TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

요약

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다.

초록

TRUE 유전자 침묵은 (TR Nase Z의 ^L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵 tilizing)의 tRNA 3 '처리 endoribonuclease, tRNase Z ^L을 안내하는 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)을 이용 기술을 입을 RNA의 지시 유전자 중 하나입니다 , 표적 RNA를 인식한다. sgRNAs 모든 형질 전환 시약없이 세포에 의해 용해 될 수 있고, 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간의 암세포에서 아폽토시스를 유도 할 수있다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 미치는 영향 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 세포 생존, 그리고 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 쿵푸를하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성하는 방법을 포함rther는 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가합니다. 약 2,000 명중은 16,384 heptamers 이루어지는 본격적인 sgRNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어 질 것으로 예상된다.

서론

(TR Nase Z의 ^L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵을 tilizing) TRUE 유전자 침묵은 RNA 지시 유전자 침묵 기술 ⁽¹⁾ 중 하나입니다. 이 기술은 개발 tRNase Z ^L (또는 3 'tRNase), tRNA의 3'처리 endoribonuclease의 속성을 기반으로하고있다 : 그것은을 인식하여 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)의 지시에 따라 어떤 예상 사이트에있는 모든 대상 RNA를 절단 할 수 있습니다 ^{9 -} 표적 RNA와 sgRNA ^{(2) 사이에} 형성된 프리 tRNA의 형상 또는 마이크로 사전의 tRNA 형 구조. 길이 NT를 일반적으로 7-31이다 sgRNA는 네 그룹, 5'- 절반의 tRNA, 헵 타머 RNA, 14 NT를 선형 RNA, 그리고 훅 RNA로 분류된다.

^{15 -} 우리는 셀 ^{(10) 생활에} 다양한 인위적으로 설계 sgRNAs을 도입하여 TRUE 유전자 침묵의 효과를 증명하고있다. 우리는 또한 sgRNAs이 세포 위스콘신에 의해 흡수 될 수 있음....

프로토콜

헵 타머 형 1. 건설 sgRNA 도서관

1. 본격적인 라이브러리의 구축에 사용되지 않는 한, 384 ^(4-7) -7- NT 시퀀스의 서브 세트를 선택한다.
   참고 : 순서는 랜덤 및 / 또는 특정 세포의 RNA를 대상으로 설계 할 수있다. 후자의 경우, 헤어핀 구조 ^-4,10-의 바로 하류 -7- NT 서열에 상보 적절한 컴퓨터 프로그램 및 / 또는 시각, 선택 시퀀스들을 이용하여 표적 RNA에서의 tRNA의 T 아암 닮은 헤어핀 ^구조를 찾아 ^{17, 18.}
2. 로 선택한 heptamers의 각을 합성 완전히 2'- O -methylated, 5'- 및 DNA / RNA 합성과 3'- 인산화 RNA. 제어 된 기공 유리 (CPG) 지지체 상 포스 방법을 사용하여 5'- 말단 4,4'- 디메 톡시 트리 틸 (DMT) 합성의 마지막 사이클에서 (5 '포스페이트를 추가) 보호기를 남겨 ^23.
   참고 : 사용자 정의 한건데nthetic RNA는 뉴클레오티드 공급 업체에서 얻을 수 있습니다.
3. 마지막 합성주기의 완료 후, 8 시간 동안 55 ° C에서이를 1 ㎖의 29 % 암모늄....

결과

여섯 헵 타머 형 sgRNAs 5'- AUCUUCA-3 '(H1885), 5'- ACACACA-3'(H3277), 5'- GGGGGCG-3 '(H10927), 5'- GGGGCCC-3'(H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), 및 5'-CACCAGC-3'(H13260)을 화학적으로 3'- 및 5'- 포스페이트를 함유하는 O -2'- 메틸 RNA 합성 하였다.

이러한 sgRNAs은 인간 백혈병 세포주, HL60과 인간 골수종 세포주, RPMI-8226의 생존에 미치는 영향에 대해 조사 하였다. 세포 생존력 분석법 대표 결과.도 1에서 4 개의 sgRNAs H1885, H3277, H10927를.......

토론

대부분의 경우, 주사용 물 등급 물(농도 100μM)에 용해된 완전히 2'-O-메틸화, 5'- 및 3'-인산화된 헵타머형 sgRNA는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 활성으로 판단하여 최소 1년 동안 -20°C 미만에서 안정적인 것으로 나타난다. 그러나 안정성은 순서, 품질 및 순도에 따라 달라집니다. 어떤 경우에는 질량 분석 분석으로 판단할 때 sgRNA 분자 일부의 5'- 또는 3'-인산염이 보관 중에 자발적으로 제거되는 것으로 보이지만 이는 활성에 심각한 영향을 미치지 않을 수 있습니다.

라이브러리 스크리닝을 통해 히트 sgRNA를 얻으면 DNA 마이크로어레이 및/또는 차세대 시퀀싱을 통한 전사체 분석을 통해 세포 표적 RNA를 찾을 수 있습니다. 그러나, 지금까지 얻은 데이터는 형질감염 시약^{10,12,14,17,18}의 존재 여부에 관계없이 헵타머형 sgRNA를 통한 표적 RNA의 하향 조절 수준이 일반적으로 보통임을 시사한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
맞춤형 헵타머 RNA	Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC 카트리지	Transgenomic	99-3860
물-주사 등급 물	Otsuka Pharmaceutical	7131400A2129
RPMI-1640 매체	Wako	189-02025
소 태아 혈청	SIGMA-ALDRICH	172012-500ML
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액	Nacalai Tesque	26253-84
96 웰 플레이트	Greiner Bio-one	655 180
세포 계수 키트-8	DOJINDO	343-07623	WST-8 용액
마이크로플레이트 리더, Sunrise Thermo RC-R	TEKAN	510-82851
FACS 둥근 바닥 튜브	BD Falcon	60819-820
인산염 완충 식염수	SIGMA-ALDRICH	P7059-1L
PE Annexin V 결합 버퍼	BD Biosciences	51-66121E
PE Annexin V	BD Biosciences	51-65875X
7AAD	SIGMA-ALDRICH	A9400-1MG
유세포분석기, FACSCalibur	BD Biosciences	342973