해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

Summary

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

Abstract

기관 형성을 이해하기 위하여 조직의 발달 과정에서 발생하는 공간 및 시간 변화는 기록 될 필요가있다. 여기에 기재된 방법은 구조화 조명 및 Z 스택 획득을 구비 한 형광 해부 현미경을 사용하여 제브라 피쉬 배아 정상적인 신장 장애 개발 경과 분석을 허용한다. 와 형광 표지 된 신장 구조가 사용되었다 : nephrogenesis, 형질 전환 제브라 피쉬 (GFP)의 Tg (wt1b)를 시각화합니다. 신장 결함은 윌름 종양 유전자 wt1a 신장 발달에 중요한 것으로 알려진 인자에 대한 안티센스 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 주입함으로써 유발 하였다.

실험 장치의 장점은 추가 장비없이 X, Y 또는 z 방향으로 다시 조정 움직임에 대한 간단한 전략 줌 현미경의 조합입니다. 온도 변화와 기계적 진동에 의해 유도되는 초점 드리프트를 회피하려면, 오토 포커스 전략 대신 보통 필요한 환경 챔버를 이용하는 도포 하였다. 인해 XY 드리프트의 위치 변화를 재조정하기 위해, 각인 재배치 그리드와 촬상 챔버를 사용 하였다.

이러한 공 초점 레이저 주사 또는 빛 시트 현미경 등의 광학 절편과 시간 경과 기록에 대한 더 복잡한 설정과 비교, 줌 현미경은 취급이 용이하다. 게다가, 이러한 분야의 높은 농도 및 연장 된 작업 거리로서 현미경 특정 혜택을 제공 해부.

여기에 제시된 기관 형성을 연구하는 방법도 광학 절편 수없는 형광 입체 현미경으로 사용될 수있다. 높은 처리량을 한정하지만, 이러한 기법은 일반적으로 현상 조직 및 장기 다이나믹스의 저속 기록을 위해 사용되는보다 복잡한 장비에 대안을 제공한다.

Introduction

낭배 이어 형성기 개인의 라이프 사이클의 다음 단계이다. 그것은 조직 및 기관을 생산하기위한 재 배열, 상호 작용 및 세포의 매우 자주 이동을 수반한다. 장기 발전 기본 프로세스의 부정확성들은 생활에 즉시 또는 나중에 또한 자신을 나타낼 수있는 질환으로 이끈다. 따라서, 기관 형성을 이해하는 것은 발달 생물학 및 생물 의학 연구에 큰 노력을하고있다. 특정 장기의 발달을 조사 할 수 있도록하기 위해서는,도 태아의 몸체 벽을 통해 표시한다. 이는 개발 과정에서 발생하는 공간 및 시간 변경의 기록을 할 수 있습니다. 또한, 기관 형성에 관여하는 인자의 중요성을 분석하기 위해서는, 변조 할 필요가있다.

생체 기관 형성의 조사를 위해 대단히 적합 하나의 유기체는 제브라 피쉬입니다. 그 transpar형광 형질 전환 라인의 사용과 함께 배아 발달 동안 ency 단백질 발현 및 분포 역학 관찰뿐만 아니라, 내부 기관 ^(1)의 시각화를 허용한다. 이것은 누구의 장기 현미경 분석에 액세스 할 수없는 포유 동물 모델에 비해 실시간으로 장기 개발의 조사에 관한 고유 한 이점을 제공한다. 또한, 다른 도구는 제브라 피쉬의 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 돌연변이 라인의 생성 옆 모르 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (MO)는 특정 기관의 발달에 관여하는 특정 유전자의 활성을 넉다운하는데 사용될 수있다. 수법의는 스플 라이스 사이트 또는 번역 개시 코돈 (8월)을 대상으로, 따라서 사전의 mRNA 또는 번역의 접합을 방해 하나.

제브라 피쉬 배아 신장의 pronephros은 신장 개발과 세대의 기능을 연구하는 해부학 간단하지만 가치있는 모델입니다신장 ^질환이 관련 말이지. 그것은 네프론이라는 두 개의 기능 단위로 구성되어 있습니다. 각각의 네프론은 혈액 여과 장소 ^3를 취하는 사구체로 구성되어 있습니다. 추가의 성분은 짧은 목 영역뿐만 아니라, ⁴ 배설강 만료 분비 용질의 재 흡수 및 덕트 세그먼트 세관이다. 상관없이 간단한 조성물의 조직 및 지브라 피쉬 pronephros의 다른 세포 유형의 포유류 신장 ^5,6- 매우 유사하다.

