멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Summary

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

Abstract

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 발현 및 국소화를 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 임상 및 연구 실험실 검출 기술입니다. 면역조직화학을 사용하여 발현을 채점하기 위해 많은 반정량적 시스템이 개발되었지만, 내재된 주관성으로 인해 결과의 재현성과 정확성이 제한됩니다. 또한, 핵 전사 인자(nuclear transcription factor)와 같이 공간적으로 중복되는 바이오마커에 대한 조사는 현재의 면역조직화학 기술로는 어렵습니다. 당사는 다중 면역조직화학(multiplexed immunohistochemistry) 및 다중 스펙트럼 이미징(multispectral imaging)의 고처리량 방법을 사용하여 여러 단백질을 동시에 조사할 수 있는 시스템을 개발하고 최적화했습니다. 다중화된 면역조직화학은 1차 항체와 horseradish peroxidase 또는 alkaline phosphatase에 접합된 2차 항체를 순차적으로 적용하여 수행됩니다. 관심 있는 각 단백질을 검출하기 위해 다양한 발색체가 사용됩니다. 염색된 슬라이드는 자동화된 슬라이드 스캐너에 로드되고 자동화된 이미지 획득을 위한 프로토콜이 생성됩니다. 스펙트럼 라이브러리는 각각에 단일 발색체가 있는 슬라이드 세트를 염색하여 생성됩니다. 대표적인 염색 이미지의 하위 집합을 멀티 스펙트럼 이미징 소프트웨어로 가져오고 이미지에서 조직 구획을 정의하여 조직 유형을 구별하는 알고리즘을 만듭니다. 세포 내 구획은 hematoxylin counterstain을 사용하고 intrinsic algorithm을 조정하여 세분화됩니다. 양성 및 단백질 공동 국소화를 결정하기 위해 임계값이 적용됩니다. 그런 다음 최종 알고리즘이 전체 조직 세트에 적용됩니다. 결과 데이터를 통해 사용자는 조직 유형(예: 상피 대 기질) 및 세포 내 구획(핵 대 세포질 대 원형질막)을 기반으로 단백질 발현을 평가할 수 있습니다. 공동 국소화 분석을 통해 이중 양성, 이중 음성 및 단일 양성 세포 유형을 조사할 수 있습니다. 다중 스펙트럼 이미징과 다중 면역조직화학 및 자동 이미지 획득을 결합하는 것은 조직 내 바이오마커를 조사하기 위한 객관적이고 처리량이 많은 방법입니다.

Introduction

면역 조직 화학 (IHC)는 조직 내 단백질의 검출을위한 표준 실험실 기술이며, IHC 여전히 널리 연구 및 진단 병리학 모두에 사용된다. IHC 염색의 평가 결과의 해석에 잠재적 인 편견을 도입, 자주 반 정량적이다. 많은 반 정량적 인 접근 방식은 최종 진단 ^1-4로 염색 강도 및 염색 정도를 모두 통합하는 개발되었다. 다른 시스템은 더 나은 식 ^(5)를 국산화하기 위해 채점 강도와 세포 내 위치를 포함한다. 다수 시청자의 평균 점수의 혼입은 종종 단일 뷰어 바이어스 ^(6)의 효과를 최소화하기 위해 이용된다. 이러한 노력에도 불구하고, 분석 주관 여전히 ⁷ 오염의 정도를 평가하는 특히, 남아있다. 인간의 입력에서 프로토콜 표준화 및 최소화 주관 정확하고 재현성 IHC 결과를 만드는 중요합니다.

콘텐츠 "> 조직 내 단백질 발현을 결정하기위한 IHC 이외에 다른 옵션이있다. 이러한 면역과 같은 다른 기술은 단백질 발현을 조사하는 금 표준으로 간주되는 동안 연구 설정 내 면역 전통적 단백질 지역화 ^8을 조사하는 수단으로 간주되어 . 결정 조직 또는 세포 구획 별 발현 조직 슬라이드 형광 항체의 사용은 합리적인 타협을 제공한다. 이러한 세포 분획 또는 레이저 캡처 미세 절제 <....

Protocol

참고 :이 프로토콜은 여기에 이전에 ^12,17,18 설명 염색 및 조직 마이크로 어레이 (TMA)의 분석에 대해 설명합니다. 4 μm의 두께 TMA 부는 표준 마이크로톰을 이용하여 파라핀 블록으로부터 얻었다.

참고 : 4 원체 및 Counterstain과에 대한 스펙트럼 라이브러리는 이미지 정량 생성해야합니다. 이를 위해, 각 항체에 대한 최적의 프로토콜은 슬라이드 당 항체 뺀 최종 Counterstain과 함께 실행한다. 다섯 번째 슬라이드는 스펙트럼 라이브러리를 만드는 데 필요한 5 이미지를 생성하기 위해 헤 마톡 실린 염색을해야합니다.

1. 멀티 플렉스 면역 조직 화학

1. 20 분 동안 60 ° C 오븐에서 구워 슬라이드. 화학 흄 후드를 사용하여 100 % 크실렌에 슬라이드를 담가. 자일 렌이 변화를 반복합니다. 5 분 동안 100 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 신선한 100 % 에탄올로 반복한다.
2. 3 분 95 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 신선한으로 반복95 % 에탄올. 3 분 동안 70 % 에탄올에 슬라이드를 담가. 3 분 동안 증류수에 슬라이드를 담가. 신선한 증류수로 반복합니다. 탭 슬라이드 수직 슬라이드에서 물을 드레인. 5 분 동안 즉시 사용 내인성 과산화 효소 차단제의 200 μl를 적용합....

