시공간 맵을 생성하는 처리됩니다. 이 단계에서, 비디오 (AVI) 파일이다 최우수통해서 인증 및 Analyse2를 사용하여 시공간지도로 변환. 시공간지도 (그림 2) 시간이 지남에 따라 수축력을 묘사하고 전파 속도, 크기, 길이, 시간을 포함하여 여러 매개 변수를 측정 할 수 있습니다. 굿 직경은 조직 세그먼트의 전체 수축의 척도로서 실험 기간에 걸쳐 기록된다. 이 방법은 변형 된 장용성 신경 연결을 나타낼 수 수축성 착체의 개시 시점의 차이를 식별하는 데 적용될 수있다.

기니 피그에서 펠렛 추진력을 평가하기위한 유사한 비디오 이미징 프로토콜 그러나 여기에서는 (펠릿의 부재, IE) 자발 결장 운동성 정량 비디오 촬영 방법의 응용 윤곽 (13)에보고되었다. 또한 비디오 촬영 방법에 대한 해부 위장 조직의 준비를 돕기 위해 상세 내용을 제공한다. 이프로토콜은 유전 마우스 모델을 포함 질환의 동물 모델에서 위장 기능의 장 신경 제어를 분석하는 접근하고 쉽게 복제 도구와 연구자를 제공합니다.

비디오 이미징 기술은 다양한 약리학 적 제제에 응답 대장 운동의 분석을 가능하게한다. 약물 제제 결장 외부 장 루멘 또는 기관 욕을 통해 투여 될 수있다. 마우스 위장관의 다른 지역은 대장에서 소장 분할 및 CMMCs으로 특정 운동 패턴을 나타낸다.

이 기술은 소장 함수 균주의 차이를 식별하는 데 사용되었다; 5-HT 3 및 5-HT 4 길항제 차동 감도 때문에 6 개의 균주에서 발현 TPH2 유전자의 다형 특성을 Balb / C 및 C57 / BL6 마우스의 소장에서 관찰되었다. 운동성에 대한 5-HT의 억제 효과는 콘 유지troversial, 충돌 데이터가 대장 연동 운동과 CMMCs 14, 15에 내인성 5-HT의 중요성에보고 된 바와 같이. 운동성 전 및 출생 7 개발 중에 변경, 질병 (10)의 동물 모델에서 위장관 운동에 유전자 돌연변이의 효과는 비디오 영상을 이용하여 조사 할 수있다. 여기에서 우리는 시냅스 접착 단백질 Neuroligin-3 (16)을 코딩하는 Nlgn3 유전자의 과오 돌연변이를 표현 자폐증의 NL3 R451C 마우스 모델에서 대장 운동의 연구 방법의 사용을 보여줍니다. 이 돌연변이는 첫 번째 강하게 GI 부전 18-22와 관련된 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) (17), 진단 환자에서 확인되었다. 우리 NL3 R451C 시냅스 돌연변이 비디오 이미징 기술을 사용하여 신경 ENS에 출력에 영향을 미치는지 알아 보았다. 우리는 기준선 및 세로토닌 5H에 응답 CMMCs 특성화 데이터를 제시T 3/4 수용체 길항제 tropisetron 자폐증의 NL3 R451C 마우스 모델에서.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

동물 처리 및 동물의 자궁 전위 모든 실험 이전했다 엄격 멜버른 대학의 동물 실험위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행 (윤리 ID : 1212494.7)

