방법 논문

절차 식물 추출물에서 분산 된 입자의 제거를위한 응집제의 효율성을 평가하는

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DOI:

10.3791/53940

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2016년 4월 9일

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

이 논문에서

요약

여기에 제시된 실험 설계 절차를 통해 식물 추출물에 분산된 입자를 응집시키는 능력 측면에서 다양한 응집제를 평가할 수 있으므로 탁도와 다운스트림 처리 비용을 줄일

수 있습니다.

초록

식물은 식품, 사료 및 원료와 같은 상품을 제공할 뿐만 아니라 바이오 의약품과 같은 부가가치 제품의 제조 플랫폼으로 사용될 수 있기 때문에 인간에게 점점 더 중요합니다. 두 경우 모두 미립자를 제거하기 위해 액체 식물 추출물을 정화해야 할 수 있습니다. 최적의 정화는 용량과 수명을 증가시켜 여과 및 원심분리 비용을 줄입니다. 이는 응집제(flocculants)로 알려진 하전 폴리머를 도입하여 달성할 수 있으며, 이는 분산된 입자를 가교하여 고체-액체 분리를 용이하게 합니다. 식물 추출물과 같은 복잡한 혼합물에 대한 기계론적 응집 모델이 없으므로 대신 경험적 모델이 사용됩니다. 여기에서는 다양한 응집제를 신속하게 스크리닝하고 식물 추출물의 정화를 최적화하며 탁도를 크게 줄일 수 있는 실험 설계 절차에 대해 설명합니다. 그 결과로 생성된 예측 모델을 통해 견고한 공정 조건과 보완적인 특성(예: 특정 전도도를 가진 추출물의 효과적인 응집)을 가진 폴리머 세트를 식별할 수 있습니다. 담배 잎 추출물에 대해 제시된 결과는 다른 식물 종 또는 조직에 쉽게 적용할 수 있으므로 상품 및 식물 유래 의약품에 대한 보다 비용 효율적인 다운스트림 공정 개발을 촉진할 것입니다.

서론

식물은 널리 과일 주스와 같은 음식 상품을 생산하는 데 사용되지만, 그들은 또한 높은 값 1-3 바이오 제품의 제조를위한 플랫폼으로 개발 될 수있다. 두 경우에서, 다운 스트림 프로세싱 (DSP)는 종종 입자 함유 추출물 -4,5-의 설명 다음에 그러한 잎 나 과일 등의 조직으로부터의 액체의 추출과 함께 시작된다. 의약품의 제조를위한, DSP의 비용이 전체 제조 비용 -6,7-의 80 %를 차지할 수 있고, 이것은 부분적으로는 블레이드 기반 호모 -8,9- 같은 파괴적 방법에 의해 제조 된 추출물의 높은 입자 부담 본 반영 . 필터층의 합리적 선택은 필터의 용량을 증가시키고 비용을 10,11 줄일 수 추출물의 입도 분포를 일치하지만, 개선 당 유지되어야 입자의 수에 의해 정의 된 절대 용량의 한도를 초과 할 수 없다필터 영역의 단위는 설명을 달성했다.

더 적은 입자가 여과 트레인에서 최고의 필터의 표면에 도달하면 천장이 해제 될 수 있고, 분산 입자가 큰 플록 (12)를 형성하도록 응집을 촉진 응집제라고도 중합체와 혼합 된 경우이 달성 될 수있다. 이러한 응집물은 미세하고 고가 깊이 필터 도달 입자의 부담을 줄이고, 거친 저렴 백 필터에 의해 상기 상류 유지 될 수있다. 중합체는 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수해야합니다 바이오 의약품에 대한 예 애플리케이션에 적합한 안전성 프로파일이 있어야하며 일반적으로 그들은 몰 질량> 100 kDa의가 있어야하며 중립적 또는 (13)를 충전 할 수 있습니다. 중성 응집제는 일반적으로 그 직경 응집 플록의 형성을 일으키는 분산 입자를 가교 결합하여 작용하는 반면 1mm 11 하전 중합체 (D)의 전하를 중화>ispersed 입자는 용해도를 감소시키고 따라서 침전 14하게한다.

