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방법 논문

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53864

⸱

2016년 4월 17일

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

이 논문에서

요약

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

초록

닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

서론

포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다.

병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 - 복부.

OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다.

일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 - (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.

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프로토콜

계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 계란과 식 구조의 제조

  1. 달걀 :
    1. 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워.
      1. 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다.
      2. 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조).
  2. 식 구축 :
    1. 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단계에서, 500 ㎕의 TE (트리스 EDTA) 1.5 ㎖의 튜브에 키트에 제공된 버퍼에 DNA를 용출시킨다.
    2. 에탄올을 3 M 아세트산 나트륨 50 μL 튜브 100 % 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 농축하는 DNA를 침전. -20 ° CO / N에서 튜브를 놓습니다.
    3. 4 ℃에서 14,000 rpm으로 30 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 실온에서 10 분 동안 펠렛을 공기 건조. ~ 4 μg의 / μL의 농도를 산출한다 15 ㎕의 TE 버퍼에 펠렛을 용해.
      참고 : 여기에 사용되는 제어 식 구조는 닭 β - 액틴 프로모터에 의해 구동된다 pMES-IRES-GFP (10), 또는 PCI-H2B-IRES-RFP 있습니다 CMV 프로모터에 의해 구동된다> (10), 최대.

비켜 마이크로 전기에와 비켜 세포 증식 분석 2. 닭

  1. 발현 구조체 및 마이크로 일렉트로 비켜 마이크로 인젝션 조작에있어서 :
    1. 2.5 X 2.5 mm 상자 플래티넘 난방 필라멘트에 대해 다음과 최적화 된 매개 변수를 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 바늘로 유리 모세관 튜브를 당겨 : 압력 = 500, 열 = 600 ° C, 속도 = (105), 및 시간 = 64 당겨 = 150 밀리 초 (표 1 참조).
    2. 왼쪽 및 현미경을 측면 오른 손잡이 마이크로 매니퓰레이터 단계는 설정 (그림 1A 참조). 오른쪽 손잡이 마이크로 매니퓰레이터는 유리 모세관 바늘과 왼손 마이크로 매니퓰레이터는 전극 (그림 1A)를 보유하고를 보유하고있다.
    3. 절단에 의해 미세 주입을위한 미세 뽑아 유리 모세관 바늘을 준비겸자와 바늘의 끝은 현미경으로 작업하는 동안.
    4. 현미경으로 작업하는 동안 0.1 % 빠른 그린으로 색을 칠한 플라스미드 DNA의 2.5 μL와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 손으로 직접 바늘을 입력합니다.
    5. (그림 1A 참조) 금형 / 계란 유지 장치 내 옆에 누워 계란을 놓습니다. 가위 19 (그림 1A)를 사용하여 계란의 상단에 둥근 창을 잘라.
    6. 현미경으로 작업하는 동안주의 깊게 집게를 사용하여 배아를 오버레이 두 막을 엽니 다.
    7. 현미경에서 작업하는 동안, 수동으로 미세 조작기를 사용하여 마이크로 일렉트로 오른손을 사용하여 마이크로 인젝션에 의해 오른쪽 귀 소포 루멘 플라스미드 DNA의 약 0.5 ~ μl를 제공한다.
      1. 동시에 왼손 머무르고 사용시 그래서 우측의 마이크로 매니퓰레이터 (도 1b-D)과 DNA와 오른쪽 귀 소포 루멘 마이크로 - 주입 수행태아의 머리가 단계 E4에서 딥 때문에 조지아 forcep는 배아의 머리를 안정합니다. 이 귀의 소포가 손상 될 수 있기 때문에, 귀의 소포 루멘 과거 마이크로 주입하지 마십시오.
      2. 바로 마이크로 주사 후, 현미경으로 작업하는 동안, 양극 (양극) 백금 전극의 전방-복부 오른쪽 귀의 소포 및 병렬 부정적인 2mm 전극 (음극)에 2mm를 배치 왼쪽 미세 조작기를 사용 1mm 간격 (도 1 C 참조). 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격으로 12 V에서 4 펄스를 제공합니다. 왼쪽 귀의 소포는 내부 처리되지 않은 제어 역할을합니다.
        참고 : 1X PBS에 담근 면봉 electroporations 사이에 전극을 청소합니다.
  2. 비켜 세포 증식 분석에서 :
    1. 즉시 전기 후 수동으로 전체에 50 μl의 에듀 솔루션을 놓아 0.25 밀리그램의 50 μl를 추가 / ㎖ EDU 1X PBS에서피펫을 사용하여 OVO의 배아. 테이프로 계란을 밀봉하고 18 일 동안 인큐베이터로 돌아 - 96 시간.
    2. ( '그림 1 EE 참조) 표준 형광 현미경을 사용하여 24 시간 - 조심스럽게 테이프를 제거하고 18 후 귀의 소포 내에서 형광 GFP 또는 RFP 신호의 배아를 확인합니다. 형광 시그널이있는 경우 ( 'FP도 1 참조),이 시점에서 분석을 위해 수확하거나 배아 테이프 봉인 및 수집 동안 인큐베이터로 돌아가서 이후 단계에서 분석한다.
      참고 : - 7 시간 전기 10 후 pMES-IRES-GFP 구조와 GFP 신호의 발현은 6 분명하다.

