이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

바이오 필름 관련 타겟팅

13.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53925

⸱

2016년 5월 5일

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

대부분의 박테리아 감염은 생물막을 생성합니다. 환경 덕분에, 생물막 관련 박테리아는 종종 표현형 약물 내성을 가지고 있습니다. 따라서 생물막에서 박테리아를 죽이는 새로운 항균 분자는 최우선 순위입니다. 당사는 생물막을 박멸하는 데 효과적인 항균 화합물을 신속하게 스크리닝하기 위한 분석을 수립합니다.

초록

대부분의 병원성 박테리아는 감염 중에 생물막을 형성할 수 있지만, 생물막을 조작하고 평가하는 것이 어렵기 때문에 대부분의 실험실 작업은 플랑크톤 세포로 수행됩니다. 여기에서는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 수행된 페그 플레이트 생물막 분석에 대해 설명합니다. 박테리아 생물막은 96웰 마이크로타이터 플레이트 뚜껑에 부착된 페그에서 성장하고, 완충액에 부드럽게 담궈 세척한 후 약물 챌린지 플레이트에 넣습니다. 후속 배양 후 다시 세척하고 형광 염료 resazurin이 생존 지표 역할을 하는 최종 회수 플레이트로 이동합니다. 이 분석은 사용 편의성, 신뢰성 및 재현성이 크게 향상될 뿐만 아니라 kinetic read로 수행될 때 풍부한 데이터를 제공합니다. 또한 이 분석은 종말점 형광 판독을 대신 수행하는 중간 처리량 약물 스크리닝 접근 방식에 맞게 조정할 수 있어 약물 발견 노력을 위한 경로를 제공합니다.

서론

병원성 미생물이 아닌 급성, 만성 감염 한 선도 생체 바이오 필름을 형성 할 수있다. 바이오 필름 ​​관련 감염은 이물질 (예를 들어, 인공 뼈 대체, 유방 보형물) 또는 기관 튜브 또는 요도 카테터 (2)의 설치의 주입을 포함하는 의료 절차의 심각한 위험 요인이다. 바이오 필름 ​​기반의 감염은 거의 스스로 삭제되지 않습니다 이러한 맥락에서, 항 감염 치료에도 면역 개인에, 거의 항상 필요하다. 황색 포도상 구균이 사용 중에 발생하는 바이오 필름 ​​관련 합병증에 연루 가장 자주 관찰 병원균 중 하나입니다 침습 의료 기기 3.

불행하게도, 보호 장벽 바이오 필름의 본질은 플랑크톤 세포 1,4보다 치료에 더 많은 내성을 만들고, 예측 임상 효능의 평가는 모두 초기의 중요한 부분입니다약물 개발뿐만 아니라 약제 내성 감시. 플랑크톤 배양 집중 실험실 조건이 충실 실제 질환 5 나타내지 수 증가가 확인된다. 상기 문제를 배합 생물막 표현형의 복제가 곤란하고, 기존 생물막 모델 지루한 높은 간 및 검정 내 가변성 6 겪는다. 따라서, 많은 연구자들은 필요성을함으로써 잠재적으로 세균 독성과 질병의 중요한 측면을 무시, 약물 감수성의 플랑크톤 세포 분석에 기본.

여기에서 우리는 특히, 세균을 분석하기위한 S.을 프로토콜을 설명 구균, 96 웰 바이오 필름 ​​기반 시스템을 이용하여 7,8- 미리 성장 생물막있다. biofilm 형성과 도전에 대한 프로토콜은 기본적으로 제조업체의 권장 사항을 따르는 동안, 우리는 biof의 가능성을 정량화하기위한 대안 풍부한 정보 방법론을 제시도전 후 ILM. 간단히, 박테리아 바이오 필름이 접시의 뚜껑에 부착 된 돌출 못에 형성 못 플레이트에서 배양한다. biofilm 형성 한 후, 못 부드럽게 플랑크톤 세포를 제거하는 PBS로 가득 신선한 판의 우물에 담근된다. 페그 뚜껑 부착 생물막으로 분석 될 다양한 농도의 항생제를 함유하는 새로운 도전 판에 전사된다. 제 인큐베이션 후, 뚜껑을 다시 제거하고 세정하고, 그들이 최종 인큐베이션 거쳐 염료, 레사 주린 함유 복구 플레이트에 전달된다. 레사 주린 변환 역학적으로 기록하거나 정의 회복 기간 후 엔드 포인트 판독으로서 수행 될 수있다. 바이오 필름의 가능성을 정량화이 염료 기반 방법은 지루한 CFU (콜로니 형성 단위) 상당히 원래 프로토콜 7에 기재된 계산 기반의 방법론을 다릅니다. 약물 도전 판 및 전환 반응 속도 레사 주린 OD 600 측정 생존 읽기의 역할생물막 생존을위한 빠르고, 신뢰할 수있는, 풍부한 정보와 기술적으로 간단한 분석을 제공하는 각각 플랑크톤과 생물막 세포의 아웃.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 바이오 필름 개시

