이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.
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방법 논문
다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
다발성 경화증은인지 모터 손상에 기인하는 중추 신경계 (CNS)에서 병변 형성을 특징으로하는 염증성자가 면역 질환 인 것으로 추정된다. 이 또한 CNS 병변의 형성, 모터의 손상을 특징으로하며,자가 면역 및 염증 반응에 의해 구동되기 때문에 실험적자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 MS의 유용한 동물 모델이다. EAE 모델 중 하나는 미엘린 희소 돌기 아교 세포 단백질 생쥐 (MOG) 35-55 유래의 펩타이드로 유도된다. EAE 마우스는 진행성 질환 코스를 개발한다. 이 과정은 세 단계로 구분됩니다 전임상 단계 (하루 0-9), 질병 발병 (일 10-11) 및 급성기 (일 12-14). MS와 EAE는 CNS 침투 자기 반응성 T 세포에 의해 유발된다. 이러한 T 세포는 또한 면역 세포의 채용으로 이어질 케모카인 및 사이토 카인을 분비한다. 척수 (D)에 따라서, 면역 세포 분포세 가지 질병의 단계를 uring하는 조사 하였다. T 세포, B 세포 및 단핵 세포의 활성화 / 확산 / 축적이 시작되는 질병의 시점을 강조하기 위해, 림프절, 비장 및 혈액에서 면역 세포 분포는 또한 평가 하였다. 또한, 세 가지 질병 단계에서 여러 가지 사이토 카인 (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ)의 수준은 질환의 염증 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해, 측정 하였다. 결론적으로, 데이터는 EAE 병리 동안 면역 세포의 기능 프로파일의 개요를 제공한다.
서론
다발성 경화증 (MS)과 대응하는 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 중추 신경계 (CNS)에서,자가 면역 신경 염증 변화를 나타낸다. 초기 활성 및 MS EAE 병변 침투 면역 세포의 존재를 특징으로한다. MS의 병인은 알려져 있지 않다, 그러나 널리 자기 반응성 T 세포에 의해 매개되는 수초의 파괴를 포함하는 것으로 간주된다. 이 자기 반응성 T 세포는 순환에서 B 세포, 단핵구 및 호중구와 같은 다른 면역 세포를 끌어 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비한다. 단핵 세포는 대 식세포로 분화. 자기 반응성 T 세포에 의해 분비 된 인터페론 감마 (IFNγ)는 염증성 식세포에 식세포 편광. 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸을 촉진 식세포 염증성 사이토 카인 방출 및 반응성 산소 종. 희소 돌기 아교 세포의 죽음은 탈수 초화로 연결됩니다. 또, B 세포는 P로 분화궁극적 미엘린의 열화 발생 lasma 세포 및 수초 대해 분리자가 항체. 수초의 손실은 신경 축삭 저하하여 MS (1)의 주요 특징을 나타내는 CNS의 병변 부위의 형성을 이끈다. 외주에서, T 세포와 B 세포는 림프절에서 활성화되고, 이들은 비장에서 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 이동한다. 단핵구 및 호중구가 골수 증식 및 중추 신경계로의 순환을 통해 마이그레이션도.
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프로토콜
윤리 선언문 : 우리의 실험 절차는 Regierungspräsidium 다름슈타트 (독일)의 윤리위원회의 승인을 국내 및 유럽 규정을 확인하고 있습니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용하는 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다.
1. EAE 모델
- EAE 모델의 유도
- EAE의 유도를 위해 10 13 주령 여성 129S4 / SvJae × C57BL / 6 마우스를 사용합니다.
- 상단에, 쥐에게 피하 주사를주고 encephalitogenic MOG (35), 허리 - 400 μg의 결핵균이 포함 된 200 ㎕를 완료 Freund`s 보조제 (CFA)에서 유화 55 (수초의 희소 돌기 아교 세포 당 단백질) 펩티드 (200 μg의).