1. 조직 수집 및 해부

  1. 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 가능하면 관심의 신경 세포 인구에있는 수용체를 통해 장 기능에 영향을 방지하기 위해 마취를 피할 수 있습니다.
  2. 몸을 고정, 동물의 총 체중을 기록 피하 주사 바늘을 (크기 : 20 G)를 사용하여 견고하게 해부 보드 (네 발을 통해 복부 측면은 실험에 노출).
  3. 해부 집게와 가위를 사용하여; 하복부 근육 층을 중첩 표피를 통해 절개를합니다. 흉골에 복부의 정중선을 따라 복강을 열고 집게와 가위를 계속 사용합니다.
  4. 조직의 탈수를 방지하기 위해, 그 풍모를 부어학적 식염수 (크렙스 용액 118의 NaCl, CaCl2를 1.2 황산, 하나의 NaH 2 PO 4, 25의 NaHCO3 4.6의 KCl, 2.5, (11) D- 글루코스 밀리미터로 - carbogen 가스 RT으로 발포, 95 % O 2, 5 해부 과정에서 일정한 간격 (즉, 모든 30 ~ 60 초)에서 복부 내용 상에 20 분의 최소)에 대한 %의 CO 2.
  5. 맹장과​​ 직장에 연결된 상태에서 콜론을 분리, 미세 해부 가위를 사용하여 장간막을 트리밍하면서 부드럽게 약 4-5cm 동물의 몸 위에 해부 집게를 사용 (콜론의 기단부에 인접) 맹장를 개최합니다.
  6. 취급 않도록주의 늘리거나 인접 장간막을 제거하는 동안 위장 조직을 잘라.
  7. 초과 조직 (즉, 방광 및 고환)를 제거합니다. 거친 해부 가위를 사용하여, 두 개의 수직 절개 (즉, 중간 선에서 약 0.5 cm)이 개에 골반 뼈를 절단 할 수 있도록콜론의 채널 측면.
  8. 골반 조직에 인접한에서 직장을 분리 결장에서 근육을 둘러싼 트림 미세 가위를 사용합니다.
  9. (이전에 carbogen와 산소) 생리 식염수가 들어있는 비커에 (직장에 맹장에서) 전체 길이 콜론을 놓고 실온에서 산소를 계속한다. 미세 해부 가위를 사용하여 맹장과 직장을 제거하고 비커에 교체합니다.
  10. 빈 배설물 펠렛 / 생리 식염수로 채워진 200 μL 피펫 팁에 연결된 5 ㎖ 주사기를 사용하여 경구 끝에 부드러운 양압을 적용하여 결장의 장내 콘텐츠 제제. 향후 조직을 배향하기 위하여, 점막 줄무늬가 보이 대장의 가장 기단부를 표시하는 곤충 핀을 사용한다.
    1. 면도날을 사용하여 넓은 / 기단부의 약 1cm을 제거하여 5 ㎖ 주사기 맞게 플라스틱 피펫 팁을 수정한다. 중앙에서 절단하여 원위 / 작은 단부를 넓혀, 유량을 증가시키기면도날을 사용하여 제작 (대략 45 ° C).
  11. 그립을 부드럽게 해부 포셉과의 기단부의 대장 조직, 루멘을 통해 대장 및 세척 생리 식염수의 루멘에 피펫 팁을 삽입합니다.