  1. 영양이 풍부한 매체에 바이오 필름 생산 유기체의 문화를 성장. 글리세롤 재고 뮐러 - 힌튼 매체의 10ml에 황색 포도상 구균 균주 뉴먼을 접종한다. S.의 처리와 관련된 모든 작업을 수행합니다 장갑 및 바이오 안전성 캐비닛 내 구균.
  2. 회전 진탕 (100 ~ 200 RPM)에 37 ℃에서 16 시간 동안 품어.
  3. 분광 광도계 및 표준 큐벳 (: 1cm 경로 길이)를 사용하여 배양 OD (600)를 결정한다.
  4. 수식을 사용하여 chelexed 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (CRPMI) 9 0.1 OD 600 (접종)을 접종 20 ㎖를 준비하는 데 필요한 문화의 부피 (V)를 계산 : [V = 20 ㎖ * 0.1 / OD 600 (문화 )]
    참고 : 참조 9 CRPMI 준비에 대한 세부 정보를 제공합니다.
    1. 10,000 × g으로 1 분간 회전시켜 원심 분리기 튜브 및 펠렛 세포 (위)에서 계산 된 문화 볼륨을 추가합니다. 처리장에생물막 접종 재, 20 ㎖ CRPMI의 소비 성장 매체에 resuspend 세포 펠렛을 대기음.
  5. 25 ml의 저수지로 접종을 따르십시오.
  6. 조심스럽게 똑바로 잡아 당겨 멸균 96 웰 못 판에서 뚜껑을 제거합니다.
    참고 : 관리 아래 뚜껑에서 매달려 못을 오염되지 않도록주의해야합니다. 뚜껑은 바이오 안전성 캐비닛 내에서 깨끗한 표면에 거꾸로 배치 할 수 있습니다.
  7. 200 ㎕를 멀티 채널 피펫을 사용하여 바닥 판의 G 개의 행 (A)의 각 웰에 125 ㎕의 균액을 추가한다.
  8. 불임 제어와 같은 행 H의 각 웰에 125 ㎕의 멸균 CRPMI 매체를 입력합니다.
  9. 페그 - 뚜껑을 타고 아래로 향하게 못 함께 접시 바닥 위를 유지. 조심스럽게 각각의 우물과 개별 못 맞 춥니 다. 플레이트와 못 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 정렬되면, 조심스럽게 아래로 뚜껑을 낮 춥니 다. 말뚝 이후에 수행 재조정이 바닥 판은 계속 할 수 만진로 오정렬을 피행 H.에서 aminate 불임 컨트롤
  10. 단단히 밀봉 밀봉 가능한 플라스틱 백에 증발 장소 않도록 파라핀 필름 접시에 뚜껑을 밀봉. 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 낮게 가방 풍량 유지.
  11. 5 % CO 2 인큐베이터에서 48 시간 동안 37 ° C에서 진탕없이 인큐베이션.
    참고 : 성장의 48 시간은 S. 최적왔다 아우 레 우스는하지만, 다를 사용 유기체 기초.
    참고 : 정적 배양 좋은 출발점이지만 부드럽게 마이크로 통에 150 rpm으로 진탕, 분석을 최적화하는 것은 일부 S.의 biofilm 형성을 향상시킬 수있는 가능한 변화입니다 구균이 분리합니다.

생물막 도전 플레이트 2. 준비

  1. 일관되지 않은 결과를 방지하려면 생물막 도전의 날에 신선한 96 웰 플레이트를 가지고 H.에 B를 행의 각 웰에, 실온으로 평형 CRPMI의 100 μl를 추가, 200 μl를 보유 할 수있는 96 웰 플레이트를 이용미디어의 쐐기 내부이며, 생물막 개시 판의 동일 치수 웰 특징 때.
  2. 단계 270에서, 최종 희석액을 설명하기 위하여, 원하는 최종 농도의 2 배 CRPMI 1.0 ㎖에 별도로 4 시험 화합물까지 희석.
    참고 : 좋은 출발점이 플랑크톤 세포의 억제 농도 위의 8 배이다.
  3. A3, 우물 A12에 A10에서 A9에 우물 A7에서 A6에 우물의 A4의 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 웰 A1에서 화합물 1의 200 μl를 추가합니다.
  4. 직렬 멀티 채널 피펫을 사용하여 시험 화합물을 희석 및 B 로우와 혼합하는 로우 A로부터 100 μl를 옮긴다.
  5. 이 방식으로, 웰에 웰 100 μL를 전송하는 것을 계속한다. 각 전송 후에 혼합 및 행 F.에서 중지
  6. 혼합 한 후, 폐기물 용기에 행 F 100 μl를 추방. 행 G와 H.에 액체를 전송하지 마십시오
  7. 멀티 채널 피펫에를 사용하여 플레이트의 각 웰에 CRPMI의 100 μl를 추가200 μL에 볼륨을 가지고. 최종 플레이트 레이아웃 그림 1을 참조하십시오.