응집은 추출물 15, 16의 특성과 일치하도록, 예컨대 완충액 pH 또는 전도도, 중합체 종류 나 농도 등의 파라미터를 조정함으로써 개선 될 수있다. 담배 0.5 내지 5.0 g의 L -1 폴리에틸렌 이민 (PEI)으로 전처리 추출물 깊이 필터 용량에서보다 2 배 증가 100 L 파일롯 스케일 공정에서보고되었다. 이 폴리머의 비용 미만 € 10kg 그렇게하는 과정에 도입 일괄 16 당 필터 및 소모품에 대한 € 6,000 비용 절감의 결과 또는 더 많은 경우 셀룰로오스 기반의 필터 보조기구 (17)와 결합 -1이다. 그럼에도 불구하고, 예측 모델은 포함이 15 ~ 30 분 (16, 18)의 유지 단계가 필요할 수 있기 때문에 저장을위한 추가 투자 비용의 결과로, 응집제의 사전 경제적 이익을 평가하는 데 필요한탱크. 그러나, 응집의 복잡한 특성으로 이러한 실험의 결과를 예측할 수있는 가능한 기계적인 모델은 현재 존재하지 않는다. 이 문서에 설명 된대로 따라서,보다 적절한 디자인의-실험 (미상) 접근 (19)는 개발되었다. 일반 교육청 절차에 대한 프로토콜은 최근 20 게시되었습니다.

소규모 장치 해주기 응집 조건 (21)의 고 처리량 스크리닝 할 수있다. 반응 용기 (~ 96 웰 플레이트에 웰 7 ㎜) 및 입자 또는 플록의 크기는 간격 크기 순서보다 작을 수 있기 때문에,이 장치가 현실적으로 식물의 응집 동안 조건을 시뮬레이션 할 수는 추출한다. 이 때문에 패턴과 모델의 예측 능력을 혼합에 영향을 줄 수 있습니다. 또한,이 때문에 혼합 침전물 행동 역 비선형 변화 침전 관련된 프로세스를 확장 어렵다부 합성 (22). 따라서이 문서는 100 L 파일럿 규모의 공정 (16)에 초기 20 ㎖ 반응 볼륨에서 확장 성 결과를 산출, 하루에 50-75 샘플의 처리량 벤치 탑 규모의 스크리닝 시스템을 설명합니다. 암컷의 접근 방식과 함께 사용하면이 예측 모델은 품질별로 디자인 개념의 일환으로 공정 최적화 및 문서에 사용 할 수 있습니다.

아래 설명 된 방법은 또한 응집제 또한 비용 절감 수단 (23)으로 간주되는 세포 배양 기반 프로세스, 의약품 제조에 적용 할 수있다. 카놀라유, 옥수수 및 대두 (24, 25)에서 생산 된 β 글루 쿠로니다 아제에 대한 입증 된 바와 같이 또한, 정제 전략의 일환으로 조 추출물로부터 표적 단백질의 침전을 모델링하는데 사용될 수있다. 응집제 군데의 상세한 설명은 다른 16,26 발견 될 수 있으며 확인하는 것이 중요하다 중합체 CONCENTR관리 포인트는 비 독성 또는 최종 제품 (11)에 유해한 수준 이하 중 하나입니다.

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프로토콜

1. 적절한 실험 전략 개발

  1. 응집 과정이 요인 응집에 가장 강력한 효과를 가지고있는 즉, 설립 또는 최적화 될 수 있도록 관련된 환경 및 프로세스 매개 변수를 확인합니다. 일반적으로, 최근 20 인해 기계적 모델의 부족에 필요한 바와 같이 암컷 접근하도록 그러한 몇몇 파라미터들이있다.
    1. 문학 데이터 (12), 시스템에 대한 사전 지식과 경험을 바탕으로 선택 매개 변수 (요인). 일반적인 요인 완충액 pH 버퍼 전도성, 배양 시간 및 온도뿐만 아니라 중합체의 종류와 농도 15,16,27을 포함한다.
    2. 범주 요인에 대한 의미있는 각 숫자 요인에 대한 범위와 수준을 정의하기 위해 동일한 참조 (1.1 참조)를 사용합니다.
    3. 실험 결과 (응답) 모니터링 응집 효율을 평가하기 위해 사용되는 정의한다. 시스템에 따라, 이것을여과 액 또는 상층 액 탁도, 침강 속도, 골재 크기 또는 후속 필터 16,23,28-30의 용량이 될 수 있습니다.
    4. 그 결과 고품질의 데이터는 이후 또는 다른 조작자에 의해 수행되는 실험을 보강 할 수 있도록 응답을 측정하기 위해 사용되는 검정 재현 / 정량적 견고하고 반복되도록.
  2. 요인의 수를 조사하고, 지식의 정도가 이미 시스템에 대한 축적 된 양복지 교육청 유형을 선택합니다. 적절한 미상 형 (20)을 식별하는 데 사용할 수 문학을 사용합니다.
    1. 매개 변수의 다수의 차폐되어 있거나 약간의 파라미터 범위의 의미에 대해 알려진 조사하는 응집 시스템에 대한 약간의 정보가있는 경우 선별 디자인을 선택한다. 일반적인 선별 디자인은 전체 및 부분 요인 설계이다. 파라미터가, 예를 들면 비선형 영향을 미칠 것으로 예상되는 경우, 설계 중심 포인트를 포함 특정 임계 값 19 위의 포화.
    2. 응답 표면 방법론 (RSM), 예를 들어 중앙 복합 디자인 (CCD) 31 또는 최적의 32, 33, 잘 알려진 범위가 단지 몇 요소가 필요하면 정확하게 특징으로 할를 선택합니다.
  3. 교육청 설계 공간의 비율이 20을 충족하는 등의 사전 품질 기준을 보장, 적절한 소프트웨어를 설치합니다.