신장 개발에 매우 관여 한 인자는 상기 윌름 종양 억제 유전자 WT1 ^(7)에 의해 부호화된다. 제브라 피쉬는 wt1a라는 두 paralogs을 소유하고 pronephros ^8의 개발 과정에서 중복하지만 동일한 패턴으로 표현되는 wt1b. GFP 표지 pronephros 구조를 갖는 형질 전환 지브라 피쉬를 사용함으로써, wt1a <의 완전한 녹다운을 보였다/ EM> 또는 특정 스플 라이스 형태는 배아 신장의 심각하거나 가벼운 기형, 각각 ^{9, 10에} 연결됩니다.

여기에 설명 된 방법은 구조화 된 조명을 통해 광학 절편를 갖추고 형광 해부 현미경을 이용하여 제브라 피쉬 배아에서 정상 및 장애인 nephrogenesis의 시간 경과 분석을 할 수 있습니다. 일반적으로 광학 부분은 인 - 포커스 정보를 포함하는 이미지의 인수를 할 수 있습니다. 포커스 아웃 정보는 그러한 수학적 알고리즘 (예. 컨벌루션), 광학 설계 (예를 들어 공 초점 레이저 주사 현미경) 또는 이들의 조합 (예를 들어 구조화 조명) 등 다양한 방식으로 회피 될 수있다.

신장 발달에 결함을 유도하기 위해 우리는 안티센스 형질 전환 제브라 피쉬 라인에 주입 wt1a에 대한 MO (: GFP)의 Tg (wt1b)을 사용했다. 이 줄은 사구체, 목, 전방에서 GFP 형광을 보여줍니다세뇨관 ^{9, 10의} 일부. 레이저 스캐닝 또는 빛 시트 현미경 등의 광학 절편과 시간 경과 기록에 대한 더 복잡한 설정과 비교, 줌 현미경은 취급이 용이하고 저렴합니다. 또한, 구조화 된 조명 장치는 쉽게 확장 작업 거리와도 큰 필드로서 종래 형광 장비 (예를 들면 형광 램프, 필터)와 현미경 특정 이점을 제공 해부와 결합 될 수있다. 드리프트의 문제는 일반적으로 안정한 결과 필요한 추가적인 장비 (환경 챔버, 방진 테이블)을 사용하지 않고 해결 하였다. 오토 포커스 전략이 설립 각인 이전 그리드와 영상 챔버가 X 또는 Y 방향으로 드리프트 다음 위치를 다시 조정하기 위해 사용 하였다 초점 드리프트를 보정합니다.

제시된 방법은 또한 형광 스테레오 m 광학 절편 옵션없이 현미경에 적용 할 수있다icroscopes 정상적으로 개발 조직과 장기 역학의 시간 경과 기록에 사용되는 더 복잡한 장비에 대한 대안을 제공합니다.

Protocol

모든 동물 실험은 '실험 동물 관리의 원칙'뿐만 아니라에 동물의 보호에 관한 독일 법률의 현재 버전에 따라 수행 하였다.

안티센스 - 모르 폴리 노의 1. 준비 (MO)

1. , 3 mM의 MO 주식 솔루션을 준비 동결 건조 MO (유리 병에 300 nmol의)에 살균, 초순수 100 μl를 추가합니다. 완전한 용해를 들어, 5 분 동안 65 ° C까지 원액을 가열한다. 파라 필름과 유리 병을 밀봉하여 실온 (RT)에서 MO 주식 솔루션을 저장합니다. 그 유리 병 벽과 MO의 연결을 일으킬 수 있기 때문에 MO 원액을 진정하지 마십시오.
2. 멸균 초순수로 MO 원액을 희석함으로써 1㎜의 MO 작업 용액을 제조하고, 0.05 %의 최종 농도로 0.5 % 페놀 레드 용액을 추가한다.
   1. 하는 MO 작업 용액 10 μl를 얻을 3.3 μL MO 원액 5.7 ㎕의 물에 0.5 % 페놀 레드 시액 1 μl를 추가합니다. 있다솔루션을 작업의 새로운 배치를 준비하는 선수는 5 분 동안 65 ° C에 MO 원액을 가열한다.
3. 바늘의 막힘을 방지하기 위해, 원심 MO 작업 용액을 사용하기 전에. 예를 들어, 5 분 (RT) 15,000 XG에 MO 원액의 10 μl를 스핀 주입 상층 액의 8 μl를 제거합니다.
   참고 : 작업 손실 시간이 ¹¹ 위에 모르 폴리 노 솔루션 발생할 수 있습니다. 이를 제외하도록 한 제조사에 의해 공급되는 프로토콜 다음 UV 분광법에 의해 용액을 테스트 할 수있다. 감소 된 효과가 장시간 방치 관측되지 않은 모르 폴리 사용한 wt1a 경우 (3 mM의 작업 용액이 더 이상 하나 이상의 저장된 년).