3. 바이오 필름 도전

  1. 생물막 개시 판의 동일 치수 웰 특징 신선한 멸균 96- 웰 플레이트에 인산염 완충액 (PBS) 200 μL를 추가한다.
  2. 배양 생물막 개시 판에서 플라스틱 가방 및 파라핀 필름을 제거합니다.
  3. 똑바로 덮개를 들어 올립니다. 바이오 필름에 손상을 수도로 못 플레이트 바닥 사이의 접촉을 피하십시오. (3.8 참조) 이후 OD (600) 분석을 위해 바닥 부분을 유지합니다.
  4. (단계 3.1) PBS를 포함하는 판에 페그 - 뚜껑을 배치하여 플랑크톤 세포를 씻어. PBS에서 들어 올려 5 초 동안 못 잠수함, 그리고 잘 측면에 대해 못을 칠 않도록주의하면서, 한 번 더 잠수함.
  5. 도전 판에 세정 페그 뚜껑을 놓습니다. 생물막은 선도가 손상 될이 같은 구슬과 바닥면 사이의 불필요한 접촉을 피할 것일관성없는 결과.
  6. 단계 1.10에 설명 된대로 인감 파라핀 필름 판과는 밀봉 비닐 봉지에 넣습니다.
  7. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 24 시간 동안 진탕없이 플레이트를 인큐베이션.
  8. 3.3에서 생물막 개시 판의 바닥을보십시오. 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 박테리아를 재현 탁하고 행 H. 모든 우물하지만 불임 컨트롤에서 발생하는 성장을 확인하기 위해 적절한 마이크로 플레이트 리더로 OD 600을 측정

4. 바이오 필름 결정

  1. 변환을 레사 주린 검출하기위한 배양 챔버와 운동 형광 판독을 복용 할 수있는 장착 된 플레이트 리더를 사용합니다. 530 nm의 여기 및 590 nm의 방출을 사용하여 24 시간 운동 형광 측정을 설정합니다.
  2. 37 ° C에 챔버 온도를 설정하고 판 매 20 분을 읽을 수 있습니다. 제조자의 설명서 Printed에 따른 플레이트의 바닥에서 측정하는 플레이트 판독기 설정TIONS.
  3. 멸균 96 웰 플레이트에 멀티 채널 피펫 PBS 200 μl를 추가하여 세척 접시를 준비합니다.
  4. 0.8 mg을 400 μL를 첨가하여 생물막 복구 매체를 준비 / 16 μg의 / ㎖ 레사 주린 최종 농도 CRPMI 배지 20 ㎖에 원액 레사 주린 ㎖로.
    참고 : 레사 주린 알려진 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 처리하는 동안 실험실 코트, 고글, 장갑을 사용합니다. 생물막 복구 매체로서 CRPMI는 낮은 배경 신호를 제공하기 때문에 사용되었지만 적절한 경우는 뮐러 힌튼 배지로 대체 할 수있다.
  5. 신선한 96- 웰 플레이트의 각 웰에 멀티 채널 피펫 생물막 회복 배지 150 μl를 추가한다.
  6. 바이오 안전성 캐비닛에 인큐베이터에서 전송 도전 판 조심스럽게 비닐 봉지에 밀봉 필름을 제거합니다.
  7. 도전 판에서 페그 뚜껑을 제거하고 3.4에 기술 된 바와 같이 PBS에서 플랑크톤 세포를 씻어. 이후 OD 600 아나의 도전 판의 바닥을 유지용해 (4.10 참조).
  8. 세정 후, 생물막 복구 매체를 포함하는 접시 바닥에 PEG-뚜껑을 놓는다.
  9. 주변 우물의 바닥을 방해하지 않도록주의, 파라핀 필름 접시의 측면을 감싸. 즉시 판을 배치 한 후, 플레이트 리더에 배치 단계 4.1에서 이전에 운동 프로토콜 레사 주린했다 시작하여 24 시간의 기간 동안 운동 읽기를 시작합니다.
  10. 또는 도전하는 동안 발생하지 않을 수있다 플랑크톤 세포의 성장을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 전체 도전 판 하단의 OD (600)를 참조하십시오. 단계 3.8에 주어진 지시 사항을 따르십시오.
    주 : 조심 아니라 바이오 필름을 흘림 세포가 웰의 바닥에 덩어리 성장하는 경향이 각각의 내용을 재현 탁. 잘 내의 기포가 강하게 OD 600 판독을 방해하고 피하거나 읽기 전에 제거해야합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

