여기에서는 모세관 기반 원심 미세유체 장치를 사용하여 크기 제어 가능한 단분산 W/O(Water-in-Oil) 미세방울에 대한 간단한 생산 방법을 보여줍니다. 이 방법은 소량의 시료만 필요하며 고수율 생산이 가능합니다. 우리는 이 방법이 신속한 생화학 및 세포 분석에 유용할 것으로 기대합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기서는 모세관 기반 원심 미세 유동 장치를 이용하여 제어 할 수있는 크기, 단 분산, W / 출력 미세 방울의 신속한 제조를위한 간단한 방법을 보여준다. W / O의 미세 방울은 최근 화학 실험 소형화 에이블 강력한 방법에 사용되어왔다. / O 미세 방울 필요 W 따라서, 다목적 현상 방법은 단 분산 얻었다. 우리는 모세관 기반 원심 선대칭 공동 흐르는 미세 유동 장치에 기초하여 / O의 미세 방울 W 단 분산 생성하기위한 방법을 개발 하였다. 우리는 모세관 구멍을 조절함으로써 미세 방울의 크기를 제어하는데 성공했다. 우리의 방법은, 밀봉 용 시료 액의 소량 (0.1 μL)를 필요로 사용하기 쉬운 다른 마이크로 유체 기술을보다 장비를 필요로 초당 W / O의 미세 방울 수백 수천의 수의 생산을 가능하게 . 우리는이 방법이 소중한 생물들 필요 생물학적 연구를 도움이 될 것 기대신속한 정량 분석 생화학 및 생물학적 연구를위한 샘플의 부피를 보존하여 amples.
서론
W / O 미세 방울 1-5 단백질 합성 (6), 단백질 결정화 (7), 에멀젼 PCR 8, 9, 세포 캡슐화 (10), 인공 세포와 같은 시스템 5,6의 건설을 포함한 생화학 및 생명 공학의 연구에 많은 중요한 응용 프로그램을 가지고있다. 이러한 응용을위한 W / O의 미세 방울을 생산 중요한 기준은 사이즈 W / O의 미세 방울의 단순 분산도를 제어한다. 미세 유체 장치의 제조 단 분산의 크기가 제어 W / 미세 방울 (11)은 공동 (12, 13)에있어서 흐르는 흐름 포커싱 방법 14,15 및 마이크로에 T 접합 방법 (16)에 기초 이여. 이러한 방법은 매우 단 분산 W / O의 미세 방울을 생성하지만, 미세 처리가 마이크로 채널 제조 복잡한 처리 및 전문 기술을 필요로하고, 또한 시료 용액을 다량 (최소 수백이 필요81; 때문에 마이크로에 시료 용액을 실시 주사기 펌프와 튜브 불가피 데드 볼륨 l). / O 미세 방울가 필요하다 (W) 따라서, 사용하기 쉬운과 낮은 죽은 볼륨 방법은 단 분산 생성합니다.
이 논문은, 실험 절차의 동영상과 함께 / O 미세 방울 (그림 1) W 단 분산 셀 크기의 생성 원심 모세관 기반의 축 대칭 공동 흐르는 미세 유체 장치 (17)에 대해 설명합니다. 이 간단한 방법은 크기의 단 분산 및 크기 제어를 달성 할 수있다. 그냥 탁상 미니 원심 분리기 및 샘플링 마이크로 튜브에 고정 된 모세관 기반의 축 대칭 공동 흐르는 미세 유체 장치가 필요합니다. 우리의 방법은 단지 매우 소량 (0.1 μL)를 필요로하고, 샘플의 상당한 양을 낭비하지 않는다.
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프로토콜
모세관 기반 미세 유체 장치 1. 제작
- 홀더의 설정
참고 : 홀더 디자인 그림 2A로 표시됩니다.- 홀더의 네 각 디스크 잘라 (도 2A (Ⅰ) - (IV)) 밀링 머신을 사용하여 2 mm 두께의 플레이트를 폴리 아세탈 수지. (SH) 직경은 1.8 mm 고정 홈 (I)의 디스크 (1)의 직경 8.5 mm, 모세관 구멍 (CH)의 직경 1.3 mm; 홀더 네 디스크 각각에 대해 다음의 기준을 사용 (ⅱ)이 디스크 직경 8.7 mm, CH 직경 2.0 mm, SH 직경 1.8 mm; (ⅲ) 디스크 (3)의 직경 8.7 mm, CH 직경 0.5 mm, SH 직경 1.8 mm; 및 (ⅳ) 4 장 직경 9.1 mm, 지름 1.0 mm CH, SH 직경 1.8 mm.
- M2 (40) 나사 (그림 2B)를 × 사용하여 홀더를 조립합니다. 홀더 (도 2B)의 저부는도 2a (i), (ii) 및 상부 (도 디스크 (1)과 디스크 (2)로 구성홀더 URE의 2B)를 디스크 (3)와도 2a에 4 장 구성 (III), (IV).
- 홀더의 하부를 구성하는 각 디스크 (1)의 세 SH에 나사를 삽입 2. 쓰레드 부의 부분을 협지하여 나사를 짧게. 0.9 cm (상기 홀더의 바닥 부와 동일한 길이)에 나사의 길이를 유지한다.