2. 결합 쌍을 설정 및 컬렉션 수정란의

1. 분리 이동식 체에 장착 된 사육 컨테이너 선, 각 (GFP wt1b) 이전에 미세 주입에 오후는 Tg가 5 쌍을 설정밤 동안 남성과 여성.
   참고 : 짝짓기 쌍으로 사용되는 물고기가 사전 선별 및 좋은 "생산자"로 평가되어 있어야 충분한 계란이 성공적으로 주입 실험에 사용할 수 있도록합니다.
2. 조명이 켜지지 후 다음날 아침, 알을 먹는 물고기를 방지 체 위에 함께 남성과 여성을했습니다.
3. 산란을보세요. 4- 세포 단계 전에 주입 될 수 배치되어 계란의 양이 다시 암에서 (약 50), 분리 남성 도달하면. 주입의 첫 라운드를위한 배아 물이 가득 배양 접시에 파스퇴르 피펫으로 계란을 전송합니다. 계란의 추가 라운드를 얻으려면, 함께 별도 여러 번 상대 쌍을 배치합니다.

미세 주입 3. 준비 작업

참고 : 사전 단계 3.1 및 3.2를 수행합니다.

1. 주입 (미세 주입 접시) 동안 위치에있는 배아를 보유하고 접시 GL를 삽입을 준비하려면액체, 투명, 순수, 식품 등급의 실리콘으로 가득 94mm 페트리 접시로 40 ~ 45 ° 각도로 엉덩이를 슬라이드. 실리콘 경화 될 때 슬라이드를 제거합니다. 즉, 상기 실리콘 층에 홈을 생성한다.
   참고 : 또는 실리콘 아가로 오스 대신 1.5-3 %를 사용하고 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
2. 바늘 풀러 유리 모세관에서 주사 바늘을 생성합니다.
   1. 내부 필라멘트를 포함 모세관을 사용합니다.
      주 : 필라멘트 (3.3 참조) 메우기 후 바늘의 끝을 향해 MO 솔루션을 수송하는 데 도움이 될 것입니다.
   2. 바늘 풀러에 적절한 설정을 설정합니다. 제브라 피쉬에 주입을위한 좋은 바늘은 가늘고 긴 팁 ^{(12)이 있어야합니다.} 약 10 mm의 길이 및 매우 끝에서 1.5 ㎛의 직경을 갖는 팁을 생성한다. = 속도 = 40 시간 = 100 0 당겨 열 = 330 : 예를 들어, 다음과 같은 설정으로 수평 바늘 풀러를 사용합니다.
   3. 아래에있는 A 바늘의 품질을 검사현미경을 해부하고 짧거나 너무 긴 팁들을 정리.
      참고 : 짧은 팁 바늘이 매우 길고 얇은 팁 벤드 등이 융모막을 터치 할 때 동안 배아를 손상하는 경향을 관통하지 않습니다.
3. microloader 팁을 사용하여 MO 작업 용액 2 μL와 바늘을 백필 및 마이크로 인젝션 장치의 바늘 홀더에 삽입합니다.
4. 바늘이 선단 폐쇄 같이, 해부 현미경 날카로운 핀셋 바늘의 끝을 다시 협지하여 개구부를 생성한다. 또는 부드럽게 단단한 표면 (예. 작은 금속 블록 또는 핀셋의 뒷면)에 팁을 밀어 마이크로 인젝션 장치를 사용합니다.
5. 계수 배치 미네랄 오일 방울로 MO 작업 용액을 주입하여 주입 부피 보정. 약 200 (PL)의 사출 량을 얻기 위해 75 ㎛의 액적 직경 제조 분사의 기간을 조정한다.

4. 미세 주입 절차

1. 바늘이 (홈의 45 ° 각도 방향으로) 오는 곳에서 방향을 향해 식물 극 마이크로 인젝션 요리의 홈을 따라 한 세포 단계의 배아를 정렬합니다.
2. 융모막과 바늘에 노른자를 관통하는 2 세포 배아에 1의 노른자에 1 mM의 MO 작업 용액 (0.2 pmol의) 200 (PL)을 주입.
3. 넓은 개방과 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아 물이 가득 페트리 접시에 주입 된 배아를 모두 수집하고 28.5 ° C에서 그들을 품어.
4. 오후에는 넓은 개구 파스퇴르 피펫을 이용하여 데드 배아를 제거하고 배아 물을 교체한다.