레사 주린 분석은 확실하게 공격 후 약물없는 매체에 복제 할 수있는 거의 가능한 세포를 검출 할 정도로 민감하다. 이 방법에서는 더 레사 주린 변환이 24 시간 내에 보지되는 최저 농도와 최소 농도 생물막 근절을 정의한다. 레사 주린 분석은 분홍색 파란색에서 염료 색상을 변환 대사 활성 세포에서 발견 산화 분자에 의존한다. 염료 변환 따라서 세포 증식의 지표이며, 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 할 수있다. 본 논문에서는 neocuproine 및 Cu-neocuproine은 (neocuproine 구리와 복합) 바이오 필름 ​​관련 S.으로 자신의 활동에 대해 시험 하였다 아우 레 우스는도 1에 기초한 레이아웃을 적용. 프로토콜의 실행 중에 얻은 데이터는 품질 관리 역할 생물막 개시 플레이트의 OD 판독 (600)이다 (데이터는 도시하지 않...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기서는 S. 테스트 억제제의 활성을 결정하기 위해 수정 된 생물막 분석을 설명했다 생물막 관련된 세포의 대사 상태에 초점 구균 생물막. 설명 생물막 시작과 도전 절차 주로 모방 제조업체 권장하지만, 24 시간 억제제 도전을 생존 바이오 필름 관련 세포를 감지하고 정량화하는 염료를 레사 주린의 사용은 크게 세포 (물 목욕 음파를 통해) 복구 및 후속 열거의 권장 절차를 간소화 CFUs의 계산을 통해의 생존 세포. 이 제조업체에서 권장하는 절차를 집중하고 자동화하는 것은 비실용적 적어도 5 추가 조작 단계, 그들 각각이 발생하기 쉬운 오류, 노동을 포함한다. 페그 플레이트 분석의 판독 절차를 간소화의 장점은 높은 처리량 운영 및 응용 프로그램에 대한 매력을 증가시킨다.

단계의 수에 의하여 긴 프로토콜이 procedur 비록전자는 몇 가지 중요한 단계와, 오히려 개념적으로 간단합니다. 가장 결정적 반복적으로 동일한 품질의 바이오 필름을 성장하는 능...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

기술 지원을 해주신 Saran Kupul에게 감사드립니다. 이 작업은 FW에 대한 NIH 보조금 R01-AI104952의 일부 지원을 받았습니다. 추가 지원은 다음 NIH 기관에서 가능했던 NIH 자금 지원 프로그램(P30 AI027767)인 UAB(University of Alabama at Birmingham) AIDS 연구 센터(CFAR)에서 제공했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  Mueller-Hinton MediumOxoidCM0405
RPMI-mediumCorning의 권장 사항을 따르십시오 17-105-CV
CRPMIRef 9RPMI-1640 매체는 Chelex 100 수지로 1시간 동안 chelexed 한 다음 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 ResinBio Rad142-2822
MBEC-platesInnovotech19111
Resazurin Sodium SaltSigmaR7017800 µ DI 워터의 g/ml        필터 멸균
마이크로 플레이트 쉐이킹 플랫폼 Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 플레이트 리더Biotek
Gen5 소프트웨어Biotek레사주린 변환 기록 및 분석
NeocuproineSigmaN1501 100% 에탄올에 10mM 재고를 준비하고 -80°C에서 보관합니다. C
구리 황산염Acros Organics7758-99-8은 물에 100mM 저장 용액을 준비하고 4 º에 보관합니다. C
Cu-NeocuproineSelf-Made네오쿠프로인과 황산구리의 동일한 몰 농도를 혼합하여 생성됩니다. 혼합물을 CRPMI 배지에 원하는 농도로 희석하였다.
겐타마이신시그마G3632-1G
제조사 를 보충합니다.

참고문헌

  1. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
  2. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
  3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  4. Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19(2011).
  5. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
  6. Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).
  7. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
  8. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  9. Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
  10. Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
  12. Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854(2014).
  13. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
  14. Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53(2006).
  15. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CRPMI
바이오 필름 관련 타겟팅
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.