토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Summary

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

Abstract

CRISPR(Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 기술을 가진 벡터에 의해 생성된 표적 DNA 돌연변이는 기능적 유전체학 연구에 유용한 것으로 입증되었습니다. 대부분의 클로닝 전략은 수행이 간단하지만 일반적으로 여러 단계를 사용하며 최종 구조를 생성하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 DNA 조립을 기반으로 하며 단일 클로닝 반응에서 완전한 기능을 갖춘 CRISPR 벡터를 생산할 수 있습니다. Vector construction도 풀링할 수 있어 프로세스의 효율성과 유용성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법의 변형은 여러 유전자 표적을 가진 CRISPR 벡터를 만드는 데 사용됩니다. 그런 다음 CRISPR 벡터를 토마토 털 뿌리로 변형시켜 표적 DNA 변형을 통해 형질전환 물질을 생성합니다. 털뿌리는 기술적으로 생성이 간단하고 대규모 생산에 적합하기 때문에 벡터 기능을 테스트하는 데 유용한 시스템입니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 CRISPR 벡터를 생성하는 데 사용할 수 있고 광범위한 식물 종에 사용할 수 있으므로 광범위하게 적용할 수 있습니다.

Introduction

CRISPR와 표적 DNA의 변형을 생성 할 수있는 능력은 / Cas9는 기능 유전체학 연구에 큰 잠재력을 가지고있다. CRISPR / Cas9 시스템의 두 가지 구성 요소가 있습니다; 황색 포도상 구균 화농 및 대상 DNA 사이트 (들) ¹ Cas9을 지시 약 100 NT 가이드 RNA (gRNA) 분자에서 파생 된 Cas9 클레아. 표적 인식은 상기 제에 의해 부여된다 ~ 타겟팅 벡터 ^2,3- 높은 처리량 제조 허용 gRNA의 20 NT. 설계 할 수 있습니다 대부분의 생물은 이미 CRISPR / Cas9 기술 ^{4,5로왔다.}

식물 예는 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성 성 프로모터에서, 일반적 Cas9 클레아 ^(6)의 발현을 유도하기 위해 사용된다. gRNAs는 gRNA의 제 1베이스를 제한하는 RNA 중합 효소 III U6 또는 U3 프로모터를 사용하여 표현에 중 하나 G, 효율적인 전사 U3에 대한 U6, 또는 A,합니다. 그러나 RNA 중합 효소 II의 댄스 파티이러한 제한의 무료 oters는 또한 ^{7, 8을} 사용하고있다.

다른 gRNAs 다른 효율성과 DNA 돌연변이를 유도하고, 그래서 먼저 전체 공장의 변환에 투자 또는 광범위한 표현형 화면을 설정하기 전에 CRISPR 경로를 확인하는 것이 중요 할 수 있습니다. CRISPR 과도 발현이 곤란 돌연변이와 같은 방식으로 비실용적 표현형 어 세이의 검출을 안정 설비 ^(6)에 비해 일반적으로 DNA 개질 저주파 결과, 예를 들면 agroinfiltration을 사용하여, 식물 구성한다. 소위 모상근 안정적인 식물 개월 반대로 독립 안정적으로 형질 전환 물질 다수, 주 내에서 발생 될 수 있기 때문에 편리 대체 시스템이다. CRISPR 벡터는 털이 뿌리 ^9,10에서 DNA 돌연변이를 유도에 매우 효과적이다.

DNA 조립 방법은 효율적 overl 함유 DNA 단편을 결찰apping ^{11을 종료합니다.} 일부 DNA 조립 방법의 주요 장점은 조립 된 제품에 ssDNA를 (즉, 올리고)를 통합 할 수있는 능력이다. gRNAs 만 ~ 20 NT 긴 새로운 타겟 합성 올리고 만들어 질 수 있기 때문에, 이러한 DNA 조립 방법 CRISPR 복제에 적합하다. 여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 대두 ^10, 포플라 ^(12)에 사용 된 현재 토마토 CRISPR 벡터의 P201 시리즈에 기초한다. 제시 복제 절차는 현재의 클로닝 방법 ^(10)에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 즉, 완전히 기능 벡터는 하루에 단일 클로닝 반응에서 생성 될 수있다. 벡터 건설은 더 손에 시간과 재료 비용을 절감, 병렬로 여러 CRISPR 벡터를 생성하기 위해 풀링 할 수 있습니다. 또한 표적 유전자 결실 유전자 물질을 제조하기위한 효율적인 방법으로 토마토 모상근의 생성을위한 프로토콜을 제시한다. 털이 뿌리는 유효한하는 데 사용됩니다CRISPR 벡터를 먹고 이후의 실험 자료를 제공한다.

