방법 논문

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

DOI:

10.3791/53867

⸱

2016년 3월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

이 논문에서

요약

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우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

초록

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혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 - 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 - 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.

서론

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분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4.

VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체.

이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 - 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 ​​나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다.

우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 - 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능​​력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다.

생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 - 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다.

우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 10, 26입니다. 분석은 그들이 더 힘든 내피 세포 분석 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다.

우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.

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프로토콜

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IL-3의 제조의 소스 WEHI-3D​​ 에어컨 중간

주 : 마우스 과립 구성 백혈병 세포주 WEHI-3D​​는 IL-3을 함유하는 합성 배지를 생성하기 위해 배양한다.

  1. 둘 베코 변형 이글 배지에서 배양 WEHI-3D​​ (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 긴 수명 글루타민 보충제, 50 μg의가 / ㎖ 젠타 마이신. T175의 cm 3 조직 배양 플라스크에서 신선한 배지 50 ㎖로 성장 로그 단계에서 5 × 106 세포를 접종하고 약 7 일 동안 성장 또는 세포를 약 24으로 성장 그 로그 상을 통과 할 때까지 - 48 시간 (문화 과도한 세포 사멸을 방지). 500 mL를 한번에 제조 할 수있다 - (200)의 배치가되도록 조정 배지는 -20 ° C에서 여러 해 동안 저장 될 수있다.
  2. 15 분은 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 1,000 × g으로 플라스크와 스핀에서 유체 및 세포를 가만히 따르다. supern의 최고 90 %를 제거atant. 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 필터링합니다.
  3. 1 ml를 50 mL 및 -20 ° C에서 저장을위한 200 ml의 볼륨 또는 -70 ° C ~로 나누어지는 WEHI-3D​​ 에어컨 매체 (CM). 작은 분취 량의 장기 저장을위한 분석 준비 인자 의존적 세포주의 통과를위한 배양 배지를 제조하기위한 중간 볼륨 큰 볼륨에 유용하다. IL-3는 무균 조건 하에서 사용하는 경우 너무 해동 매체가 몇 주 동안 저장 될 수있다 4 ° C에서 상대적으로 안정적이다.
  4. 대안 적으로, 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 여과 된 후 배지로 희석하여 50 ng를 / ㎖의 농도로 재조합 마우스 IL-3를 사용한다.

VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 및 제어 바 / F3 셀 라인 2. 문화 및 평가

  1. DMEM에서 배양 바 제어 / F3 세포를 10 % FBS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 또는 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 안정화. 세포로부터 3 일에 대한 1시 15분 희석에서 통과 세포로그 상에 성장합니다.
  2. DMEM에서 배양-VEGFR2 EPOR-BA / F3 세포를 10 % FBS가를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 및 1 ㎎ / ㎖의 G418을 안정화. 로그 상에 성장하는 세포에서 1시 15분 희석에 통로 세포. 키메라 수용체의 구조와 표현에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오.
  3. 중앙 로그 상 문화에서 수확 제어 바 / F3 또는 VEGFR2-EPOR - 바 / F3 세포. 천천히 플라스크의 바닥으로부터 이들 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 피펫. 매체 IL-3를 함유 제거 (세포 펠렛을 회수하기 위해 5 분 동안 750 x g에서 10 ㎖, 원심 분리), 마우스 긴장성 인산 완충 식염수, pH가 7.3 (PBS)으로 세 번 세척 하였다.
  4. 10,000 세포 당 후 세척 상기 WEHI-3D-CM 또는 재조합 IL-3없이 회 DMEM 및 첨가제와 함께 세포, 및 7.4 × 104 세포 / ㎖ (즉, 13.5 μL 당 1000 세포의 농도로이 배지에 재현 탁 혈구를 사용하여 계산에 의해 결정된 135 μL)에 대한각각 분석의 반 정량적 또는 정량 버전에서 사용할 수 있습니다.
  5. 트리 판 블루 제외 (주의)에 의해 생존을위한 세포를 평가합니다. 세포 집단으로 1 혈구 100 셀들의 최소 개수 : PBS (0.4 %) (1)에 트리 판 블루를 섞는다. 염료을 차지 세포가 죽었거나 죽어 간주됩니다. 98 % 이상의 생존율 분석을 수행 할 필요가있다.