- 홀더의 상부를 구성하는 각각의 디스크의 3 개의 SH에 나사를 삽입 4. 나사부의 일부를 협지하여 나사를 짧게. 0.7 cm (홀더의 상부와 같은 길이)에 나사의 길이를 유지한다.
- 홀더 조립 긴 나사를 사용하여 홀더의 하부 및 상부에 참여.
참고 : 정확한 홀더의 각 부분의 길이를 유지 : 하단 부분은 0.9 cm입니다; 상부는 0.7 cm (그림 2B)입니다.
- 유리 모세관의 제작
- 내부 유리 모세관 (외경 (OD) / 내경 (ID) : 1.0 / 0.6 mm), 및 외부 유리 모세관 (OD / ID : 2.0 / 1.12 mm) 두 개의 유리 모세관의 형식을 사용합니다.
- 3 등분으로 외부 유리 모세관을 분할하는 유리 절단기를 사용하여 두 개의 동일한 조각으로 내부 유리 모세관을 분할하는 유리 커터를 사용합니다.
- 유리 모세관 풀러 (도 3a)을 사용하여 각각의 분할 된 내측 및 외측 유리 모세관을 선명. 최대의 풀러의 무게를 설정합니다. 외부 유리 모세관 60도, 내부 모세관 70도에서 풀러의 열 레벨을 설정합니다. 조심스럽게 유리 모세관을 선명하게.
- 유리 모세관의 잘록한 부분에서 끝의 길이를 유지 : 내부 모세관은 1.5-1.8 cm이다 외부 모세관은 0.8-1.0 cm (그림 3C)입니다. 이 길이는 기재의 길이보다 짧거나 길면, 풀러 열 조정하여주십시오.
- 에프IX microforge에 내부 또는 외부 유리 모세관 테이프 (그림 3B)를 사용하여 서있다.
- 세 단계 (도 3b)에 microforge를 사용하여 유리 모세관의 끝 부분을 잘라 (ⅰ) 백금선에 유리 비드를 유리 모세관의 끝을 터치 (II) 발 밟아 백금선 가열 1-2 초 동안 스위치, 및 (iii) 1 ~ 2 초 후에, 백금선을 냉각시켜 유리 모세관의 끝 부분을 잘라.
- 각각 내부 (d 개의 i) 및 외부 (D 오) 모세관 구멍의 직경을 조정합니다. 내측 유리 모세관의 오리피스 직경, 10 5, 20 ㎛의 (d에서 I = 5, 10, 20 μm의)과 외부 유리 모세관의 (d 오)이 실험에서 60 μm의 (라 오 = 60 μm의)입니다.
참고 : 유리 모세관은 일회용이다. 유리 capillar의 제조를 반복하여이거 야.
- 각각 내부 (d 개의 i) 및 외부 (D 오) 모세관 구멍의 직경을 조정합니다. 내측 유리 모세관의 오리피스 직경, 10 5, 20 ㎛의 (d에서 I = 5, 10, 20 μm의)과 외부 유리 모세관의 (d 오)이 실험에서 60 μm의 (라 오 = 60 μm의)입니다.
생성 W / O의 미세 방울 2. 절차
- 오일 계면 활성제와 외부 유리 모세관을 입력합니다. 오일 및 계면 활성제의 혼합물은 헥사 (w / w)이 실험 (도 4a)의 소르 비탄 모노 올레 에이트 2 %를 함유한다.
참고 : 오일과 계면 활성제의 많은 조합이있다 (예를 들어, 오일 플루오르 또는 탄산 일 수있다 계면 활성제는 이온 성 비이 온성, 또는 플루오로 할 수있다).- 외부 유리 모세관에 헥사 데칸 포함 소르 비탄 모노 올레 에이트의 10 μl를 소개합니다. 도 4a에서, 외부 유리 모세관 (d 오)의 오리피스 직경은 60 μm의 (d 오 = 60 μm의)이다. 유리 모세관의 구멍을 조정하려면, 단계 1.2.4-1.2.5로 돌아갑니다.
- 홀더 (그림 4B)의 바닥 부분에 외부 모세관을 설정합니다.
- 드라모세관 작용에 의해 내 유리 모세관 (도 4C)으로 수용액 약 0.1 μL w. 도 4c에서, 내부 유리 모세관 (d 개의 I)의 구멍 직경은 10 μm의가 (d는 내가 10 μm의 =)입니다. 유리 모세관의 구멍을 조정하려면, 단계 1.2.4-1.2.5로 돌아갑니다.
- 홀더 (도 4D-a)의 상단부에 내측 모세관을 설정한다. 외부 모세관 (그림 4D-)에 내부 모세관을 삽입합니다. 그림에서와 같이 흰색 도트 원을 보면 4D-는, 외부 모세관 내부의 내부 모세관의 위치 (외부 모세관 (μm의 w) = (130)의 내부 직경) 관찰 (그림 4D-B를 C) 디지털 현미경을 사용하여 . 외측 모세관의 내부 모세관의 위치는 w = 100 ~ 150 ㎛, 설정해야한다.