주 : 음이 아닌 질환 유발 허위 대조군으로 같은 부피, 같은 경로에 의해 결핵균을 함유하는 프로 인트 불완전 보조제를 사용할 수있다. - THEReafter, 다시 24 시간 후, 마우스에게 (200 ㎕를 인산염 완충 식염수, PBS에 희석 총 0.2 μg의에서) 백일해 독소의 복강 내 주사를 제공합니다. 건강한 동물....
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결과
그림 1은이 문서에서 설명하는 다른 방법의 개략적 인 개요를 제공합니다. 1) 마우스는 MOG 35-55 항원의 주사를 수신 및 10.7 ± 0.3 일 (28) 후 초기 임상 증상을 개발한다. EAE 마우스의 대표적인 질병 코스. 그림 1과 2) 다양한 조직 (비장, 림프절, 요추 척수)에 표시되고 혈액은 전임상 단계 (2 일, 4 일 동안 서로 다른 시간 지점에서 제어 및 EAE 생쥐에서 추출 하루 6) 질환의 발병 동안 (10 일) 및 질병 (12 일, 14 일째). 3) EAE 발달을 조절하는 사이토 카인의 mRNA 발현 프로파일의 급성기, 각종의 판단 조직은 정량적 PCR을 사용하여 질병 과정에서 다른 시점에서 추출 하였다. 4) 단셀 추출 다.......
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토론
여기에 설명 된 EAE 모델은 MS의 모델로 가장 주목을 받고 있으며, 통상적으로 MS (32)에 대한 치료 적 전략을 시험에 사용된다. 마우스 질병은 MS의 많은 임상 및 조직 학적 특징을 나타내고 신경 세포의 항원에 대한자가 면역의 유도에 의해 발생합니다. 미엘린 항원에 감작은 CNS 내로 혈액 뇌 장벽 부전함으로써 면역 세포의 침윤과 관련된다. 우리의 연구 결과는 면역 세포가 급성 단계에서 림프절에 일시적으로 증가 할 것으로 나타났다. 비장 T 세포와 B 세포는 질병의 전임상 단계에서 감소한다. 호중구 질환 의존적으로 증가하는 반면 혈액 순환에있어서, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구는 전임상 단계에서 일시적으로 증가한다. 마지막으로, 척수, 면역 세포의 증가를 검출 (도 2)이다. 이러한 데이터는 T 세포 및 B 세포의 역할 비장, 마이그레이션 것을 나타이들 세포를 들어, 활성화 및 증식 된 림프절 저장조. 이어서, 이들은 척수로.......
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공개 사항
MJP는 Xellia와 Leo Pharmaceuticals의 컨설턴트입니다.
감사의 글
이 작업은 EKFS(Else Kröner-Fresenius Foundation) 연구 교육 그룹 TRIP(Translational Research Innovation - Pharma)와 헤센 주의 "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung"의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ABI Prism 7500 시퀀스 검출 시스템 | Applied Biosystems, Austin, USA | 정량 PCR 시스템 | |
| Accutase | Sigma Aldrich 뮌헨, 독일 | A6964 | 세포 분리 솔루션 |
| CD3-PE-CF594 | BD, 하이델베르크, 독일 | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, 하이델베르크, 독일 | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, 프랑크푸르트, 독일 | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, 프랑크푸르트, 독일 | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, 하이델베르크, 독일 | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, 독일 하이델베르크 | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | 보상 비드 |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| 사이토미터 설정 및 추적 비드 | BD, 하이델베르크, 독일 | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich 뮌헨, 독일 | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc 수용체-1 차단 완충액 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| 플로우 사이토메트릭 절대 계수 표준 | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo 소프트웨어 v10 | Treestar, Ashland, 미국 | 유세포 분석 소프트웨어 | |
| LSRII/Fortessa | BD, 하이델베르크, 독일 | 유세포 분석기 | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, 독일 하이델베르크 | 560600 | |
| 용해 용액 | BD, 독일 하이델베르크 | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | 형광 DNA 결합 염료 |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA 추출 키트 |
참고문헌
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida....
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재인쇄 및 허가
