여기에서는 안지오텐신 II의 요오드-125 표지 유사체를 사용하여 정량적, 농도 측정, 체외 수용체 자가방사선 촬영을 통해 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II 유형 1 수용체의 국소화를 설명하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 중앙 II 수용체 수용체 방사 법적 매핑을 수행하기위한 특정한 방사성 리간드를 사용하여 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II (중앙 II)에 대한 수용체 결합 패턴을 설명합니다.
조직 표본 채취 및 -80 ° C에 저장됩니다. 그라 이오 스탯은 coronally 섹션에 조직 (뇌)를 사용하고 충전 슬라이드에 섹션을 장착 해동. 슬라이드에 장착 된 조직 섹션은 중앙 II 수용체를 방사성 표지 125 I-SI-중앙 II에서 배양된다. 인접한 슬라이드 두 가지로 구분된다 : 수용체 포화 비 방사성 중앙 II의 농도 또는 존재하에 (NSP)를 '비특이적 결합을'1 중앙 II 수용체 아형 AT (1 R AT) 선택적 중앙 II 수용체 길항제 , 1 R 길항제 없음으로 '결합되지 합계'. 이 중앙 II 수용체 아형 AT (2 AT R)의 포화 농도의 길항제 (PD123319, 10 μM)도 incubati에 존재버퍼에 AT (1) R 하위 유형에 결합하는 125 I-SI-중앙 II를 제한합니다. 22 ° C가, NSP 슬라이드 10 μM PD123319과 로사 르탄에 노출되어 ~에서 30 분 사전 부화 중에 슬라이드 10 μM PD123319에 노출되는 '바인딩 합계'있다. 슬라이드는 '결합 합계'위한 PD123319의 존재하에 125 I-SI 중앙 II와 함께 배양하고, 분석 완충액에 NSP위한 PD123319과 로사 르탄, 여러 '세척'다음 완충액 및 물을 염과의 비를 제거한다 특히 방사성 리간드를 결합. 슬라이드는 전문 필름 카세트를 사용하여 다음자가 방사선 필름에 노출 타격 건조기를 사용하여 건조된다. 필름을 현상하고 이미지 독자적인 영상 시스템 및 스프레드 시트를 사용하여 시각적이고 정량적 농도계위한 컴퓨터로 스캐닝된다. 슬라이드의 추가 설정은 조직 학적 비교를 thionin 염색된다.
수용체자가 방사선을 사용하는 장점은 시각화하는 능력이다중앙 II 티슈 시험편의 단면 내의 시츄 수용체 및 해부학 인접한 조직 학적 기준 단면과 비교하여 조직의 영역을 식별한다.
서론
심혈관 질환 2011 년 1 년 미국에서 사망의 30 % 이상을 일으키는 원인이 미국에서 사망과 장애의 주요 원인이되고 있습니다. 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서 가장 최근의 통계는 세 개 이상 한 사람이 하나가 나타냅니다 심혈관 질환의 이상 유형입니다. 심장 혈관 연구는이 질병을 이해에 진전을 만들기 위해 계속되지만 세대가 나이가 점점 시작으로 이러한 노력을 계속하는 것이 필수적이다. 레닌 - 안지오텐신 시스템 (RAS)는 주로 (도 1) 2-8 교감 신경계의 동맥 경화, 염증, 전신 혈관 수축 및 활성화를 촉진하여 심혈 관계의 조절에 중요한 역할을한다.
RAS 장치 혈압 감소하는 신장의 방 사구체 세포 응답하여 혈류로 레닌 분비 될 때 활성화되는 호르몬 시스템, sympat 증가hetic 자극, 또는 황반 densa에 의한 나트륨의 흐름을 감소. 레닌 안지오텐신 I (ANG I)을 형성 (간에서 합성) 안 지오 텐시 노겐을 대사. 중앙 I는 안지오텐신 II (ANG II) 상기 RAS의 주요 이펙터 펩타이드를 형성하기 위해, 주로 폐, 신장, 혈관 내피 세포의 내강 측에, 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 의해 ectoenzym....
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프로토콜
이 연구 수행 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 맞은 노바 사우스 이스턴 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다, 제 8 판 (국립 아카데미 프레스, 워싱턴 DC, 2011 ).