2. 응집 실험을 준비

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그림 1 : 식물 추출물의 응집 워크 플로우 : 프로세스 스케일 (왼쪽)과 벤치 탑 규모 (오른쪽). 수성 완충액으로 단백질을 추출 후, 세포 파편의 분산 입자 응집제를 첨가하여 응집된다. 응집체 후 가방 깊이 여과 캐스케이드 이들의 능력에 의해 제거된다여액의 탁도와 함께 응집 필터의 효율을 측정하기 위해 직접 사용할 수있다.

  1. 일반 실험 워크 플로우 (그림 1)을 개발한다.
    1. 예를 들면 전문화 된 균질 최종 애플리케이션 규모 예상 동일한 입도 분포를 초래한다 (또는 이미 관찰) 추출 장치를 사용한다. 가능하면 담배 균질화 10 잎에서 기술 한 바와 같이, 추출기의 스케일 다운 모델을 설계한다.
    2. 응집 실험 (여기에 20 ㎖) 중에 사용 된 추출물 볼륨을 정의합니다. 입자의 대표적인 숫자를 반응 용기에 존재할 수있는 양을 선택, 20 ㎖ 씩의 예 응집 실험은 고체 (34)의 입경 ~ 0.5 / V ▼] ~ 7 % 함유하는 담배 추출물 재현성 및 확장 결과를 수득 μm의 ~ 3mm 16.
    3. 모든 모니터링 및 사후 응집 작업을 디자인하는 일 때문에EY 최종 애플리케이션 규모의 대표적인 생산 규모에서 사용 된 것과 동일한 입자 보유 동작으로 예를 들면 선택 필터.
  2. 추출물이 파생 될에서 식물을 재배.
    1. 같은 공장 라인, 여기에 담배 속 tabacum 이력서를 사용합니다. 쁘띠 하바나 SR1, 생산시 사용되는 배양 조건은 이전 33 설명했다.
    2. 다른 공급 원료를 처리 할 경우, 그들은 예를 들어, 최종 응용 프로그램의 규모를 대표하는 정통 버퍼를 사용하도록 이러한 공급 원료를 준비 고려 모든 희석 단계를 과정과 여기에, 예상 pH와 전도도에 pH가 7.5 스틱 전도성 (30) MS의 cm -1.
  3. 여과 유틸리티, 탁도-모니터링 장치 및 샘플링 용기를 준비합니다.
    1. 그렇지 않은 경우, 여기에 필요한 크기 15 X 15cm 2 필터 재료를 잘라 준비 - 투 - 우리전자 모​​듈. 모든 모니터링 및 분석 장치가 작동 있는지 확인하고 모든 샘플 튜브 라벨.
    2. 이러한 간단한 작업 비록 그들이 실제로 응집 실험 중에 중단을 야기되지 않도록하기 위해 시간에 이러한 항목을 준비한다. 그들이 그 응집을 주어진 결과를 방해 할 수 있기 때문에 지연을 방지하는 것은 시간에 따른 프로세스입니다.
  4. 응집제 재고 솔루션을 준비합니다. 주의 : 예를 들면 장갑을 응집제를 처리 할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 재료는 위험 할 수있다 (유럽 UE 67 / 548 / CEE에 따른 위험 라벨, 1999 / 45 / CE는 N, 사이 또는 Xn에 포함). 먼지를 피하고 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다.
    1. 여기에 각 응집제에 대한 주식 농도, 80.0 g의 L -1 사용 된 두 PEI의 응집제를위한 선택. 입자를 집중하고 줄일 응집제를 첨가 할 때 샘플의 희석을 피하기 위해 가능한 한 높은 선택 농도기 때문에이 응집 효율에 영향을 미친다.
    2. 폴리머가 이미 수성 50 % [w / V] 솔루션으로 공급되면 예, 중합체의 제조 업체의 제형을 반영하는 사전 희석을위한 계정. 4~8% 응집제의 스톡 용액 [승 / V] 지금까지 가장 적합한 것으로 밝혀졌다.
    3. 염두에 상술 점 베어링 응집제의 농도는 최종 농도 응집제가 정확하게 조정되어 있지 않기 때문에 잠재적 오류를 일으키는 피펫을 억제하는 고 점성 용액을 생성하지 않도록.