Protocol

1. 가이드 RNA 설계 및 벡터 건설

1. 관심있는 유전자에 대한 표적 서열을 확인합니다. 이 단계 ^{(13, 14)에} 적합한 온라인 CRISPR 대상-찾는 다양한 프로그램이 있습니다.
   참고 : 여기에 우리는 GN ₂₀ GG 대상 모티브를 사용하지만, 다른 디자인을 사용하는 응용 프로그램이나 벡터 시스템에 따라 적합 할 수있다.
2. 디자인 60 메르 gRNA 올리고는 DNA 조립에 필요한 5 측면 대상 주제 '및 3'20 NT 시퀀스의 GN ₍₁₉₎ 부분을 포함한다. 마지막 60 메르 주제는 다음과 같습니다 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
   참고 : 표준, 탈염 프라이머가 잘 작동합니다.
3. 조립을위한 네 개의 DNA를 (그림 1)을 준비합니다. DNA 서열에 대한 추가 파일을 참조하십시오.
   1. 2 시간 동안 37 ℃에서 1X 버퍼 (4)의 제한 효소와 I SPE Cas9 ¹⁰ 플라스미드 p201N 5 μg의 1 - 다이제스트. 는 다이제스트 열은-정화제조업체의 지침에 ccording. ~ 10 mM 트리스 - 염산 15 μl를에 재현 탁하고, UV 분광 광도법에 의해 정량화.
   2. 제 2 시간 동안 25 ℃에서 1X 버퍼 3.1 제한 효소 I SWA와 다이제스트 수행한다. 완전한 분해를 확인하기 위해 0.8 % 아가 로스 겔상에서 ng를 200-100를 확인한다.
      참고 : 제대로 소화 플라스미드 14,313 BP에 하나의 밴드를해야합니다. 참고 : 효소와 탈 인산화의 열 불 활성화가 필요하지 않습니다. 분해 된 플라스미드를 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
   3. PCR은 프라이머 SWA I_MtU6F / MtU6R 각각 ScaffoldF / SPE I_ScaffoldR를 사용하여는 pUC gRNA 셔틀 ⁽¹⁰⁾ 플라스미드에서 Medicago의 truncatula (마) U6 프로모터 및 발판 DNA를 증폭. 상기 증폭 된 PCR 조건을 가진 고성능 폴리머 사용하여 3 분 동안 95 ° C 단계; 31주기 (20 초 98 ° C, 15 초 동안 60 ° C, 30 초 72 ° C); 5 분 동안 72 ° C.
      1. PCR 홍보의 ~ 3 μL 씩 시각화1 % 아가 로스 겔상에서 oducts의 증폭을 확인한다. MtU6 앰플 리콘은 377 BP하고 비계 앰플 리콘은 106 bp의입니다. , 제조업체의 지시에 따라 PCR 나머지 제품을 칼럼 - 정제 -20 ℃에서 UV 분광 광도법에 의해 정량화하고 저장.
   4. 실험실 수준의 물에 100 μM에 gRNA 올리고의 전체 튜브를 재현 탁. 1X 버퍼 2.1 500 ㎕를 100 μM 올리고 1 μl를 추가합니다. 잘 섞다. 여러 올리고 풀링 경우, 1 배 버퍼 2.1 튜브에 각각 100 μM 올리고 1 μl를 추가합니다. 희석 올리고는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
4. 가열 된 리드를 사용하여, 50 ° C에서 유지하도록 열 순환기 프로그램. 의 부피로 선형화 된 벡터 묽은 gRNA 올리고 (들) 및 물 MtU6 프로모터 지지체의 12 NG (0.2 pmol의), 1 μL (0.2 pmol의)의 50 NG (0.2 pmol의)의 100 NG (0.011 pmol의)을 겸용 5 μL. 2 배 높은 충실도 DNA 어셈블리 마스터 믹스 5 μl를 추가 잘 혼합 스핀 다운. 에서 60 분 동안 반응을 품어50 ° C 열 순환기. 그런 다음 얼음에 반응을 놓습니다.
   주의 : 반응 볼륨이 낮은 DNA 수율을 수용하기 위해 증가 될 수있다.
5. 관할 E.으로 반응 2 μl를 변환 50 mg을 L ^-1 카나마이신 (칸 _50)로 보충 LB에 표준 기술과 플레이트를 이용하여 대장균 세포. 하룻밤 37 ℃에서 도금 세포를 성장. -20 ° C에서 남아있는 DNA 어셈블리 반응을 저장합니다.
6. 프라이머의 StUbi3P218R 및 ISceIR를 사용하여 PCR에 의한 식민지 화면. 물 (1)과 나머지 DNA 조립체 반응의 분취 액을 희석 : 5이다. 노 삽입 제어와 같은 Cas9 플라스미드 : 긍정적 인 식민지의 화면 제어 및 원형 p201N 1 NG로 1 μl를 사용합니다.