비디오 영상에 대한 대장의 조직과 실험 세트 최대 2. 준비

  1. 200 μL 피펫 팁에 부착 된 주사기를 사용하여 설정이 챔버 장기 목욕 (그림 1과 그림 3)에 연결된 모든 튜브를 통해 세척 생리 식염수. 이 단계는 액의 흐름을 차단할 수 배관 내의 이물질을 제거한다. 튜브에 대한 사양은 재료 표를 참조하십시오.
  2. (5 ㎖ 분 -1의 유량, 95 % O 2 5 % CO 2) 장기 목욕의 챔버가 지속적으로 carbogen 버블 생리 식염수에 superfused되어 있는지 확인합니다. 일정한 간격으로 온도 센서를 이용하여 확인 temperat목욕 URE 33 ° C -37 ° C 사이에서 유지된다.
  3. 약 20 내지 30 ㎖의 생리 식염수 50 ㎖ 주사기를 이용하여 주입 관에 3 방향 코크를 통하여 접속 유입 저장조를 채운다.
  4. 실험이 진행되는 동안, 그 중심에 삽입 유리관 (내경 5mm)와 스토퍼 arubber 사용 유입 저장조 내의 압력을 유지한다. 유입 저수지의 상부 개구 안전하게 (내부 유리관이 개봉 나머지으로) 밀봉되어 있는지 확인합니다.
  5. 완전히 생리 식염수에 빠져들되어 있는지 확인하고, 장기 목욕 챔버로 콜론 (길이 5-7cm)을 놓습니다.
  6. 두 수중 입구 / 출구 관에 결장 세그먼트의 각 단부 Cannulate (입구 / 다른 직경의 배출 튜브 조직 루멘 등의 크기에 따라 변경 될 수있다. 산후 조직 성인 마우스 및 기니피그) 조 사용 표준을 면 재봉사. 취입 관에 결장의 기단부를 부착배출관로 결장의 말단부 (수직 유출 관에 3 방향 코크를 통하여 접속, 높이 6cm). 조직 삽관 미래의 측정 및 분석의 간섭을 피하기 위해 후하지 심하게 잡아거나 너무 편안 있는지 확인합니다.
  7. 근위 및 15cm 눈금자를 사용 삽관 선단부 사이의 거리를 측정하여 대장의 길이를 기록한다. 이 수축 길이 전파 속도와 수축 개시 포인트의 변화를 해석하는 것이 중요하다.
  8. 실험을 시작하기 전에 설립 안정된 기준 내강의 압력 (cm의 H 2 O)를 확인합니다. (경구)의 유입 탱크 수직 유출 관 (항문)의 유리관 내에서의 생리 식염수를 메 니스 커스에 조직으로부터의 수직 거리를 측정함으로써 내강의 압력을 계산한다.
  9. 일정한 관내 압력에서 조직 준비를 유지한다 (예를 들어, 1-2cm H 2 O) 보장에 의한 유입 스토퍼 실 pressu다시 일정하게 유지 않고 막힘이 셋업에 존재하지 않는 것이다.
  10. 장 운동을 녹음하기 전에 30 분 동안 생리 식염수에 평형을 콜론을 둡니다. IN- 또는 유출 튜브에서 발생하는 방해를 확인하고 유입 저수지를 통해 압력을 적용하거나 대장의 구강 및 항문 끝을 다시 cannulating에 의해 제거합니다.

3. 이미지 캡처 및 실험 프로토콜

  1. 비디오 카메라를 이용하여 영상 파일로서 기록 장 운동 (30 프레임 / 초, 640 × 840 픽셀) 표준 실험실에서 레토르트 기관 욕을 10 내지 15 센티미터 (도 1) 스탠드의 위치.
  2. 바탕 화면의 아이콘에서 가상 더빙 (비디오 캡처 소프트웨어)를 엽니 다. '파일'탭에서 카메라 영상을 볼 수 있습니다 '캡처 AVI'를 선택합니다. '오디오'탭을 선택 해제에 사운드를 해제하는 '오디오 캡처 수 있도록'.
    1. 비디오 탭에서 '압축'과 'DivX6.9.2을 선택합니다. 코덱 & #39; 저장 공간의 사용을 최소화하는 비디오 파일을 압축한다. 이 기능은 압축 소프트웨어 'DivX를'설치에 사용할 수있게됩니다.
  3. 전체 결장 삽관 세그먼트는 비디오 캡처 소프트웨어 창을 통해 (상기 비디오 프레임의 수직 에지에 바로 인접 영역으로 삽관)을 볼 수 있도록 수동으로 카메라의 위치를 조정 (도 1 참조). 이미지 품질을 개선하고, 반사를 최소화하기 위해, 기관 욕에 외광을 차단하는 카메라 지지체 종이 / 판지 실드를 부착. 카메라 소프트웨어 인터페이스를 이용하여 휘도, 콘트라스트 및 노출 설정 값을 조정하여 비디오 품질을 최적화한다.
    1. 녹음하기 전에 특정 파일 이름을 설정; '파일'탭에서 '설정 캡처 파일'을 선택하고 비디오의 고유 한 이름을 지정합니다.
    2. '캡쳐'도구 모음에서 '캡처 파일'을 눌러 비디오 캡처를 시작합니다. recordin를 중지하려면g을 '캡처 중지'버튼 또는 키보드의 'Esc'키를 선택합니다.
  4. 신선한 생리 식염수 매 30 분으로 유입 저수지에 포함 된 생리 식염수를 교체합니다.
    1. 기록 내강의 압력 (2.9 참조) 온도 프로브를 사용은 장기 목욕 온도의 주를 가지고. 이러한 변수가 일정한 것을 확인하기 위해 실험 (즉, 매 30 분)에 걸쳐 이러한 단계를 반복합니다.
  5. (약물 응용 프로그램과 세척 시간 포함) 3 시간 동안 총 기록 대장 활동. 데이터 저장을 위해, 15 분의 비디오 세그먼트의 기록 데이터 용. 전체 실험은 전형적으로 12 X 15 분간 비디오 레코딩 구성 될 것이다.
    1. 제어 조건 하에서 1 시간 (생리 식염수) 녹음 활동.
    2. 1 시간 30 분 동안 약물 (어느 유입 저장조 통해 욕에 superfused 또는 내강 내로 투여)를 적용한다.
      참고 : 관리의 다른 경로를 수 y로다른 효과 (23)의 ield.
    3. 1 시간 세척 기간 동안 목욕이나 루멘에 신선한 생리 식염수를 적용합니다.

