Method Article

기능 보완 분석 (FCA) : 설계 및 생화학 적 경로의 교육을 보완하기 위해 구현 된 실험실 운동

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

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생화학 적 경로에 관여하는 효소 활성의 유효성 기능성 상보성 분석 (FCA)를 사용하여 설명 될 수있다. 아미노산, 세균 엄격한 반응 세균 펩티도 글리 칸의 생합성의 대사에 관여하는 효소의 효소 활성을 보여주는 FCA 분석이 논문에 설명한다.

Abstract

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기능성 상보성 분석 (FCA)는 널리 유전자 / 효소의 기능 / 역할을 규명하기 위해 사용되는 생체 내 분석이다. 이 기술은 생화학, 유전학 및 기타 여러 분야에서 매우 일반적입니다. 기술의 포괄적 인 개요 펩티도 글리와 세균 엄격한 응답이 원고에보고 산, 아미노에 관련된 생화학 적 경로의 가르침을 보완합니다. 라이신 (L, L-디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)과 티로신 및 페닐알라닌의 대사에 관여하는 티로신 아미노 전이 효소 (tyrB)의 대사에 관여하는 모델 식물 생물 애기 장대에서 두 cDNA를가 강조 표시됩니다. 또한, 세균 펩티도 글리 신진 대사 경로는 십자가에 포함 된 세균 Verrucomicrobium spinosum 등의은 UDP N -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 아제 (무레) 유전자의 분석을 통해 강조펩티도 글리의 -linking. 세균 엄격한 응답도. RSH (R 영어 / s의 냄비 시간 omolog) 박테리아 Novosphingobium 특검팀의 하이퍼 점액 표현형에 대한 책임 관능 성 유전자의 분석을 통해보고 FCA의 네 가지 예를 제시한다. 동영상 즉 리신, 펩티도 글리 칸과 반응 엄격한 이들 세에 초점을 맞출 것이다.

Introduction

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유전자의 기능 (들)을 해명 / 역할 (들)의 맥락에서 기능적 상보성은 상동 야생형 상태로 관찰 표현형으로 특정 돌연변이를 복원하는 특정 동종 또는 orthologous 유전자의 능력으로 정의된다 또는 orthologous 유전자 돌연변이 배경으로 시스 또는 트랜스에 도입된다. 이 기술은 넓게 분리 및 기능 (들)는 많은 유전자 / 역할 (들)을 식별하는 데 사용되어왔다. 하나의 특정 예는 S. URA3의 돌연변이를 사용하여 칸디다 알비에서 orotidine -5- 인산 라제의 분리 및 식별이며 cerevisiae의와 E.의 pyrF 돌연변이 대장균. 한 저자는 아미노산, 펩티도 글리 칸과 그 연구 프로그램에서 엄격한 반응의 대사에 관여하고 B에서의 교시 프로그램에이 기술을 도입 한 유전자의 기능을 규명하기 위해이 기술을 사용한iotechnology 및 분자 생명 과학 (BMB) 기술의 로체스터 대학 (RIT)에서 프로그램.

원칙과 사례 (BPP) (허드슨 / Savka)는 RIT에서 BMB 프로그램에서 두 개의 상 부문 과목 실험실 기초 과정 : 저자는 식물 생화학 / 병리학....

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Protocol

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참고 : 저자는 관심이있는 개인을위한 교육 목적을위한 기능 보완 분석의 통합을 용이하게하기 위해 균주 및 재조합 플라스미드를 제공하고자합니다. 기능적 보완 실험을 용이하게하기 위해 사용 된 플라스미드는하기 표 1에 나열되어있다.

기능 보완을위한 플라스미드 1. 건설

  1. 기능 보완을위한 디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)의 클로닝.
    1. V.에서 DAPL 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 증폭 A.에서 spinosum 등 및 cDNA를 장대와 C. PCR에 의한 reinhardtii에서. 15 초 동안 94 ° C의 30주기, 30 초 동안 60 ° C, 2 분 동안 72 ° C이어서 2 분 94 ° C에서 1주기를 사용합니다. 각각의 프라이머 12 pmole의 포함, 1 mM의 황산, 0.5 mM의 4 옥시 뉴클레오티드의 트리 포스페이트의 각, 그리고 템플릿 DNA의 0.5 NG와 PFX 1 부DNA 폴리머 라제.
      참고 : 공장 A.로부터 3 DAPL의 orthologs의 재조합 복제에 관한....

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Results

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다양한 기능 보완 분석에 사용 된 균주는 표 2에 나열되어 있습니다.

기능 보완 분석 : L, L-디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)

E. 이중 돌연변이 대장균 AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6)는 DAPE 유전자의 돌연변이 및 DAPD 유전자의 완전한 결실 (도 1) 항구. 이와 같이, 돌연변이 체는 DAP가 제공되지 않으면 증가 할 수 없다. 이러한 돌연변이로 인해, AOH1은 영양 요 간주된다. AOH1는 L의 기능을 보완 분석에 적합, DAPL으로 L-디아 미노 아미노.......

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Discussion

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기술의 로체스터 연구소의 생명 공학 및 분자 생명 과학 교과 과정에 필수적인 과정의 대부분은 과정의 강의 부분에 추가하여 실험실 구성 요소를 가지고있다. 학기 2014에서 2015 사이의 교과 과정은 약 60 %를 차지 실험실 성분을 포함 29있는 48 코스, 총이 포함되어 있습니다. 원칙과 사례 (BPP), 실험실 기초 과정 : 하나의 코스는 식물 생화학 및 병리학 (FPBP), 혼합 강의 / 실험 과정 및 Bioseparations의 기본이다.

각 과정의 실험 성분 강의 자료를 강화하도록 설계된다. 예를 들어, 생화학 적 경로 및 신진 대사가 크게 FPBP 및 BPP에서 강조된다. 주제 중 일부는 아미노산 대사, 펩티도 글리 생합성, 식물 이차 대사, 다른 사람의 사이에서 환경 틈새에 세균 응답을 포함한다. 저자는 기능 complem을 통합 한두 코스 실험실 운동으로 정해져있는은 강의 및 또는 사전 실험실 프리젠 테이션에서 설명하는 대사 경로의 이해를 강화합니다. 리스, .......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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AOH 및 MAS는 과학의 대학 지원을위한 기술의 로체스터 연구소의 생명 과학의 토마스 H. Gosnell 학교를 인정한다. 이 작품은 미국 국립 과학 재단 (NSF) AOH MCB-1120541에 수상에 의해 부분적으로 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli 돌연변이Hudson/Savka lab 또는 CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
감자 덱스트로스 중간Fisher Scientfic;DF0013-15-8
카나마이신시그마-알드리치K1377
디아미노피멜레이트시그마-알드리치92591
티민시그마-알드리치T0376
클로람페니콜시그마-알드리치C0378
티로신시그마-알드리치T3754
펜릴알라닌시그마-알드리치P2126
아스파르테이시그마-알드리치A9256
발린시그마-알드리치V0500
류신시그마-알드리치L8000
이소류신시그마-알드리치I2752
우라실시그마-알드리치U0750
길세롤시그마-알드리치G5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA 중합효소Thermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA 리가제Thermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo 벡터Thermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 벡터Thermofisher ScientificK2030-01
, 트 , , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

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