생체 내 이미징을위한 태아 5. 준비

1. 다음날 아침, melanization을 억제하는 0.003 % N-페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 포함하는 배아 물 배아 물을 교체합니다. 낭배의 끝 그것 때문에 INTERF 전에 PTU를 적용하지 마십시오초기 배아 발달과 ERES.
   주의 : PTU는 독성 및 기형이다. 항상 장갑을 착용하고 흡입을 피하고 피부에 문의하십시오.
2. 원하는 발달 단계에서 해부 현미경으로 날카로운 핀셋으로 배아를 Dechorionate. 핀셋 한 쌍으로 융모막를 잡고 핀셋 한 쌍의 제 2과 융모막의 다른 쪽을 잡아보십시오. 조심스럽게 배아를 방해하지 않고 반대 방향으로 핀셋을 당깁니다.
3. PTU (0.003 %) 및 ​​0.02 % 에틸 3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 (Tricaine)를 함유 배아 물 PTU 함유 배아 물 (0.003 %)를 대체하여 배아 마취.
4. 아가로 오스 50 μm의 재배치 그리드와 커브 글라스 바닥 μ-접시에 저 융점의 배아를 포함. 적절한 삽입은 연습이 필요합니다.
   1. 1.5 ml의 반응 튜브에 0.7 % 아가로 오스 1 ml의 분취 량을 준비하고 36 ° C로 설정 열 블록에 넣어. TRA하는 넓은 개방과 파스퇴르 피펫을 사용하여μ-접시에 배아 nsfer. 울트라 얇은 팁과 파스퇴르 피펫을 사용하여 여분의 배아 물을 제거하고 강화 아가로 오스와 배아를 오버레이.
   2. 아가로 오스는 여전히 액체 인 반면, 관심의 구성뿐만 아니라 이전 격자까지의 거리와 관련하여, 원하는 위치에 두 젤 로더 팁 배아의 방향. 그리드와 가까운 주변에서 :로 (아래 지느러미 여기에) 유리 바닥에 최대한 가까운 관심의 구조 (여기 pronephros)를 놓습니다.
   3. 최적의 이미지 품질을 위해 바닥에 최대한 가깝게 배아 관심의 구조를 배치하여 배아 유리 바닥 간의 아가 층을 최소화한다. 게다가, 그리드에 가까운 부근에서 배아를 찾을 수 있지만, 그리드가 관심의 구조와 중첩되지 않습니다주의하십시오. 다른 μ-요리에 3-4 배아를 각각 포함하고 최고의 위치하는 하나를 사용하십시오.
   4. 아가로 오스 열심히하면 충분히 2의 배아 대기를 개최합니다-3 분 및 0.003 %의 PTU 0.02 % Tricaine을 포함하는 배아 물에 포함 된 배아를 오버레이. 여분의 배아 물을 가만히 따르다 또는 매우 얇은 팁과 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거합니다. 증발을 방지하기 위해 잠금 위치에서 μ 접시의 뚜껑을 닫는다.
      참고 : 그들이 영상 기록을 손상 것 같이, μ-접시에 기포의 발생을 피하십시오.

6. 현미경

참고 : 구조화 된 조명을 통해 광학 절편를 갖추고 현미경을 사용합니다. 멀티 채널, Z-스택, 시계열, 소프트웨어 자동 초점 및 확장 초점 : 다음과 같은 모듈을 포함하는 소프트웨어와 함께 기록 이미지.