3. 반 정량 분석

  1. RT에서 72 웰 마이크로 웰 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 매체의 13.5 μL에 포함 된 세척 세포 (1,000 세포)를 추가합니다. 중력 바이어스 세포 농도를하지 않습니다에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의하십시오. 잘 보정 P20 자동 피펫 및 멸균 팁을 사용합니다.
  2. 교정 P20 피펫 또는, 바람직하게는, P2 피펫을 사용하여 (물론 1,000 세포를 포함하는 15 μL의 최종 볼륨을, 1.5 μL) 10 % 볼륨 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 캘리포니아를 타고재는 샘플의 pH, 소금 및 기타 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인합니다. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예를 들면, DMEM 또는 PBS, 각각) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 같은 팁 분쇄 혼합 보장합니다.
  3. 대조 시료를 들어, (ⅰ) 보통 단독으로 함유 더 포함 IL-3,하지 (ⅱ) WEHI-3BD CM-10 %의 최종 부피에서 단독 배지에 첨가; 및 / 또는 (ⅲ) VEGF-A에는 IL-3를 함유하지 않는 단독 배지에서 100ng의 / ㎖로 희석 하였다.
  4. 멸균, PBS 또는 매체와 마이크로 웰 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채우고 수 있도록 가스 교환 (물 티슈 페이퍼 젖과) 가습 컨테이너 내에서 접시를 놓습니다. 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 컨테이너 내에 세포를 인큐베이션. 테스트 샘플 및 미디어 구성 요소를 사용할 수있는 경우이 분석은 편안하게 한 사람이 3 시간에 설정할 수 있습니다.
  5. 일반적으로 16 시간 후 번호판을 평가배양이되는 포지티브 및 네거티브 샘플 사이의 시간 차별은 분명하다. 세포 배양에 표시하는 방법의 예 그림 3을 참조하십시오. 100 × 배율 - 40 표준 역 위상차 현미경을 사용하여 번호판을 분석합니다.
    참고 : 웰스 둥근 반투명 표시 셀을 포함 이러한 IL-3 또는 VEGF-A로지지 성장 인자를 포함. 지지 성장 인자없이 또는 배지 단독 웰 둥근 세포뿐만 아니라 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 찌꺼기 (예컨대,도 3c)의 수를 감소한다. 24 ~ 48 시간 게시물 배양에서 분석 평가하는 것은 감도 최적입니다.

4. 양적 생물 검정

  1. RT에서 표준 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 배지에서 세정 균체 (135 μL 10,000 세포)를 추가한다. 가전​​ 영향을주지 않습니다 중력에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의LL 농도.
  2. 10 % 볼륨 (15 μL) 보정 피펫 (P20)를 사용에서 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 샘플의 pH, 소금 또는 다른 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인하기 위해주의하십시오. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예., DMEM 또는 PBS) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 필터는 0.22 ㎛의 세공 셀룰로오스 아세테이트 원심 관 필터 유닛을 이용하여 소량 살균.
  3. 48 시간 동안 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포 성장 인자 및 / 또는 억제제 제의 혼합물을 인큐베이션. 물에 적신 휴지를 가지고 있으며, 가스 교환을 할 수있는 가습 컨테이너 내에서 분석을 수행합니다. 잘 내 생존 세포 수의 대용 마커 배양 기간의 종료에서, 이는 아래에 나열된 다른 방법 중 하나를 사용하여 분석 평가이다.
  4. 대안 1 : 3 H-thymidi북동 설립
    참고 :이 정량은 96 웰 플레이트 형식을 위해 설계되었습니다.
    1. 37 ° C (웰 당 150 ㎕의 부피)에서 48 시간 동안 분석 플레이트를 배양 한 후 (IL-3 / WEHI-3D ​​CM없이 학사 / F3 배지) 분석 배지 50 ㎕의 부피로 3 H 티미 딘을 추가 웰 당 1 μCi를 최종 투여 20 μCi를주고 잘 / ml의 농도로 당.
    2. 셀 수확기를 사용하여 세포를 수확하기 전에 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 접시를 품어. 섬광에 필터를 배치하여 각각의 샘플을 추출하여 액체 섬광 계수기로 정량화.
  5. 대안 # 2 : 셀룰러 ATP의 생물 발광 검출
    주 :이 방법은 집단의 생존 세포를 반영하는 생물 발광 신호를 생성 할 수있는 세포 용 해물과 결합 된 ATP 모니터링 시약을 사용한다.
    1. 를 Lyse 세포 ATP를 추출하고, 생성하는 ATP 모니터링 시약을 사용제조업체의 지시에 따라, 발광 신호를 출력한다. 96 웰 플레이트 형식과 호환 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오.
  6. 대안 3 : 실행 가능한 세포에 의한 표시 염료의 효소 감소
    참고 : 레사 주린 기반 분석은 세포 생존에 좋은 상관 관계를 보여줍니다.
    1. 레사 주린 계 염료로 배양 된 세포를 결합하고 제조자의 지시에 따른 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 정량화.

