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방법 논문

TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

5.4K 조회수

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DOI:

10.3791/53879

⸱

2016년 6월 2일

 ,  ,  , 
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다.

초록

TRUE 유전자 침묵은 (TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵 tilizing)의 tRNA 3 '처리 endoribonuclease, tRNase Z L을 안내하는 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)을 이용 기술을 입을 RNA의 지시 유전자 중 하나입니다 , 표적 RNA를 인식한다. sgRNAs 모든 형질 전환 시약없이 세포에 의해 용해 될 수 있고, 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간의 암세포에서 아폽토시스를 유도 할 수있다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 미치는 영향 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 세포 생존, 그리고 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 쿵푸를하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성하는 방법을 포함rther는 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가합니다. 약 2,000 명중은 16,384 heptamers 이루어지는 본격적인 sgRNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어 질 것으로 예상된다.

서론

(TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵을 tilizing) TRUE 유전자 침묵은 RNA 지시 유전자 침묵 기술 (1) 중 하나입니다. 이 기술은 개발 tRNase Z L (또는 3 'tRNase), tRNA의 3'처리 endoribonuclease의 속성을 기반으로하고있다 : 그것은을 인식하여 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)의 지시에 따라 어떤 예상 사이트에있는 모든 대상 RNA를 절단 할 수 있습니다 9 - 표적 RNA와 sgRNA (2) 사이에 형성된 프리 tRNA의 형상 또는 마이크로 사전의 tRNA 형 구조. 길이 NT를 일반적으로 7-31이다 sgRNA는 네 그룹, 5'- 절반의 tRNA, 헵 타머 RNA, 14 NT를 선형 RNA, 그리고 훅 RNA로 분류된다.

15 - 우리는 셀 (10) 생활에 다양한 인위적으로 설계 sgRNAs을 도입하여 TRUE 유전자 침묵의 효과를 증명하고있다. 우리는 또한 sgRNAs이 세포 위스콘신에 의해 흡수 될 수 있음을 보여 주었다모든 형질 전환 시약 사전 통 보없이 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간 암세포 (16)에 세포 자멸을 유도 할 수있다 - 18. 21 - TRUE 유전자 침묵은 tRNase Z L과 자연 sgRNAs (19)를 통해 세포 내와 세포 간 유전자 조절 네트워크 시스템에서 작동하도록 나타납니다.

우리는 혈액 암 (22)에 대한 잠재적 인 치료 헵 타머 형 sgRNAs 검색 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 구축했다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 대한 효과를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 그 중 4 마우스 이종 이식 실험에서 종양 성장 속도를 감소시키는 것으로 나타났다.

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 어떻게 포함세포 생존, 어떻게 더 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가하는 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성합니다. 이러한 프로토콜이 포함되지 않더라도 마우스 이종 이식 모델에서의 셀룰러 sgRNA 표적 RNA를위한 분석 및 sgRNAs 효과의 평가는, 17, 22 종래의 방법에 따라 수행 될 수있다.