   1. PCR은 조건을 증폭; 3 분 95 ° C; 31주기 (30 초 95 ° C, 30 초 동안 58 ° C, 30 초 72 ° C); 5 분 동안 72 ° C에서. 1 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물을 가시화. 정확한 삽입이 725 BP와 벡터 기지에서 밴드가 있는지 확인(예를 들어, 포경 벡터) 심 삽입은 310 bp의 밴드를해야합니다.
7. 37 ° C에서 ₅₀ 액체 배양 밤새 LB 칸에 긍정적 인 식민지를 성장하고 제조업체의 지침에 따라 플라스미드를 정제. 생거 순서는 StUbi3P218R 프라이머로 플라스미드 및 오류가 복제 동안 소개되지 않았다 보장하기 위해 MtU6 프로모터, 대상 및 발판 시퀀스에 크로마토 그램을 맞 춥니 다.
8. 진단은 에코 RV 및 촌 I.와 플라스미드 ~ 1 μg의 소화에 의해 소화 수행 0.8 % 아가 로스 젤에 시각화합니다. (BP)에 조각은 다음과 같습니다 : 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174.
9. 여러 gRNAs와 벡터를 구성하는 DNA 어셈블리를 사용합니다.
   1. 두 gRNA 카세트를 갖는 벡터를 구성하기 위해 PCR은 각각 각각의 1 NG의 프라이머 UNS1_MtU6F / SPE I_ScaffoldR와 프라이머 SWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR 및 제 gRNA 위치와 제 1 위치 gRNA 증폭1.8 - 플라스미드 단계 1.1으로 구성. 단계 1.3.3에서 PCR 조건을 사용합니다. 증폭을 확인하기 위해, 1 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 제품 ~ 3 μL 씩 시각화. 증폭는 ~ 500 BP 있습니다.
   2. 합하여 200 μL 튜브 않은 정제 PCR 제품의 대략 동일한 양을 혼합 (일반적으로 3 - 각 4 μL). 어셈블리를 들어, PCR 제품 조합 1 μL, SWA I의 50 NG를 추가하고 SPE 나는 p201N을 선형화 : Cas9, 실험실 수준의 물을 2.5 μL와 배 높은 충실도 DNA 어셈블리 마스터 믹스의 2.5 μL에. 15 분 동안 50 ° C 열 순환기 인큐베이션.
      주 : DNA 조립 매뉴얼 2 15 분 배양 권장합니다 - 3 조각.
   3. 관할 E.으로 2 μL 1 - 변환 LB 칸 _(50)에 대장균 세포와 판. 하룻밤 37 ° C에서 도금 세포를 성장. -20 ° C에서 나머지 반응을 저장합니다.
   4. 단계 1.6과 동일한 조건으로 프라이머 StUbi3P218R 및 ISceIR와 PCR에 의한 식민지 화면. 올바른 Clones는 1200 bp의 증폭 물을 것입니다. LB 칸에 긍정적 인 식민지를 ₅₀ 액체 배양 하룻밤 성장 및 플라스미드를 정제.
   5. 프라이머의 StUbi3P218R와 생거 시퀀스 플라스미드 (제 1 위치 gRNA을 포함) 및 p201R은 (두 번째 위치 gRNA을 포함). MtU6 프로모터, 대상 및 발판 시퀀스에 크로마토 그램을 맞 춥니 다. 진단은 에코 RV 다이제스트와의 Sty 나는 (BP)에 다음과 같은 단편 발생합니다 : 4192은, 2476은, 1743은, 1544은, 1381는, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174 굵게 조각 두 번째 gRNA이 포함되어 있습니다.
10. 아그로 박테 리움이 변형 ARqua1 ¹⁵ rhizogenes에 모든 품질 관리의 기대를 충족 한 후, 플라스미드를 변환. 설정으로 1mm 큐벳에 electrocompetent 세포와 electroporate 50 μL에 플라스미드 준비 1 μl를 추가 : 2.4 kV의 25 μF, 200 Ω을. SOC의 ~ 500 μL의 세포를 복구하고 2 시간 동안 28 ° C에서 흔들. LB 칸 ₅₀ g에 플레이트2 일 동안 28 ° C에서 행. 1.3.3와 동일한 프라이머 및 PCR 조건을 사용하여 콜로니 화면을 수행한다. 긍정적 인 클론에서 글리세롤 주식을합니다.

