Method Article

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

DOI:

10.3791/53843

⸱

April 30th, 2016

 , 
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

In This Article

Summary

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DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

Abstract

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CRISPR(Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 기술을 가진 벡터에 의해 생성된 표적 DNA 돌연변이는 기능적 유전체학 연구에 유용한 것으로 입증되었습니다. 대부분의 클로닝 전략은 수행이 간단하지만 일반적으로 여러 단계를 사용하며 최종 구조를 생성하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 DNA 조립을 기반으로 하며 단일 클로닝 반응에서 완전한 기능을 갖춘 CRISPR 벡터를 생산할 수 있습니다. Vector construction도 풀링할 수 있어 프로세스의 효율성과 유용성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법의 변형은 여러 유전자 표적을 가진 CRISPR 벡터를 만드는 데 사용됩니다. 그런 다음 CRISPR 벡터를 토마토 털 뿌리로 변형시켜 표적 DNA 변형을 통해 형질전환 물질을 생성합니다. 털뿌리는 기술적으로 생성이 간단하고 대규모 생산에 적합하기 때문에 벡터 기능을 테스트하는 데 유용한 시스템입니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 CRISPR 벡터를 생성하는 데 사용할 수 있고 광범위한 식물 종에 사용할 수 있으므로 광범위하게 적용할 수 있습니다.

Introduction

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CRISPR와 표적 DNA의 변형을 생성 할 수있는 능력은 / Cas9는 기능 유전체학 연구에 큰 잠재력을 가지고있다. CRISPR / Cas9 시스템의 두 가지 구성 요소가 있습니다; 황색 포도상 구균 화농 및 대상 DNA 사이트 (들) 1 Cas9을 지시 약 100 NT 가이드 RNA (gRNA) 분자에서 파생 된 Cas9 클레아. 표적 인식은 상기 제에 의해 부여된다 ~ 타겟팅 벡터 2,3- 높은 처리량 제조 허용 gRNA의 20 NT. 설계 할 수 있습니다 대부분의 생물은 이미 CRISPR / Cas9 기술 4,5로왔다.

식물 예는 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성 성 프로모터에서, 일반적 Cas9 클레아 (6)의 발현을 유도하기 위해 사용된다. gRNAs는 gRNA의 제 1베이스를 제한하는 RNA 중합 효소 III U6 또는 U3 프로모터를 사용하여 표현에 중 하나 G, 효율적인 전사 U3에 대한 U6, 또는 A,합니다. 그러나 RNA 중합 효소 II의 댄스 파티이러한 제한의 무료 oters는 또한 7, 8을 사용하고있다.

다른 gRNAs 다른 효율성과 DNA 돌....

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Protocol

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1. 가이드 RNA 설계 및 벡터 건설

  1. 관심있는 유전자에 대한 표적 서열을 확인합니다. 이 단계 (13, 14)에 적합한 온라인 CRISPR 대상-찾는 다양한 프로그램이 있습니다.
    참고 : 여기에 우리는 GN 20 GG 대상 모티브를 사용하지만, 다른 디자인을 사용하는 응용 프로그램이나 벡터 시스템에 따라 적합 할 수있다.
  2. 디자인 60 메르 gRNA 올리고는 DNA 조립에 필요한 5 측면 대상 주제 '및 3'20 NT 시퀀스의 GN (19) 부분을 포함한다. 마지막 60 메르 주제는 다음과 같습니다 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
    참고 : 표준, 탈염 프라이머가 잘 작동합니다.
  3. 조립을위한 네 개의 DNA를 (그림 1)을 준비합니다. DNA 서열에 대한 추가 파일을 참조하십시오.
    1. 2 시간 동안 37 ℃에서 1X 버퍼 (4)의 제한 효소와 I SPE Cas9 10 플라스미드 p201N 5 μg의 1 - 다이제스트. 는 다이제스트 열은-정화제조업체의 지침에 cc....