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프로토콜

헵 타머 형 1. 건설 sgRNA 도서관

  1. 본격적인 라이브러리의 구축에 사용되지 않는 한, 384 (4-7) -7- NT 시퀀스의 서브 세트를 선택한다.
    참고 : 순서는 랜덤 및 / 또는 특정 세포의 RNA를 대상으로 설계 할 수있다. 후자의 경우, 헤어핀 구조 -4,10-의 바로 하류 -7- NT 서열에 상보 적절한 컴퓨터 프로그램 및 / 또는 시각, 선택 시퀀스들을 이용하여 표적 RNA에서의 tRNA의 T 아암 닮은 헤어핀 구조를 찾아 17, 18.
  2. 로 선택한 heptamers의 각을 합성 완전히 2'- O -methylated, 5'- 및 DNA / RNA 합성과 3'- 인산화 RNA. 제어 된 기공 유리 (CPG) 지지체 상 포스 방법을 사용하여 5'- 말단 4,4'- 디메 톡시 트리 틸 (DMT) 합성의 마지막 사이클에서 (5 '포스페이트를 추가) 보호기를 남겨 23.
    참고 : 사용자 정의 한건데nthetic RNA는 뉴클레오티드 공급 업체에서 얻을 수 있습니다.
  3. 마지막 합성주기의 완료 후, 8 시간 동안 55 ° C에서이를 1 ㎖의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드를 추가 테플론 라이너 스크류 캡이있는 유리 병에 컬럼으로부터 합성 올리고 뉴클레오티드와 CPG를 전송하고, 부화 소비재에서 올리고 뉴클레오티드를 절단하고 기지와 인산염에서 보호 그룹을 제거합니다.
  4. 40 ° C에서 원심 증발기로 암모늄 히드 록 시드를 증발시키고, 0.2 mL의 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트로 올리고 뉴클레오티드를 재용.
  5. 10~50% 아세토 니트릴 / 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트를 함유하는 완충액, 폴리스티렌 - 디 비닐 벤젠 칼럼을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 정제하여 합성 올리고 뉴클레오티드. 80 ° C에서 25 분 동안 / 2.0 ml의에서 분 열을 실행합니다.
  6. 20 % 아세트산 용액을 제조하기 위해 분류 된 샘플 (1-2 ㎖)로 농축 아세트산 0.25-0.5 mL를 넣고 incubaTE, 실온에서 1 시간 동안이 용액은 DMT기를 제거한다.
  7. 40 ° C에서 원심 증발기를 사용하여 샘​​플을 건조하고 1 ml의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 그것을 재 - 용해하고, 5 '포스페이트의 측쇄를 제거하여 실온에서 15 분 동안 용액을 배양한다.
  8. 40 ° C에서 원심 증발기로 약 0.3 ml의 시료의 부피 (1 ml)로 줄인다.
  9. 차단 1000을 4 ℃에서 밤새 분자량 투석 튜브를 사용하여 증류수에 대한 전체 농축 샘플 (500 ml)에 투석.
  10. 그 후, 피펫으로 1.5 ㎖의 튜브로 투석 튜브로 투석 샘플을 이동시켜 40 ℃에서 원심 증발기로 건조하고, 볼륨있는 경우, 물에 대한 주입 등급 물에 재용 더 큰 100 μM 솔루션을 만들기에 충분 작은.
  11. 분광 광도계로 260 nm에서의 RNA 시료의 광학 밀도를 측정하고 (100)의 농도를 조정물에 대한 주입 등급의 물을 첨가하여 μM. -20 ° C 사용하기 전에 아래의 RNA 솔루션을 저장합니다.

세포 생존에 대한 sgRNA 도서관 2. 심사

  1. 준비 103 세포 / 99 μL / 웰 (예 : HL60 및 RPMI-8226) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시. 단지 배경 공제 미디어를 포함하는 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다.
  2. 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 세중 각 sgRNA를 분석. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  3. 각 웰에 시판 WST-8 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 1 내지 4 시간 동안 동일한 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  4. 흡광도 A를 측정마이크로 플레이트 리더 450 nm의에서 t.
    주 : 대부분의 경우, 흡광도 및 생존 세포 수 사이의 선형성 흡광도 값이 1.0를 초과하지 않는 한 유지 될 것으로 보인다.

유동 세포 계측법에 의한 효과적인 sgRNAs 3. 평가

  1. 준비 103 세포 / 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시에 99 μL / 웰 (예 : HL60). 하나 sgRNA가 테스트 될 때까지 적어도 10 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다.
  2. 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  3. 피펫으로 5 ㎖의 튜브에 적어도 10 웰로부터 동일한 sgRNA로 처리 된 세포를 수집한다. 30 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀0 XG, 미디어를 폐기합니다.
  4. 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 2 mL를 넣고 세포를 다시 일시. 300 XG에 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀, 그리고 PBS를 폐기합니다. 튜브에 1 배 넥신 V 결합 버퍼의 150 μl를 추가하고 세포를 다시 일시 중지합니다.
  5. , 피코 에리 트린의 2 μL (PE) π 공역 넥신 V 용액 튜브 내지 7 aminoactinomycin의 D (7AAD) 액 1 μl를 추가들을 잘 혼합하고, 어둠에서 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양한다. (24) 플로우 사이토 미터를 사용하여 샘플을 분석한다.