시공간지도 4. 데이터 처리 및 생성

  1. 과정은 MATLAB로 작성된 사내 소프트웨어를 사용하여 각각의 비디오 녹화 오프라인, 위해 (R2012a 버전 7.4의 요청에 따라 가능) 대장 운동을 설명 시공간 맵을 생성합니다.
    1. 바탕 화면의 아이콘에서 열기를 분석 소프트웨어.
    2. 명령 창에서 분석 제어판을 열기 위해 "Analyse2"를 입력합니다.
  2. 제어 패널 윈도우에서 "아비 파일 에지 검출"을 클릭하여 시공간 맵을 생성하는 에지 검출 기능을 이용한다. 이 함수는, 오디오 비디오 인터리브 (AVI) 형식의 비디오 레코딩을 읽고 분석 소프트웨어를 사용한다.
  3. ADA를 이용하여 시공간 맵을 생성하기 위해 순차적으로 다음 단계를 수행ptive 에지 검출 알고리즘입니다.
    1. "파일 추가"탭을 선택하여 열기 녹화 된 비디오 파일은 '동영상 열기'를 선택하고 비디오 파일의 위치를​​ 선택합니다.
    2. 분석 소프트웨어 내에 나와있는 비디오 파일에서 관심있는 파일을 선택합니다.
    3. 콜론 항문 삽관 경구 삽관 된 지점에서, 비디오, 예를 들면 대장의 전체 길이의 프레임 내의 관심 영역의 사각형을 선택. 근위 및 원위 삽관 포인트는 관심 영역의 수직 경계에 인접한 있는지 확인합니다. 에지 검출 선 (적색 및 녹색)이 자동으로 실시간 영상에 나타날 것이다.
    4. 에지 검출 임계치 라인 결장 조직의 상부 및 하부 경계 모두에서 대장 (이 조작부 검출 임계 값을 변경하여 각각의 비디오에 대해 최적화 될 수있다)에 바로 인접하여 있음을 보장한다. 확인 에지 검출 L 그네스 명암 및 밝기를 조절 조작부를 사용하여 결장 영상의 길이를 따라 연속적이다.
    5. 폭 대화 상자에 콜론 (mm)의 전체 길이 (단계 2.7에 기록 된대로)를 입력합니다. 그런 다음 "열 맵을 생성"을 선택합니다.
    6. 파일이 저장 될 때까지 팝업 창에서 위치를 선택하고 시공간지도의 파일 이름을 지정합니다.
    7. '.su2'형식을 선택하고 '대기열에 추가'.
      참고 .su2 포맷은 파일 크기 및 다수의 비디오 파일이 큐에 추가 될 수있는 데이터를 압축한다.
    8. 시공간 맵을 생성하기 위해 '검색을 시작하기'를 선택합니다.