Results

도 1에서, 트레이닝이 아닌 조직 함과 함께, 상피 및 간질 부분으로 분할 이미지 전립선 조직에 대해 수행된다. 상피 막 마커 E-cadherin의를 사용하여 세포 분할이도 2에 도시 된 핵, 세포질 및 막 부분을 분리 하였다.

한 실험에서는도 3에 도시 한 바와 같이, AR, ERα, E 헤린 및 CD147의 발현 및 위치 파악을 조사 다중화 IHC를 사용 하였다. 이러한 기술을 사용하여, 우리는 ERα 모두 핵 발현 양성 세포를 식별 할 수있다 AR (그림 3B - 3C)도 3a에 녹색 화살표와 같이 비색 신호를 중첩에도 불구하고. 우리는 홍보의 다른 상태에서 더블 긍정적 인 .......

Discussion

단백질 발현을 평가하기위한 기존의 면역 조직 화학의 사용은 분석 ^22,23 주관적 반 정량 방법에 의해 제한된다. 사전 플랫폼은 바이오 마커의 발현 및 지역화의 높은 처리량 분석을 위해 만들어졌습니다. 조직과 세포 내 구획 모두의 상세한 분할은 사용자가 관심의 다른 마커와 바이오 마커의 발현, 현지화 및 공동 현지화를 연구 할 수 있습니다. 이전의 연구에서, 우리는 같은 세포 구획 ^18,20,21에 지역화 된 단백질을 연구하는 데 특히 IHC 및 다중 분광 영상의 유틸리티를 증명하고있다. 조직 마이크로 어레이 ^(24)와 결합하면, 이러한 기술은 병리학 자에 의해 수동 분석에 의해 허용 된 것보다 단백질 발현의 신속하고 객관적인 정량 허용합니다.

단백질 정량에 대한 면역 조직 화학 염색의 사용과 한 가지 문제 때문에 subjec에 결과 irreproducibility입니다분석과 기술 및 시약의 고유 한 차이점적인 성격........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	NFPA 등급: 건강 – 2, 화재 – 3 , 반응성 – 0
에틸 알코올-200 증명	Fisher Scientific	4355223	NFPA 등급: 건강 – 0, 화재 – 3 , 반응성 – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	NFPA 등급: 건강 – 2, 화재 – 0 , 반응성 – 0
Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA 등급: 건강 – 2, 화재 – 0 , 반응성 – 0
트윈 20	Chem-Impex	1512	NFPA 등급: 건강 – 0, 화재 – 1 , 반응성 – 0
인산염 완충 식염수	Fisher Scientific	BP2944-100	NFPA 등급: 건강 – 1, 화재 – 0, 반응성 – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 피부 자극 및 눈 손상을 일으킬 수 있습니다.
에스트로겐 수용체 알파	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	로 분류되지 않음
	SCBT	sc-816	위험한
CD147	Biodesign	P87535M	위험한 것으로 분류되지 않음
E-cadherin	Dako	M3612	위험한 것으로 분류되지 않음
Renoir Red Andibody Diluent	Biocare 의료	PD904	이것은 Tris 기반 항체
DeCloaking Chamber	Biocare Medical	Model DC2002	를 사용하기 위한 일반적인 예방 조치를 취하십시오
	Vector Labs	H-4000
변성 키트-용리 단계	Biocare 의료	DNS001H	로 분류되지 않음
	Biocare 의료	RHRP520	위험한
마하 2 염소 안티 토끼 AP 폴리머	Biocare 의료	RALP525
	로 분류되지 않음Biocare Medical	M3M530	유해로 분류되지 않음
베타조이드 DAB 발색 키트	Biocare Medical	BDB2004	1. DAB는 발암물질로 의심되는 것으로 알려져 있습니다. 2. DAB 구성 요소를 강한 빛이나 직사광선에 노출시키지 마십시오. 3. 적절한 개인 보호 장비와 의복을 착용하십시오. 4. DAB는 피부 과민성을 유발할 수 있습니다. 피부와 눈의 접촉을 피하십시오. 5. 폐기에 관한 모든 연방, 주 및 지역 환경을 준수
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosive. 피부 자극이나 눈 손상을 유발할 수 있는 산.
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	삼키면 유해
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	가연성 액체. 열, 화염 및 스파크로부터 멀리 보관하십시오. 섭취 또는 흡수로 인해 유해합니다. 피부나 눈과의 접촉을 피하고 흡입을 피하십시오.
고양이 Hematoxylin	Biocare Medical	CATHE	보라색   솔루션   와 함께   ᅡ   마일드   아세트산   산성   (식초)   향기.   5월   be   짜증나는   에   피부   또는   이목구비.   피하십시오   연락처   와 함께   피부   그리고   이목구비.   피하십시오   음식물 섭취.
XYL 마운팅 미디어	Richard Allen	8312-4	NFPA 등급: 건강 – 2, 화재 – 3 , 반응성 – 0
1.5 커버슬립	Fisher 브랜드	22266858	날카로운 가장자리
배양 (습도)챔버	구식 구	식	여러 공급업체 사용 가능
대류 오븐	안정성- Therm	C-4008-Q
배경 퍼니셔 차단 시약	Biocare Medical	BP974	이 제품은 위험으로 분류되지 않았습니다.
inForm 소프트웨어	PerkinElmer	CLS135781	원고에 사용되는 기본 다중 스펙트럼 이미징 소프트웨어
Nuance 소프트웨어	PerkinElmer	Nuance EX	원고 내에서 스펙트럼 라이브러리를 만드는 데 사용되는 소프트웨어
Vectra 현미경 및 슬라이드 스캐너	PerkinElmer	VECTRA	IM3 이미지 큐브를 얻기 위한 자동 슬라이드 스캐너 및 현미경