1. Z-스택의 취득
   1. μ-요리 전환. 유리 바닥 이제 목적을 향 및 μ-접시 촬상 챔버로서 기능한다.
   2. 그리드 위치로 슬라이더를 전환하고 소프트웨어 컨트롤의 구조화 된 조명 모드를 활성화합니다.
   3. 보정시편과 선택의 채널 (들)에 대한 그리드 포커스는 초점 교정 마법사의 지침에 따라 (내장 배아)를 검사합니다.
   4. 는 z-스택 획득 모드를 활성화하고 중앙 모드로 설정합니다. 시편의 중앙으로 집중하고 센터를 클릭하여 Z- 스택의 중심 평면으로 설정합니다. 중심 위치 주변의 영역을 정의하여, Z 스택의 치수를 설정한다.
      주 : 객체 구조는 제 1 및 Z 스택의 마지막 평면 밖에서 크게 보이지 않을 것이다.
   5. 광학 부분 사이의 간격을 조정합니다. 가장 Z-해결을 위해 최적의 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어가 나이 퀴 스트 선정시 (50 % 오버랩) 다음과 같은 권장 거리를 설정합니다 필드의 목표 깊이를 기준으로합니다.
      참고 : 작은 파일 크기와 구조의 허가를 목표로하는 경우, 수동으로 더 큰 간격의 크기를 설정합니다. 권장보다 작은 단계를 설정하는 것은 단지 이상 증가없이 큰 파일 크기가 발생합니다등의 정보를 제공합니다.
2. 시간 경과 영상
   1. 시계열 도구를 열고 시계열 실험의 간격을 설정합니다. 예 레코드 Z 스택 이미지 5 시간의 기간 동안 매 30 분.
   2. 시간이 지남에 초점 드리프트를 보정하기 위해, 자동 초점 전략을 설정합니다. , 초점 전략 대화 상자를 선택 드롭 다운 목록에서 소프트웨어 자동 초점을 선택하고 기준 채널과 TL-브라이트 채널을 선택합니다.
   3. 오토 포커스와 각 시점을 시작합니다. 최적 시간 내에 신뢰성있는 검색 범위를 확보하기 위해, 고정 된 200 ㎛의 상대적으로 탐색 범위를 설정한다. 이 범위는 완전히 최대 스텝 크기 (샘플링 매개 변수)의 기본 품질 (품질 매개 변수)와 (범위 범위 매개 변수)를 스캔됩니다.
   4. 관심 (초점 ROI) 및 위치의 초점 영역 내에서 계량을 활성화, 자동 초점의 정밀도를 높이기 위해 관심의 구조를 중심으로 라이브 뷰 창에 초점 ROI 말했다.
      참고 : 경우시스템이 시간 경과 기록하는 동안 자동으로 중앙 Z 위치를 업데이트 소프트웨어 자동 초점 모듈 부족, 주어진 시간에 실험을 일시 중지하고 수동으로 초점을 조정하고 실험을 계속한다.
   5. 시계열 촬영 중에 잠재적 인 XY 드리프트를 보상하기 위해 소프트웨어의 십자선에 (이미징 챔버)를 각인 그리드의 특정 지점을 배치하고 스크린 샷을하여 위치를 저장합니다.
   6. 시계열 실험을 시작한다. 시계열 간격이 끝나기 전에 필요한 경우, 위치 스크린 샷에 따라 재 조정, 실험을 일시 중지합니다. 실험을 계속합니다.

7. 이미지 처리

1. 처리 탭으로 전환 및 방법 대화 상자에서 포커스 (EDF)의 확장 깊이를 선택합니다. 광학 부 취득하기 때문에, 화상 시리즈 최대 투영 알고리즘을 적용한다.
   참고 : 다음은 알고리즘이 카에 투사됩니다ightest 또는 제 1 단계에서 복합 차원 이미지 스택의 가장 어두운 화소, 결국에는 각 시점에 대한 결과를 화상으로서 높은 분산이 하나를 사용한다.
2. EDF 이미지 시리즈에서 시간 경과 동영상 (예 : AVI 또는 이동 파일)을 생성하기 위해 영화 내보내기 방법을 사용합니다.

Results

저속 현미경 장기간에 걸쳐 동적 생물학적 과정을 시청할 수있는 강력한 기술이다. 시간 경과 이미징 동안 자주 발생하는 문제는 온도 변화와 기계적 진동에 의해 유도되는 드리프트라는 X, Y 또는 z 방향의 운동이다. 여기에 제시된 방법은 환경 챔버와 방진 테이블없이 해부 현미경에 제브라 피쉬 배아 또는 애벌레에서의 형광 표지 된 구조를 기록 시간 경과 수 있습니다.

XY 드리프트의 보상을위한 시험편은 임프린트 이전 격자 (도 1)가 촬상 챔버에 삽입 하였다. 소프트웨어 툴의 십자선 관련된 그리드의 특정 포인트의 위치는 사전 조정 된 위치 (도 2a)로 시험편을 반환하는 데 사용 하였다. 제시된 결과는 줌 현미경을 사용하여 수득 하였다구조화 조명 (그림 2B)를 통해 광학 절편을위한 통합 슬라이더. 연속 초점 보정, 자동 초점 전략이 설립되었다. 이 전략에서, 소프트웨어 오토 매 시점 전에 최대 콘트라스트에 근거하여 초점을 찾기 위해 사용된다. 이 때문에 정의 초점면 후속 Z 스택 획득을위한 센터 계획으로 설정됩니다. 이 오토 포커스 공정 (도 2c) 중 충분히 짧은 노출 시간을 허용하는 샘플에서 광독성을 최소화하기 위해, 투과광 브라이트 채널을 기준 채널로서 사용된다.

상기 방법은 형질 전환 지브라 피쉬 라인 및 제어 - wt1a morphant 배아 (: GFP)의 Tg (wt1b) 신장 개발의 비교 분석에 적용 하였다. 초기 nephrogenesis 동안이 라인은 신장 전구 세포는 ^{9, 10} 이상에서 발생하고, 중간 중배엽에서 녹색 형광을 보여줍니다성형 세관 및 네프론의 primordia (그림 3)입니다.