시공간지도 5. 분석

  1. 이러한 주파수, 전파 속도, 길이, CMMCs 기간, 장 직경 시작과 수축 방향의 지점으로 매개 변수를 추정하기 위해 시공간지도를 활용합니다.
    1. 시공간 분석을 시작하려면지도는 명령 창에 입력 한 'analyse2'이전 섹션에 설명 된대로. 대신 "에지 검출"의, "히트 맵 분석"버튼을 선택합니다.
    2. '파일 추가'탭을 선택하고 이전에 .su2 얻은 파일의 위치를​​ 지정하여 열기 시공간 맵 파일 (.su2 파일).
    3. 시공간 맵이 화면에 표시되면, 최소 1로 설정되는 것을 보장 조작부 색상 범위를 지정.
      최대 조직의 수축에 따라 5-10 배열 할 수 있습니다.
    4. 동일한 조건에서 분석 한 실험에서 모든 맵을 보장하기 위해 '잠금 색상 범위'를 선택합니다.
    5. 시간 프레임 설정이 주어진 실험에서 모든 시공간지도에 대해 일정 있는지 확인합니다.
  2. CMMC 주파수를 결정하기 위해 수동으로 결장의 길이의 50 % 이상을 통과 수축을 계산. 이러한 수축은 visua 될 수 있습니다시공간지도에 레드 / 오렌지 줄무늬 (표준 HSV 색상 색인)로하게 안정적 (예를 들어 그림 2 참조). 짧은 또는 전파되지 않는 기타 수축도 확인하고 정량화 할 수있다.
  3. 원한다면,이 맵으로부터 높은 해상도로 더 해석을 수행. 예를 들어, 각 속도와 수축의 지속 기간을 포함하여 상세한 특성을 조사 할 수있다.
    1. 속도 및 지속 기간을 측정하기 위하여, 열지도 분석 조작부 "수축 파 주석 '버튼을 선택한다.
    2. 다음으로, "줌"버튼을 클릭하고 관심 영역을 선택하여 각 CMMC을 확대. 그런 다음 각 수축의 끝 부분에 가장 초기 위치에서 선을 그립니다 마우스를 사용하여 각 수축에 주석을 "수동으로 주석"버튼을 선택합니다. 이 방법은 전파 나타나는 딜레이 션의 외관상의 전파 속도 및 시간을 측정하는데 사용될 수있다 (예를 들면, 볼그림 2A, 2B)의지도 알 끝.
      참고 : 속도와 지속 시간에 대한 데이터가 결과 창에 표시됩니다. 이 값은 "데이터 내보내기"탭을 선택하여 관심의 스프레드 시트로 전송할 수 있습니다. 원하지 않는 주석은 "선택한 주석을 제거"버튼을 클릭하여 제거 할 수 있습니다.
  4. 원한다면, 작은 수축 또는 CMMCs의 개시 위치를 결정하는 X 및 시공간 맵 Y 좌표 (결장 따라 시간과 위치를 각각)을 이용한다.
  5. 마찬가지로 수축 사이의 간격을 결정하기 위해, 수축의 지속 기간을 측정하는 "주석"기능을 사용한다. 이전에, 이러한 결과는 "데이터 내보내기"탭을 선택하여 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다.
  6. 휴식 장내 폭을 측정하기 위하여, 열지도 분석 패널 "단면을 가지고 '버튼을 선택한다.
    1. 선택 '추가9; 시간적 단면 패널. 맵 내의 임의의 위치에서 더블 클릭하면 열지도에 중첩 수평 라인을 생성합니다. 굿 직경 데이터는 이제 새로운 창에 표시됩니다.
    2. 장 직경을 측정하기 위해 특정 실험 조건에 대한 평균 장 폭을 얻기 위해 피크 인접한 통에 커서를 배치. 장 직경의 변화는 실험 조건 사이에 비교 될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