수용체자가 방사선 1. 준비 조직 섹션
- 희생시 수확 신선한 뇌 조직, 및 알루미늄 호일 대신에 포장 -20 ° C에 냉동 빨리. 20 ° C 냉동 - 정확한 형상을 유지 두개골 내를 모의하는 뇌 몰드에서 뇌를 배치하기 위해, 알루미늄 호일 대신 랩. 30 분 후, 장소 밀봉 냉동 보관 백에 조직 및 장기 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 장치로 이동한다.
- -80 -10 ° C 및 -18 ℃의 최대의 최소로 설정 그라 이오 스탯에 C의 냉동고 및 전송 °, 피하기 위해 해동 관심의 냉동 조직 표본을 얻습니다.
- 조직 상에 시료만을 배지에 시료의 작은 부분을 포함하는 글리콜 수지계 매립 매체 마운트 놓는다. 뇌의 경우, 뇌는 관상면에서 절편 수 있도록 수직으로 장착된다.
- 조직은 저온 유지 장치 내에서 마이크로톰에 탑재하고 제자리에 단단히 조여 놓습니다. 배측 - 복부 축이 수직 일반적으로 사용하는 뇌지도 책이라는 동일한 안테 - postero 좌표에....
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결과
레닌 - 안지오텐신 시스템의 대사 경로의 개요도 2에 설명되어있는도 1 (R 1 R AT 2 AT) 안지오텐신 II 수용체 아형에 직접 포커스에 나타낸다. (3) 디스플레이를 관상 뇌의 이동도 도 4에 도시 된 바와 같이 다음 소정의 125 I-시앙 II 농도를 사용하여 수용체자가 방사선 절차를 통해 실행된다 현미경 슬라이드 상에 부. 도표 5는 골판지 등 상에 부착 된 수용체자가 방사선의 슬라이드에 대한 건조 공정을 도시 이어서,도 6에서 볼 및 개발 하였다. 표 2 목록을 정량 7. 교정 표준 단위
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토론
기술 된 프로토콜은 설치류 뇌 이전에 수거하고 -80 ℃에서 보관의 관상 부의 인접 부에서의 방사성 리간드의 결합을 '전체'및 '비특이적'의 시각화를 식별하고, 거의 모든 조직에 용이하게 적용 할 수 있다는 해부학 적 수용체 또는 방사성 리간드 결합 부위의 차이 금액을 표시 하부 구조를 해결했다. 프로토콜에서 설명하는 절차는 간단하고 정확하게 분석 결과를 해석 중요하다. 20 ㎛의 두께를 최적으로 결정 하였다; 단면이 너무 두꺼우면, 비 특이 적 결합 어려운 목표로 방사성 리간드의 결합을 해결하는 데있어 증가한다. 부분이 얇게 절단하면, 성공적으로 절단하고, 변형이없는 연속 부분을 저장하는 것이 곤란해진다. 최적의 절삭 온도로 인해 조직의 특성과 절 그리고 난의 두께가 약간 달라집니다이야 일반적으로 경험적으로 결정. 접촉 블레이드와 조직 사이되면, 시편의 배향을 검토하고, 다시 거리 블레이드로부터 조직 표본을 이동하고, 장착 공 재 방향으로 재정렬 할 수있다. 설치류의 뇌를 절단 할 때의 배.......
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공개 사항
Robert Speth는 안지오텐신 II 수용체에 대한 항체를 상업 공급업체에 라이선스했으며 해당 항체 판매로 로열티를 받습니다. 다른 저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH Grant HL-113905의 지원을 받았습니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 500 ml 플라스틱 비커 | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm 커버슬립 | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| 상업용 헤어 드라이어 | Conair | 모델 SD6X | |
| 일회용 배양 튜브 | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (디소듐 솔, 디하이드레이트) | USB Corporation | 15-699 | |
| 에탄올 | 피셔 | 16-100-210 | |
| D-19 개발자 사진작가를 위한 약전 대체 | 품 Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| 빙하 아세트산 | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| 필름 해결사 | Kodak | 5160320 | |
| 사진 flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way 슬라이드 그립 | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| 프리미엄 차지드 슬라이드, 미세 연마 가장자리 | 프리미어 현미경 슬라이드 | 9308W | |
| 125I 리간드 | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | 조지 워싱턴 대학교 | 에 의해 방사성 요오드 | |
| Fisher Scientific | HS15986 | ||
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (무수) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1갤론 |
참고문헌
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D.....
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재인쇄 및 허가