시간 경과 영상 녹화 제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 nephrogenesis이 (결과는 도시하지 않음) uninjected들에 비해 변경되지 않은이며, 초기 zebrafish의 신장 개발 ^(3)의 설명 단계에 따라 것을 알 수있다. 현상 pronephric 세뇨관 HPF (20)는 표시와 그 전방에있는 끝에서 형성 네프론의 primordia을 나타내는 세포의 구면 축적이 검출 될 수있다. 다음 시간 동안, 세관 및 네프론의 primordia 성장하고 나중에 primordia에는 ​​중간 선 (그림 4, 비디오 2)에 융합하기 시작합니다. 반면, nephrogenesis 심각 wt1a의 morphant 배아에서 중단된다. GFP 양성 관 모양의 구조가 20 HPF에서 볼 수 있지만, 그들은 더 확산과 덜 개발 된 것으로 보인다. 또한, 더 적절한 네프론의 primordia이 형성되지 않았다. 가장 눈에 띄는 차이점은 마에하기그러나 그는 현상 pronephros (도 4, 비디오 2) 외부에서 형광 세포의 다수의 등장이 시점에서 배아를 제어한다. 그 후,이 세포는 pronephric 경기장을 떠나지 및 복부 (비디오 2)를 마이그레이션 할 수 있습니다.

제어 배아와 wt1b 형질 전환 라인의 wt1a의 morphants에서 신장 개발은 이전에 다른 고정 된 시점 ^9,10에서 이미지를 복용하여 비교하고있다. 이 정적 인 방법과는 달리, 시간 경과 기록은 정상 nephrogenesis 및 wt1a 고갈로 인한 신장 전구 세포의 misrouting의 역학을 수행 할 수 있습니다.

그림 1 : 이주 그리드와의 상용 상공 회의소에 포함 된 배아의 도식 그림. 요리는있다네 그리드 각 유리 커버 슬립의 저면에 인쇄 된 50 ㎛의 반복 거리로 나누어. 이미징 될 수있는 배아 관찰 광장에 근접 신장 구조, 거꾸로 포함하지만, 그리드 오버레이가 없습니다.되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :. 시간 경과 이미징 및 구조화 조명의 그리드 투사의 드리프트의 보상을위한 조정 재배치 그리드의 독특한 위치는 이미지 센터로 주어졌다 (노란색 십자선으로 표시) 이상 XY-정렬을위한 기준점 역할을 작은 변화의 경우입니다. 빨간색 사각형은 자동 초점 전략 (A)에 사용되는 관심 (ROI)의 영역을 나타냅니다. 광학 절편 WA구조화 조명에 의해 얻어진 s의. 이미지는 정확한 캘리브레이션 (B) 후 초점면에서 투영 된 격자 구조를 도시한다. 오토 포커스 전략 (빨간색 사각형)에 대한 ROI는 관심 (C)의 구조로 안정적인 자동 초점을 허용 (somites 여기) 대비 높은 특유의 배아 구조를 포함하도록 설정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 형질 전환 wt1b :. 녹색 형광에 GFP 배아 개발 신장에 지느러미 (A) 또는 측면 (B) 전송 및 형광 이미지를 오버레이는 왼쪽 전방으로 표시됩니다. NP, 네프론의 primordium; 태평양 표준시, pronephric 세관; 그저 그래진드기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : wt1a의 최저은 배아 신장 개발을 방해 대표, 시간 경과 녹화에서 포커스 이미지의 확장 깊이를.. 제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 신장 개발은 중간 선에 융합하기 시작 성장 세관 및 네프론의 primordia 정상 진행 상황을 보여줍니다. 반대로 wt1a의 morphants 적절한 네프론의 primordia 형성 못하고 GFP 양성 세포의 방대한 양 pronephric 필드의 외부. (NP, 네프론의 primordium, 태평양 표준시, pronephric 세관). 이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.

제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 정상적인 신장 개발의 보충 비디오 1. 시간 경과 기록. . (오른쪽 다운로드 클릭) 세관의 성장과 네프론의 primordia가 융합하기 시작하는 방법을 동영상을 보여줍니다. HPF (20)로부터 이미지를 5 시간에 걸쳐 30 분 간격으로 수행 하였다.

wt1a의 morphant 배아에서 방해 nephrogenesis의 보충 비디오 2. 시간 경과 기록. (오른쪽 다운로드 클릭). 비디오는 pronephric 지역 중 GFP 양성 세포의 이동을 보여줍니다. 20 HPF에서 시작, 이미지는 30 마일에서 찍은5 시간에 걸쳐 N 간격.