현장 하이브리드 및 면역 조직에서 RNA 3. 배아 수확 및 조직 처리

  1. 집게를 사용하여 배아를 수확. 차가운 1X PBS에서 배아를 씻어. 목으로 머리를 절단하여, 배아의 머리를 제거4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 O / N로 머리를 집게를 사용하고 배치합니다. 헤드 내부의 4 % 파라 포름 알데히드의 침투를 허용하는 forcep을 이용하여 뇌에 구멍.
  2. 4 ° C에서 O / N (1X PBS)에 30 % 자당의 머리를 탈수.
  3. 드라이 아이스와 메틸 부탄 (2- 메틸 부탄)의 슬러리에 급속 냉동하여 cryoprotective 매체의 헤드를 탑재합니다. 대안 적으로, 신속한 액체 질소 cryoprotective 매체에 헤드를 고정. -80 ° C에 탑재 된 헤드를 저장합니다.
  4. 12 μm의 두께 조직 섹션에 머리를 동결 절단 (Cryosections) 및 superfrosted 현미경 유리 슬라이드 위에 모든 내이 함유 조직 섹션을 수집합니다.
  5. 이전 4,21 바와 같이 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 화학의 표준 RNA를 수행하고, 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜은 다음 듀 세포 증식 분석.
    주 : 머리 셀의 토끼 폴리 클로 날 사용하여 식별 될 수-α를 MyosinVIIa (Myo7a)을tibody (1 : 1000, 프로테우스 Biosciences 사)과 형광 표지 된 이차 항체 (1 : 250, 염소 항 - 토끼 AlexaFluor 488; 인비 트 로젠).

4. 이미지 캡처 및 처리

  1. 디지털 이미징 장비와 이미지를 가져 가라. 표준 형광 현미경 (배의 배율 40 배까지) 표준 와이드 필드 현미경을 사용하여 현장에서의 결과와 이미지 면역 조직 화학 염색 결과.
  2. 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​.

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결과

녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE ')와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 GFP 발현의 형광 이미징은 전기의이 방법은 우선적으로 BP에 상승을 제공하는 otocyst의 앞쪽-복부 측면을 대상으로했다 약 ~ 4 일까지 (그림 1 EH). 계내 혼성화 (ISH)에서 RNA는 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 결정하는 데 사용되었다. GFP는 청각에 의해 찍은 여부를 확인하려면감각 선조는 ISH 실험 BP 인접 부에서 수행 하였다. ...

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토론

오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘에 DNA를 미세 주입하는 귀의 소포의 앞쪽-복부 도메인에 의해으로 DNA를 대상으로, (그림. 1A-D 참조) 구체적 추정 청각 타겟팅 - (4- μg의 / μL ~ 3.5) 이에 따라 전극을 배치하는이 전기 매개 변수를 최적화 된 플라스미드 DNA의 농도를 최적화 12 V.에서 4 펄스의 최적화 된 전기 매개 변수 전달 (.도 1C를 참조), E4에서 기관. 처음에 우리가 시작 오유타은 형광 신호를 산출하지 6 V에서 electroporations을 실시. 전압...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
패스트 그린 FCF 파우더시그마F7252-5G
EdU 파우더InvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 이미징 키트InvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTX 하버드 장치
바나나-마이크로그래버 케이블 키트BTX 하버드 장치45-0216
오른손잡이 & 왼손잡이용 마이크로매니퓰레이터World Precision Instruments Inc. M3301R 및 M3301L
7인치 수직 포스트가 있는 두 개의 12mm 자기 홀딩 장치 스테이지World Precision Instruments Inc. M10
메탈 스틸 베이스 플레이트 12x24인치월드 프리시전 Instruments Inc. 5479
계란 용 가위 12cm 길이 곡선, 12mm 극세 칼날; 스프링 가위World Precision Instruments Inc. 14120
바늘을 당기기 위한 마이크로 피펫 풀러Sutter Instrument Co.P-97
2.5x2.5mm 박스 플래티넘 가열 필라멘트셔터 기기 Co.
유리 모세관 / 바늘 / 섬유 없음 / Borosil 1 mmFHC27-30-0
Hamilton 유리 주사기 100 μ lHamilton80601 모델 710LT
미네랄 오일(중) 해밀턴 유리 주사기Fisher ScientificO122-1
유리 주사기 및 유리 캡필러리 바늘 연결용 폴리에틸렌 튜브/무독성Becton Dickinson and Company (BD)427420 Intramedic Clay Adams 브랜드
3cc 일회용 주사기Becton Dickinson and Company (BD)309657
일회용 21 게이지 바늘Becton Dickinson and Company (BD)305122
2mm 백금 전극 한 쌍Bulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
전극 홀더Bulldog Bio. / NepageneCUY580
Dumont fine yplocks number 5Fine Science Tools (FST)
밀봉을 위한 무광택 마감 투명 테이프Office Depot520-928
면봉Fisher Scientific23-400-101
멸균 필터 팁
한 쌍계란

참고문헌

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  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871(2012).
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