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결과

여섯 헵 타머 형 sgRNAs 5'- AUCUUCA-3 '(H1885), 5'- ACACACA-3'(H3277), 5'- GGGGGCG-3 '(H10927), 5'- GGGGCCC-3'(H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), 및 5'-CACCAGC-3'(H13260)을 화학적으로 3'- 및 5'- 포스페이트를 함유하는 O -2'- 메틸 RNA 합성 하였다.

이러한 sgRNAs은 인간 백혈병 세포주, HL60과 인간 골수종 세포주, RPMI-8226의 생존에 미치는 영향에 대해 조사 하였다. 세포 생존력 분석법 대표 결과.도 1에서 4 개의 sgRNAs H1885, H3277, H10927를...

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토론

대부분의 경우, 주사용 물 등급 물(농도 100μM)에 용해된 완전히 2'-O-메틸화, 5'- 및 3'-인산화된 헵타머형 sgRNA는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 활성으로 판단하여 최소 1년 동안 -20°C 미만에서 안정적인 것으로 나타난다. 그러나 안정성은 순서, 품질 및 순도에 따라 달라집니다. 어떤 경우에는 질량 분석 분석으로 판단할 때 sgRNA 분자 일부의 5'- 또는 3'-인산염이 보관 중에 자발적으로 제거되는 것으로 보이지만 이는 활성에 심각한 영향을 미치지 않을 수 있습니다.

라이브러리 스크리닝을 통해 히트 sgRNA를 얻으면 DNA 마이크로어레이 및/또는 차세대 시퀀싱을 통한 전사체 분석을 통해 세포 표적 RNA를 찾을 수 있습니다. 그러나, 지금까지 얻은 데이터는 형질감염 시약10,12,14,17,18의 존재 여부에 관계없이 헵타머형 sgRNA를 통한 표적 RNA의 하향 조절 수준이 일반적으로 보통임을 시사한다.

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공개 사항

Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences는 heptamer형 sgRNA의 하위 집합에 대한 특허 출원 중입니다.

감사의 글

이 작품은 대상 중심의 R & D, 일본 과학 기술 진흥기구, 일본의 사립 학교에 대한 홍보 및 공제 Corporation의 과학 연구 진흥 기금을 통해 적응력과 원활한 기술 이전 프로그램에서 지원하고, JSPS KAKENHI ​​그랜트 번호 24300342과 15H04313했다 .

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
맞춤형 헵타머 RNANippon Bioservice
OligoSep Prep HC 카트리지Transgenomic99-3860
물-주사 등급 물Otsuka Pharmaceutical 7131400A2129
RPMI-1640 매체Wako189-02025
소 태아 혈청SIGMA-ALDRICH172012-500ML
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액Nacalai Tesque26253-84
96 웰 플레이트Greiner Bio-one655 180
세포 계수 키트-8DOJINDO343-07623WST-8 용액
마이크로플레이트 리더, Sunrise Thermo RC-RTEKAN510-82851
FACS 둥근 바닥 튜브BD Falcon60819-820
인산염 완충 식염수SIGMA-ALDRICHP7059-1L
PE Annexin V 결합 버퍼BD Biosciences51-66121E
PE Annexin VBD Biosciences51-65875X
7AADSIGMA-ALDRICHA9400-1MG
유세포분석기, FACSCaliburBD Biosciences342973

참고문헌

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  17. Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
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  22. Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
  23. Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
  24. FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
  25. Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729(2014).

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