Discussion

제브라 피쉬는 인간의 질병의 척추 동물 개발 및 모델링 연구를위한 인기있는 모델 생물되고있다. 제브라 피쉬 배아 투명 남아 있기 때문에, 뇌와 심장 등의 개발 기관은 표준 준비 현미경을 이용하여 관찰 할 수있다. 기관 특정 형광 유전자 변형 라인을 활용하여 형광 현미경으로 살아있는 배아에서 개발의 여러 단계에 걸쳐 기관 형성 평가를 할 수 있습니다. 표준 표면 형광 현미경 전체 장기의 세부 구조를 이미징하는 한 제한은 초점면의 상하에 물체로부터의 신호의 영향이다. 이 포커스 아웃 빛이되지 감소 이미지 대비 해상도 만 결과는 또한 관심 ^13,14의 중요한 구조를 모호하게 할 수있다. 디스크 confocal- 또는 다 광자 현미경 회전 레이저 스캐닝 confocal- 같은 몇 가지 기술은 아웃 - 오브 - 포커스 정보함으로써 increas을 최소화하기 위해 개발되어왔다전자 이미지 대비뿐만 아니라 축 해상도입니다. 광학 부분을 획득하기 위해 다른 방법으로는 레이저 가공 스캔 자유로운 구조 조명 현미경 정규 현미경 ⁽¹⁵⁾ 상에 구현하기가 간단하며 다양한 조명 필드 기반 기술이다. 여기에 제시된 결과는 해부 현미경에 구현 및 확장 초점 이미지의 재건과 결합 된 구조화 조명에 의해 달성 광학 절편은, 정상의 세부 구조의 시각화를 가능하게한다는 설명과 제브라 피쉬의 신장 발달을 방해. 특히, wt1a의 morphants에서 GFP 양성 세포는 다양한 초점 깊이에 분산되어, 밖으로 외 초점 흐림 하나의 평면의 이미지는 표현형의 세 차원 복잡성을 과소 평가합니다.

기관 조직, 재 배열 또는 중단의 역학을 수행하기 위해, 시간 경과 형광 현미경 복잡한 기술이기는하지만 강력한입니다. 시간 경과시이미지 약간의 진동이나 작은 온도 변화는 X, Y 또는 z 방향으로 드리프트가 발생합니다. 이는 안정적인 결과를 얻기 위해서는 추가적인 장비 (환경 챔버, 방진 테이블)을 요구한다. 제시된 방법은 추가적인 장치없이 저속 이미지를 기록하기위한 전동 포커스 드라이브 해부 현미경의 능력을 이용한다. 안정한 초점을 유지하기 위해 자동 초점 전략을 수립하고, 촬상 챔버의 바닥에 임프린트 재배치 그리드는 (X)의 보정 Y- 불안정성 사용 하였다.

배아의 적절한 삽입 프로토콜 내에서 중요한 단계입니다. 연습은 그와 중첩없이 그리드 등의 유리 바닥에 최대한 가까이 가까운 주변에 대한 관심의 구조를 배치 할 필요가있다.

이 방법의 가장 큰 장점은 이러한 생활의 성장 및 마이그레이션 등의 발달 과정을 직접 관찰 저렴하고 간단한 도구입니다 것입니다몇 시간 동안 배아. 또한, 이러한보기와 확장 된 작동 거리의 큰 필드로 해부 현미경 별 혜택은 전체 기관을 포함하여 더 큰 샘플의 검사를 용이하게한다. 그러나, 몇 가지 제한을 명심해야한다. 확인하고 위치를 재조정 할 수있는 실험의 일시 정지는 절차에 시간과 강력한 온도 제어의 부재는 제브라 피쉬 ^(16)에 대해 28.5 ° C에서 시간 게시물 수정으로 정의 된 "표준"개발 시간을 변경합니다. 또 다른 잠재적 인 문제는 관심의 구조는 배아 또는 유충 안에 위치 할 때, 특히, 동물에 이미징 제한된 깊이이다. 이러한 구조는 somites 및 난황 사이에 위치해 있습니다 제브라 피쉬 pronephric 사구체이다. 사구체을 이미징 제한 깊이는 약 200 ㎛의 개발 5 일 후에 도달 거리였다. 반대로, L 형광 구조임을긴 시간 동안 이미지화 될 수있는 동물의 표면에 가까운 ocated. 예를 들면 간 세포는 적어도 9 DPF까지 이미징 접근 가능하다. 또 다른 한계는 아가 로스 및 Tricaine 처리의 배아 또는 유충의 장기 고정 각각 성장 지연 심장 부종을 유발한다는 것이다. 이것은 정상적인 발달을 방해 할 수 있기 때문에 관심이 일정 기간 경과 녹화 시간을 제한 할 것을 권장한다. 관심의 영상 구조 과정을 확인하는 것이 동물의와 전체 모양이 같은 실험 조건 하에서 만 포함하고 마취없이 유지 (끝) 비교하는 것이 도움이된다 일반적으로 개발한다.