참고 : 내부의 위치를 변경하려면외부 모세관의 모세관는 홀더의 상부에 나사를 켜십시오. 이것에 의해, 거리 (W)을 정밀하게 제어 할 수있다. - 1.5 ml의 샘플을 마이크로 튜브의 바닥에 헥사 함유 소르 비탄 모노 올 레이트 (w / w 2 %) 100 μl를 소개한다. 샘플의 마이크로 튜브 (도 4E-a)에서, 내측 및 외측 모세관으로 홀더를 설치한다. 공기 - 오일 인터페이스 (그림 4E-B)에서 멀리 유지하기 위해 외부 모세관을 확인하십시오.
- 원심 분리기 (그림 4 층) 미세 방울을 생성하기 위해 1 ~ 2 초 동안 1,600 XG의 중력에 탁상 스윙 아웃 형 미니 원심 분리기를 사용하여 샘플 마이크로 튜브. 실온에서 모든 실험을 수행한다.
참고 : 스윙 아웃 형 원심 분리기를 사용합니다. 액적 샘플 마이크로 튜브의 측벽에 충돌하고, 고정 각도 타입의 원심 분리를 사용할 때 분해된다. - 천천히 피펫 W / O 방울을 작성하고, 유리 (S)에 올려LIDE.
- 미세 방울의 캡처 된 이미지가 디지털 현미경 (배율 200 배)을 이용하여 생성.
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결과
본 연구에서는 모세관 기반 원심 미세 유동 장치 (도 1)를 사용하여 셀 크기 W / O의 미세 방울의 생성을위한 간단한 방법을 제시한다. 미세 유동 장치가 모세관 홀더 (도 2B)로 구성하고, 두 유리 모세관 (도 3c에 내부 및 외부 유리 모세관), 및 계면 활성제를 포함하는 기름을 포함하는 마이크로 튜브. 우리는 내측 유리 모세관에 시료 용액 0.1 μl를 주입하고, 외부 유리 모세관 (도 4d)에 내측 유리 모세관을 두었다. 셀 크기 W / O의 미세 방울은 샘플 용액 (17) (도 1b)의 분사 흐름의 플래 토우 레일리 불안정성에 의해 발생하고, 적어도 2 시간 17 안정 하였다.
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토론
이 장치를 사용하면, / O W 미세 방울은 단 분산 제트 흐름 (17)의 플래 토우 레일리 불안정성에 의해 발생되었다. 현미경 검사 위성 방울의 존재를 공개하지 않았다. 장치의 제조에있어서, 세 가지 중요한 단계가 성공적으로 단 분산 W / O의 미세 방울을 생성하는 것이 필수적이다. 우선, 오일 및 계면 활성제의 수용액의 직선 유동을 공급하는 네 개의 디스크 모세관 구멍이 동심원 형태로 배열되어야한다. 접촉 상부 홀더 경우 모세관의 선단이 쉽게 분해 때문에 둘째, 내부 모세관 신중 외측 모세관 내로 삽입 하였다. 이 작업은 어려울 수 있습니다, 그래서 우리는 돋보기를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 수용액 (17)의 분사 유량을 확인하기 위해, 외부 모세관 내부에 모세관의 위치는 w = 100 ~ 150 ㎛, 설정해야한다. 만약 원심 MIC에 의해 생성 된 W / O 용의 미세 방울의 크기 분포rofluidic 단 분산 장치가 아닌 외부 모세관 내부 모세관의 위치...
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공개 사항
이해 상충은 선언되지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 일본 과학기술개발기구(JST)의 PRESTO "세포 기능 설계 및 제어" 연구 영역, 일본 문부과학성(MEXT)의 혁신 분야 "분자 로봇"(프로젝트 번호 24104002)의 과학 연구 보조금, 일본 학회의 젊은 과학자를 위한 보조금(A)(프로젝트 번호 24680033) 및 과학 연구(B)(프로젝트 번호 26280097)의 지원을 받았습니다. JSPS(Promotion of Science) 및 Tokyo Tech 생명 과학 및 생명 공학 대학의 생명 과학 및 생명 공학 과정을 위한 창의적 디자인.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2mm 두께의 폴리아세탈 플라스틱 플레이트 | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (일본) | 244-6432-08 |
| 밀링 머신 | Tool | Roland DG Co., Ltd. (일본) | MDX-40A |
| 엔드 밀 RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (일본) | 01-00644-00501 |
| M2*40 나사 | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (일본) | 제0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (일본) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (일본) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (일본) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (미국) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (일본) | ST-0150F |
| 헥사데칸 | 시약 | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (일본) | 080-03685 |
| 소르비탄 모노올레이트(Span 80) | 시약 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.(일본) | S0060 |
| Milli Q 시스템 | 시약 | Merck Millipore Corporation(독일) | ZRQSVP030 |
| 스윙 아웃식 미니 원심분리기 | 도구 | Hitech Co., Ltd.(일본) | ATT101 |
| 디지털 현미경 | 도구 | KEYENCE Corporation(일본) | VHX-2001 |
참고문헌
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