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Results

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DNA 어셈블리 CRISPR 벡터 구조는 일반적으로 독립적 인 클론의 수백 수십를 생성합니다. PCR에 의한 식민지 심사 쉽게 올바른 클론을 식별하고와 문제 해결에 유용 삽입 (그림 2A)없이 플라스미드를 구별 할 수 있습니다. 일반적으로, 클론의 모든 인서트를 포함하고 사용자가 완전히 식민지 심사 단계를 건너 뛰도록 선택할 수 있습니다. 진단 다이제스트 (그림 2B)와 생거 시퀀싱은 품질 관리에 사용됩니다. 오류가 발생하는 않는 경우, 그들은 일반적으로, 중첩 DNA 영역에서 관찰되는, 즉, 5 '를 MtU6 촉진제 단부의 gRNA 또는 3'골격 시퀀스의 끝. 여러 gRNA 올리고 단일 반응에 풀링하는 경우 gRNAs은 생거 시퀀싱에 의해 결정된다. 개별 gRNAs의 혼입이 균일하게 분포되고 gRNAs 대부분 (도 2c는 단일 변환으로부터 분리 될 수있다 (그림.......

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Discussion

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DNA 어셈블리는 겹치는 DNA 서열을 재결합하는 데 사용되기 때문에 이 클로닝 방법은 모든 CRISPR 벡터 구조에 적용할 수 있습니다. 대부분의 CRISPR 클로닝 방식은 gRNA의 유전자 합성, 유형 IIS 제한 효소17,18 또는 중첩 확장 PCR19를 사용합니다. 이러한 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있지만 일반적으로 여러 가지 실습 복제 단계가 필요합니다. 여기에 제시된 클로닝 방법의 주요 장점은 전체 프로세스가 단일 1시간 반응으로 발생하고 gRNA 올리고를 풀링하여 클로닝 절차를 더욱 간소화할 수 있다는 것입니다. 또한, DNA 조립 메커니즘은 제한 효소와 독립적이므로 이 방법은 거의 모든 DNA 서열과 호환됩니다. 편리하게도 불변 DNA 성분(선형화된 벡터, MtU6 프로모터 및 스캐폴드)의 마스터 믹스를 만들어 나중에 조립할 수 있도록 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

GN20GG gRNA 표적 .......

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Disclosures

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저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 IOS-1025642 (GBM)에 의해 지원되었다. 우리는 ARqua1 균주를 제공하는 마리아 해리슨 감사합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NEBuilder® (하이파이 DNA 어셈블리 믹스)New England BiolabsE5520
p201N:Cas9Addgene59175p201H:Cas9 플라스미드(59176)는 보고된 중첩 및 효소와도 호환됩니다.
pUC gRNA 셔틀Addgene47024
SwaINew England BiolabsR0604S
SpeINew England BiolabsR0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purificationZymo ResearchD4003
NEB Buffer 2.1New England BiolabsB7202S
NEB CutSmart (버퍼 4)New England BiolabsB7204S
NEB 버퍼 3.1New England BiolabsB7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)Epoch Life Sciences1910-050/250
EcoRV-HF®뉴잉글랜드 BiolabsR3195S
StyI-HF®New England BiolabsR3500S
MS Salts + Gamborg VitaminsPhytotechnology LaboratoriesM404
Phytagel™ (Gellan 실리콘껌)Sigma AldrichP8169
GA-7 박스Sigma AldrichV8505
Micropore™ 수술 테이프3M1535-0
Timentin® (티카르실린/클라불란산)다양한0029-6571-26
프라이머 5' → 3'SwaI_MtU6F
 GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
비계F GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT
SpeI_Scaffold RGTCATGAATTGTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIRGTGATCGATTACCCTGTTAT
CCCTAG		에 두 번째 결합 부위가 있으므로 Sanger 염기서열분석에 사용할 수 없습니다
.GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
굵게 표시된 시퀀스는 선형화된 p201N:Cas9와 20-nt가 겹치는 것을 나타냅니다.
플라스미드 UNS1_Scaffold R 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....

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CRISPR Vector ConstructionDNA Assembly MethodTomato Hairy RootsGuide RNA DesignRestriction Enzyme DigestionDNA Amplification PCRPlasmid PurificationAgrobacterium TransformationGenetic Mutation AnalysisFunctional Genomics Studies

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