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결과

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이 섹션에서는, 우리는 VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정 (분석의 원리 그림 1 참조)의 필수 기능을 보여주는 실험의 결과를 보여줍니다. 다른 발표 된 연구는 다른 VEGFR-2 리간드, 돌연변이 VEGF 분자 및 저해 모노클로 날 항체 8,10,19,24-30에 대한 분석의 광범위한 응용 프로그램을 보여줍니다.

여기에 제시된 데이터는 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법은 세 가지 재조합 인간 리간드 (VEGF-165, VEGF-C 및 VEGF-D) VEGFR 대한 특이 활성을 정량화하는데 사용되는 분석법을 나타낸다 -2 저해 성 모노클로 날 항체 (베바 시주 맙)의 존재 하에서 VEGF-A (165)의 데이터는 VEGF-A (16...

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토론

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여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D​​ CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지에 IL-3 포함 매체로부터 세정 될 필요가있다. 리간드는 상이한 형태의 숫자에 올 수있는 바와 같이, 케어 시금 이러한 제조 할 때 수행되어야한다. 방부제, 항균제, 소금 또는 다른 산도의 버퍼 분석에 영향을 미칠 수 있고, 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포의 병렬 테스트 버퍼 관련 문제에 대해 알릴 수 있습니다 이유입니다.

우리는 모두에게 반 정량 및 정량 프로토콜을 사용합니다. 반 quantitati적이 분석은 이전 시간과 샘플을 요구하는 완전히 정량 분석​​에 투입, 샘플의...

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공개 사항

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스티븐 A. 스태커 및 마크 M. Achen은 일주기 기술 (주), 성장 인자의 VEGF 가족을 대상으로 치료제를 개발하는 회사의 주주입니다.

감사의 글

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SAS와 MGA는 프로젝트 그랜트, 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council of Australia, NHMRC)의 프로그램 그랜트 및 연구 펠로우십, 그리고 호주 빅토리아 주정부가 제공하는 운영 인프라 지원 프로그램(Operational Infrastructure Support Program)의 자금으로 지원됩니다. MMH는 Peter MacCallum Foundation Grant의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Trypan BlueSigma-AldrichT81540.4% 용액은 생존 가능한 세포를 측정하기 위해 세포 현탁액과 1:1로 사용됩니다. 위험-암을 유발할 수 있음
G418 황산염(유전신)Invivogenant-gn-5제제. 위험 - 알레르기 또는 천식 증상 또는 호흡 곤란을 일으킬 수 있습니다.
3H-ThymidinePerkinElmerNET-027이 방사성 뉴클레오시드는 유사분열 동안 염색체 DNA에 통합됩니다. 위험 방사선
Vialight Plus KitLonzaLT07-221사용하여 생존력을 정량화하기 위한 세포 ATP의 생물 발광 검출
.
Nunclon Delta Surface (72 well)가 있는 세포 Nunc MinitrayThermo Scientific136528Small microtitre plate
96 well Tissue Culture PlateFalcon, Corning Inc.
353072 DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
소태아 세럼Gibco  10099-141
세포 수확기Tomtec Life SciencesTomtec 수확기, 96 마하 3M 세포 수확기
액체 섬광 카운터LKB Wallac1205LKB Wallac 1205 베타 플레이트 섬광 카운터
UniFilter-96 GF / BPerkin Elmer6005177White 96-well Barex Microplate with GF / B filterof 1 µ m poresize
GentamicinGibco, Life Technologies15750-060
페니실린/스트렙토마이신Gibco, Life Technologies15140-122
0.22 um 공극 셀룰로오스 아세테이트 원심분리기 튜브 필터 유닛Costar, Corning Inc.8160원심분리기 튜브 필터는 0.22 &마이크로; m pore CA 멤브레인 함유 필터 유닛 500 µ L 용량 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브.
형광 리더BioTekBioTek Synergy 4 하이브리드 마이크로플레이트 리더 
PBS의 형질주입된 진핵 세포를 선택하기 위한 ATP 모니터링 시약 Prestoblue 세포 생존력 시약 Invitrogen A13261 Resazurin 기반 세포 생존력 지표를 의 환원 환경에서 빨간색으로 변함

참고문헌

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