2. 털이 루트 변환

1. 일정하게 혼합하여, 15 분 동안 20 %의 가정용 표백제 토마토 종자를 소독. 층류 후드에서, 표백제를 제거하고 무균 실험실 등급 물에 세 번 세척 하였다.
2. ½ MS 미디어 (2.22 g의 L ^-1 MS 염 + 갬 보그 비타민, 10g의 L ^-1 자당 3 g L ^-1 젤란 검, 산도 5.8)를 포함하는 GA-7 상자 판 (30) 씨. 어둠 속에서 2 ~위한 일을 발아 후 빛에 GA-7 상자를 이동합니다. 빛 ~ 4 일 이상 모종을 재배한다.
3. 변환 전날, 연속 아웃 A. 고체 LB 칸 _(50)에 문화를 rhizogenes 하룻밤 28 ° C에서 성장한다.
4. 변환 일이 층류 후드에서 멸균 재료를 조립 : 12 ml의 배양 관, 50 ㎖ 원뿔형 튜브, ½ MS 액체 (더 젤란 g 없다음), 200 μM의 시린, 여과지, 배양 접시, 집게와 메스, 피펫과 피펫 팁. ½ MS의 50ml로 시린의 25 μl를 추가하고 각 문화 튜브에 ~ 6 ml에 붓는다.
5. A.을 긁어 구부러진 200 μl의 팁을 사용하여 ½ MS 액의 6 용액에 접시와에 resuspend에서 rhizogenes 세포. 와류 튜브 완전 세포를 재현 탁한다. 각 벡터로 세포를 재현 탁 후에, 600 nm의 고정 된 파장에서 셀 1 (M1)의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. OD가 0.2과 0.4 사이에 있는지 확인; 희석 또는 필요에 따라 더 많은 세포를 추가합니다. 각 구조에 대해 반복합니다.
6. 살균 필터 종이와 페트리 접시에 ½ MS 액체 ~ 2 ML을 추가합니다. 가습 필터 종이에 묘목과 장소에서 소비세 자엽. 일단 모든 자엽이 수집 한 두 컷 끝 떡잎 조각의 결과로, 자엽의 오프 말단 ~ 1cm를 잘라. A.에 외식 추가 rhizogenes 솔루션은 혼합하고, 20 분 동안 품어가끔 반전에.
   참고 : 구조 당 약 12 외식가 일상적으로 사용되며, 많은 80 외식이 A의 6 ㎖에 접종되고 있지만 rhizogenes 솔루션입니다.
7. A. 동안 rhizogenes의 배양은 배양 접시에 종이 필터를 추가, 하나의 당 구조가 변형. 또한 건조 층류 후드, ½ MS 고체 배지, 아니 항생제를 설정합니다.
8. A.에서 자엽 특종 건조 여과지에 멸균 집게와 장소 rhizogenes 솔루션을 제공합니다. 다음 변환을 진행하면서 건조하지 않는 조직을 보장하기 위해 페트리 뚜껑 커버. 여과지 및 전송, 배축면이 위로에 오 자엽은 MS의 미디어를 ½합니다. 외과 용 테이프로 감싸 판을 실온에서 2 일 동안 어둠 속에서 공동 - 배양.
9. 최대 공 배양, 전사 자엽, 배축 측 후, MS 매체 (300 mg을 L ^-1 ticarcillin / 클라 불란 산 팀 ₃₀₀ 보충 1/2 잔유의 성장을 방지 할연간 A. rhizogenes) 및 공장 선택에 대한 칸 ₅₀ () 및 수술 테이프로 포장. 16 시간 광주와 실온에서 형광등 불빛 아래에서 문화를 유지한다.
10. 길이가 2 주 뿌리 적어도 2cm 멸균 집게와 메스를 사용하여 자엽에서 절제와 MS 칸 ₅₀ 팀 ₍₃₀₀₎ 미디어를 1/2 전송 - ~ 1.5 후. 하나의 판에 10 ~ 15 뿌리를 전송합니다. 마커와 뿌리 끝의 위치를​​ 표시 외과 테이프로 포장, 문화 방에서 유지한다.
11. 일주 후, 형질 전환 뿌리는 선택적 미디어에 성장 볼 수 있습니다. 바람직한 DNA 추출 방법을 이용하여 DNA 추출을 위해 변환 된 뿌리의 표본 수확. 참고 : 자엽과 플레이트가 2 유지 될 수 - 뿌리가 얽힌 엉망으로 성장 지적과 분리하기 어려운 후 3 주간 수확. 비 수확 루트 조직 무한히 유지할 수있다. 분석의 다양한 단리 된 DNA 시료에서 수행 될 수있다들 DNA 돌연변이의 빈도와 유형을 확인합니다. 몇 이러한 분석 결과는 아래에 설명되어 있습니다.