ASD 환자의 90 %까지 설사, 변비 18,24,25 포함한 위장 장애의 배열을 경험한다. 그러나 이러한 위장관 문제의 근본 원인은 알려져 있지 않다. ASD 환자에서 확인 된 많은 돌연변이 시냅스 단백질이 시냅스 전달 또는 기능에 변경 및 장애에 기여과 연결되어 있습니다. 그러한 돌연변이는 세포 부착 분자 neuroligin -3- (NL3의 R451C)를 코딩하는 유전자에 ASD 17 개의 형제로 확인되었다. Neuroligin 단백질의 위치 451의 아르기닌 잔기 이러한 돌연변이 결과 시스테인으로 대체된다. 이 돌연변이 쇼를 표현 NL3 R451C 마우스는 해마 25, 27 내에서 증가 AMPA와 NMDA 수용체 매개 활동과 함께 체 감각 피질 16,26에서 GABA 중재 전송을 증가했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 비디오 이미징 기술을 사용하여, CMMC 주파수 야생형 결장 운동성 표시 및 NL3 R451C 마우스 자폐증 스펙트럼 장애 (17)의 마우스 모델로 측정 하였다. 우리의 결과는 NL3 R451C 쥐는 Tropisetron에 감도 증가를 나타낼 것으로 제안 5HT 3/4 Tropisetron 수용체 길항제의 존재 하에서 야생형 마우스에 비해 돌연변이 NL3 R451C 생쥐 CMMCs 수의 감소를 나타낸다. 이에 따라 neuroligin -3- R451C 돌연변이 잠재적 장용성 뉴런 점막 또는 모두 5HT 3 5HT 4 수용체 기능 중 하나를 조절함으로써, 세로토닌 경로를 바꾸는 것을 제안한다. 이 유전자형 사이 및 후속 연구를위한 특정 목표의 식별을위한 표현형 차이를 식별하기위한 방법의 가치를 강조한다.

이 방법을 통해 비디오를 인수하여 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다

감사의 글

JCB 및 ELH-Y는 국방 CDMRP 자폐증 연구 프로그램의 미국학과 (AR11034)에 의해 지원되었다. 멜버른 신뢰의 ELH-Y.The 월 스튜어트 또한 Bursary - 대학 NHMRC (1047674)는 MS에 장학금을 후원. 우리는 기술적 공헌 알리 타 헤르, 파티마 Ramalhosa 및 그라시아 시거 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>시약
NaCl (MW: 58.44)Sigma-AldrichS7653-250G
KCl (MW: 74.55)Sigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)Chem 공급471-500G
MgSO4 .7H20 (MW: 246.48)Chem SupplyMA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)Chem SupplyCA033
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16)Chem SupplyGA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)Chem SupplyGA018-500G
NameCompany카탈로그 번호코멘트
Materials
2개의 챔버 장기 욕조
치수: 14cm x 8cm x 3cm		맞춤형접촉 실험실 직접 
  732 다목적 실란트 클리어Dow Corning Australia Pty Ltd1890573
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트 다우 코닝 Australia Pty Ltd1064291
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK STerumo Medical Corporation0912-2006
루어 잠금 팁이 있는 주사기 50 ml, 20 ml, 10 mlTerumo Medical CorporationN/A
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - 실라스틱 튜빙Masterflex508-008
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - 실라스틱 튜빙Masterflex508-005
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - 실라스틱 튜빙Masterflex508-007
1.60 mm (ID) - 플래티넘 경화 실리콘 튜빙 Masterflex96410 - 14
4.40 mm (ID) - 플래티넘 경화 실리콘 튜브 마스터플렉스96410 - 15 
3.10mm(ID) - 백금 경화 실리콘 튜브 Masterflex96410 -16
졸업 실험실 유리병 - 500 ml         써모피셔 사이언티픽 100-400
화학 고무 스토퍼 57 x 65 mm 
화학 고무 스토퍼 29 mm x 32 mm
온수기  (온도 조절기) 라텍 TH7000 
Logitech 웹캠Logitech
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Software
Virtual Dub - 1.9 11virtualdub.org
MATLAB R2012a 그래프 패드
Logitech 웹캠 소프트웨어Logitech