5 시간 초점 이미지의 확장 깊이의 후속 계산의 기간 동안 30 분마다 정상의 초기 이벤트에 대한 공간 및 시간 정보를 제공 및 광학 섹션의 Z-스택을 녹화 B를 유도 신장 개발을 방해y를 wt1a의 최저 모르 폴리 노를 매개. 고정 된 시간에 영상 pronephros 개발을위한 GFP 라인은 ^{9,10 포인트} 밝혀 :. 이전에 수행 모르 폴리 노 녹다운 실험은 이미 신장 마커 ^{(17, 18)} 및 형질 전환 wt1b의 고용과 현장 하이브리드에서 Wt1a가 pronephros 형성의 초기에 중요한 역할을 충족하는 것으로 나타났습니다 중단 사구체 형태 형성에서 그 wt1a 결핍 결과 및 발 세포 사양을 실패했습니다. 이러한 정적 인 방법과는 달리, 시간 경과 기록은 직접 초기 제어 배아에서 nephrogenesis 및 wt1a의 morphants에서 멀리 pronephric 지역에서 GFP 양성 세포의 이동의 역학을 시각화. 시간이 지남에 잘못 라우팅 세포를 추적 할 수있는 가능성은보다 상세한 표현형 분석을 허용한다.

일반적으로, 여기서 제시되는 방법은 제공하는 저렴하고 복잡 대안 사용하기 쉬운 덜 접근 SEtups 일반적 등 (환경 챔버 방진 테이블 장착) 레이저 주사 현미경 광 시트 현미경으로 촬영 된 영상에 사용. 드리프트 문제를 해결하는 기술 루틴은 또한 형광 스테레오 현미경 등의 광학 절편 옵션없이 설정에서 시간 경과 이미지를 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다.

기술뿐만 아니라 신장의 개발을 조사하는 것이 적합하지만, 또한 심장, 간 또는 기타 기관의 정상적인 형태 형성 불량을 모니터에 적용 할 수있다. 또한, 본 방법은 상처 치유 나 재생 등의 배아 및 성체 유기체 모델의 다양한 역동적 공정을 관찰하는데 사용될 수있다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Control Morpholino	Gene tools, LLC	표준 제어 올리고	준비됨  제어  oligo
wt1a 모르폴리노스	Gene tools, LLC		Ref. 90.5%에 게시된 대로 첫 번째 스플라이스 기증자 부위를 대상으로 설계되었으며, 서열
페놀 레드 솔루션	Sigma	P0290	주입 추적자
peqGOLD 유니버설 아가로스	peqlab	35-1020	마이크로주입 접시를 준비하기 위해
유리 모세혈관을 준비하기 위해  (GC100F-10)	Hugo Sachs Elektronik	30-0019	주사 바늘을 생성하기 위해
마이크로로더 팁	Eppendorf	5242956003	마이크로주입 바늘을 로드하려면
Dumont 집게	Fine Sience Tools	91150-20	바늘 끝에 구멍을 생성하려면
배아 수(0.3x Danieaus´ 용액)			1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,  0.6 Ca(NO3)2, 5 mM Hepes, pH: 7,5; 메틸렌 블루를 추가하지 마십시오!
계수선 5mm/0.05mm	과학 서비스	PY68039-02	주입량 계산용
파스퇴르 피펫 137mm, 4.8ml	Roth	E305.1	난자 채취, 배아 이식 및 죽은 배아 제거
박형 팁이 있는 파스퇴르 피펫 157mm, 3.5ml	Roth	E304.1	과도한 수분 제거
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629	멜라닌화 억제용
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 (트리카인)	Sigma	E10521	제브라피쉬 마취
저융점 아가로스	Biozym	850111	포함용
µ-dish 35mm, high Glass Bottom Grid-50	ibidi	81148	이미징 챔버
젤 로더 팁	Hartenstein	GS05	적절한 포식을 위해 배아의 방향을 지정하려면
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
< 강력한>장비
마이크로피펫 풀러 (모델 P-97)	셔터 계기		주사 바늘을 생성하려면
Micromanipulator	Saur Laborbedarf		미세주입용
Thermomixer copact	Eppendorf		Thermoblock 저융점 아가로스
SZ61 (실체현미경)	Olympus		주입 제어용
Axio Zoom. V16	Zeiss		임베딩 및 이미징용
ApoTome.2 슬라이더	Zeiss		광학 절단용
AxioCam MRm	Zeiss		이미지 획득용
ZEN 2012	Zeiss		이미징 소프트웨어