Results

DNA 어셈블리 CRISPR 벡터 구조는 일반적으로 독립적 인 클론의 수백 수십를 생성합니다. PCR에 의한 식민지 심사 쉽게 올바른 클론을 식별하고와 문제 해결에 유용 삽입 (그림 2A)없이 플라스미드를 구별 할 수 있습니다. 일반적으로, 클론의 모든 인서트를 포함하고 사용자가 완전히 식민지 심사 단계를 건너 뛰도록 선택할 수 있습니다. 진단 다이제스트 (그림 2B)와 생거 시퀀싱은 품질 관리에 사용됩니다. 오류가 발생하는 않는 경우, 그들은 일반적으로, 중첩 DNA 영역에서 관찰되는, 즉, 5 '를 MtU6 촉진제 단부의 gRNA 또는 3'골격 시퀀스의 끝. 여러 gRNA 올리고 단일 반응에 풀링하는 경우 gRNAs은 생거 시퀀싱에 의해 결정된다. 개별 gRNAs의 혼입이 균일하게 분포되고 gRNAs 대부분 (도 2c는 단일 변환으로부터 분리 될 수있다 (그림...

Discussion

DNA 어셈블리는 겹치는 DNA 서열을 재결합하는 데 사용되기 때문에 이 클로닝 방법은 모든 CRISPR 벡터 구조에 적용할 수 있습니다. 대부분의 CRISPR 클로닝 방식은 gRNA의 유전자 합성, 유형 IIS 제한 효소^17,18 또는 중첩 확장 PCR¹⁹를 사용합니다. 이러한 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있지만 일반적으로 여러 가지 실습 복제 단계가 필요합니다. 여기에 제시된 클로닝 방법의 주요 장점은 전체 프로세스가 단일 1시간 반응으로 발생하고 gRNA 올리고를 풀링하여 클로닝 절차를 더욱 간소화할 수 있다는 것입니다. 또한, DNA 조립 메커니즘은 제한 효소와 독립적이므로 이 방법은 거의 모든 DNA 서열과 호환됩니다. 편리하게도 불변 DNA 성분(선형화된 벡터, MtU6 프로모터 및 스캐폴드)의 마스터 믹스를 만들어 나중에 조립할 수 있도록 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

GN₂₀GG gRNA 표적 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® (하이파이 DNA 어셈블리 믹스)	New England Biolabs	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	p201H:Cas9 플라스미드(59176)는 보고된 중첩 및 효소와도 호환됩니다.
pUC gRNA 셔틀	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Zymo clean and concentrator-5 column purification	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (버퍼 4)	New England Biolabs	B7204S
NEB 버퍼 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	뉴잉글랜드 Biolabs	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS Salts + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™ (Gellan 실리콘껌)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 박스	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ 수술 테이프	3M	1535-0
Timentin® (티카르실린/클라불란산)	다양한	0029-6571-26
프라이머 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
비계F	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG		에 두 번째 결합 부위가 있으므로 Sanger 염기서열분석에 사용할 수 없습니다
.	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
굵게 표시된 시퀀스는 선형화된 p201N:Cas9와 20-nt가 겹치는 것을 나타냅니다.