참고문헌

  1. Powell, A. K., O'Brien, S. D., Fida, R., Bywater, R. A. Neural integrity is essential for the propagation of colonic migrating motor complexes in the mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 495-504 (2002).
  2. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 286-294 (2012).
  3. Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Mechanisms underlying nutrient-induced segmentation in isolated guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G1162-G1172 (2007).
  4. Bush, T. G., Spencer, N. J., Watters, N., Sanders, K. M., Smith, T. K. Spontaneous migrating motor complexes occur in both the terminal ileum and colon of the C57BL/6 mouse in vitro. Auton Neurosci. 84, 162-168 (2000).
  5. Fida, R., Lyster, D. J., Bywater, R. A., Taylor, G. S. Colonic migrating motor complexes (CMMCs) in the isolated mouse colon. Neurogastroenterol Motil. 9, 99-107 (1997).
  6. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J Physiol. 587, 567-586 (2009).
  7. Roberts, R. R., Murphy, J. F., Young, H. M., Bornstein, J. C. Development of colonic motility in the neonatal mouse-studies using spatiotemporal maps. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, G930-G938 (2007).
  8. Spencer, N. J. Control of migrating motor activity in the colon. Curr Opin Pharmacol. 1, 604-610 (2001).
  9. Spencer, N. J., Bywater, R. A. Enteric nerve stimulation evokes a premature colonic migrating motor complex in mouse. Neurogastroenterol Motil. 14, 657-665 (2002).
  10. Roberts, R. R., Bornstein, J. C., Bergner, A. J., Young, H. M. Disturbances of colonic motility in mouse models of Hirschsprung's disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, G996-G1008 (2008).
  11. Tough, I. R., et al. Endogenous peptide YY and neuropeptide Y inhibit colonic ion transport, contractility and transit differentially via Y(1) and Y(2) receptors. Br J Pharmacol. 164, 471-484 (2011).
  12. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  13. Hoffman, J. M., Brooks, E. M., Mawe, G. M. Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM). J Vis Exp. , (2010).
  14. Smith, T. K., Gershon, M. D. Rebuttal from Terence K. Smith and Michael D. Gershon. J Physiol. 593, 3233(2015).
  15. Spencer, N. J., Sia, T. C., Brookes, S. J., Costa, M., Keating, D. J. CrossTalk opposing view: 5-HT is not necessary for peristalsis. J Physiol. 593, 3229-3231 (2015).
  16. Tabuchi, K., et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science. 318, 71-76 (2007).
  17. Jamain, S., et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet. 34, 27-29 (2003).
  18. Chaidez, V., Hansen, R. L., Hertz-Picciotto, I. Gastrointestinal problems in children with autism, developmental delays or typical development. J Autism Dev Disord. 44, 1117-1127 (2014).
  19. Ibrahim, S. H., Voigt, R. G., Katusic, S. K., Weaver, A. L., Barbaresi, W. J. Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics. 124, 680-686 (2009).
  20. Kohane, I. S., et al. The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS One. 7, e33224(2012).
  21. McElhanon, B. O., McCracken, C., Karpen, S., Sharp, W. G. Gastrointestinal symptoms in autism spectrum disorder: a meta-analysis. Pediatrics. 133, 872-883 (2014).
  22. Peters, B., et al. Rigid-compulsive behaviors are associated with mixed bowel symptoms in autism spectrum disorder. J Autism Dev Disord. 44, 1425-1432 (2014).
  23. Ellis, M., Chambers, J. D., Gwynne, R. M., Bornstein, J. C. Serotonin and cholecystokinin mediate nutrient-induced segmentation in guinea pig small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304, G749-G761 (2013).
  24. Parracho, H. M., Bingham, M. O., Gibson, G. R., McCartney, A. L. Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).
  25. Buie, T., et al. Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics. 125, Suppl 1. S1-S18 (2010).
  26. Etherton, M., et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).
  27. Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus. EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).
  28. Zhang, Q., et al. Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease. Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).
  29. Wang, J., et al. Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease. PloS One. 8, e67205(2013).
  30. Yang, H., et al. The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease. Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).
  31. Roberts, R. R., et al. The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal. J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).
  32. Barnes, K. J., Spencer, N. J. Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene? Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).
  33. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program. PloS One. 6, e19597(2011).
  34. Heredia, D. J., et al. Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1. J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).
  35. Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).
  36. Huizinga, J. D., et al. The origin of segmentation motor activity in the intestine. Nat Commun. 5, 3326(2014).
  37. Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus. J Physiol. 420, 247-265 (1990).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

TropisetronNeuroligin 3 R451C

관련 논문