    4. 이 때문에 오류의 가능성을 감소시키는 피펫 방식 (2.5)의 설치를 촉진하기 때문에 가능하면 모든 응집제에 대해 동일한 재고 농도를 사용합니다.
    5. 추출물, 여기에서의 pH 및 전도도 4-10 15-55 밀리 cm -1의 조건에 일치하는 각 응집제 스톡 용액의 pH 및 전도도를 조정한다. m 경우 하나의 응집제에 대한 개별 주식을 준비pH 및 / 또는 전도도 조건 중 하나 세트보다 광석은 ​​고분자에 대한 시험한다.
    6. 사용하기 전에 48 시간보다 더 이상, 갓 응집제 재고 솔루션을 준비합니다. 응집 이상 4 주간 저장된 중합체 주식으로 유도 될 수 있지만, 효율이 높거나 낮은 pH 값에서 중합체의 가수 분해로 인해 감소 할 수있다. 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조하십시오.
    7. 여기, 4 ° C, 20 ° C, 37 °의 C를 배양 온도를 조절 할 수 가열 / 냉각 화장실이 보장 예를 들어, 미상 선택 매개 변수가 실험 기간 동안 각 샘플에 대해 정밀하게 조정할 수 있는지 확인합니다. 응집 동안 혼합하여 실험의 일부인 경우, 상기 혼합 장치는 전원 입력으로 임계 파라미터의 관점에서 최종 프로그램 규모를 나타내는 것을 보장한다.
  5. 피펫 계획에 미상 일정을 변환합니다.
    1. TES로 다른 응집제의 농도 변환추출 된 샘플에 첨가한다 원액 볼륨으로 테드 : 재고 농도 최종 농도 응집제 나누어 응집 실험에 사용 된 시료 부피 곱한다. 시료 20 ㎖이 22 ml의 것입니다 2 ml의 응집제 원액의 최대 혼합되어있는 경우 예를 들어, 가장 큰 결과 최종 부피를 식별합니다.
    2. 응집제 재고 0.75 ㎖를 다음 완충액 1.25 mL를이 유지해야하는 시료에 첨가해야하는 경우 응집제 주식의 큰 부피를 기준으로 모든 응집 분취 동일한 최종 부피를 유지하는 데 필요한 버퍼의 양을 첨가하기 위해, 예를 계산할 22 ml의 최종 샘플 량 (2.5.1).
    3. 에너지 부에 필요한 원액의 절대 양을 계산하기 위해 각각의 고분자 응집제의 응집 조건 스톡 용액의 양을 요약.
  6. 수확 담배 잎 추출을 준비합니다.
    1. 상위 6 레아를 제거이러한 또는 균질로 보이는 군 (또는 처리 지침에 의해 표시된만큼) 적절한 추출 장치에 대한 적절한 연령, 6 주 오래 예를 들어, 및 전송의 담배 공장에서 프레스 나사.
    2. 100g 당 예를 들어, g 바이오 매스 당 300 mL로 추출 버퍼의 세 권을 추가하고 8 분 동안 혼합.
    3. 다른 pH 및 / 또는 전도도가 테스트중인 경우 해당 버퍼 개별 추출물을 준비합니다. 여기,이 믹서에 3 × 30 초 또는 과즙 (34)의 식물 재료를 균질화 포함한다.
    4. 대안으로, 조사중인 프로세스의 대표적인 방법으로 추출물을 준비한다.
  7. 추출 나누어지는하고 버퍼를 추가합니다.
    1. 수동으로 철저히은 샘플 입자의 균일 한 분포가 균질 보장하기 위해 전체 과정 동안 추출을 자극.
    2. 정확하게 경사하여 미리 라벨링 반응 튜브 중에서 추출물 배포각 용기 여기에 20 ㎖. 셀프 서 50 ㎖ 튜브 처리를 단순화하고 20 ml의 샘플에 이상적이다.
    3. 적당한 피펫을 사용하여 각각의 반응 튜브 고정 최종 부피를 유지하는 데 필요한 각 추출 버퍼의 볼륨.

3. 응집 플랜트는 다른 폴리머와 추출

  1. 미상의 랜덤 실행 순서로 표시 순차적으로 샘플, 여기, 0.1-2.0 ml의 응집제 원액 필요한 볼륨을 피펫. 철저히 바로 정확히 20 초 동안 진탕 강렬한 설명서 의한 응집제를 첨가 한 후, 각 샘플을 혼합한다.
    1. 필요한 경우, 철저한 혼합을 보장하기 위해 다른 공급 원료의 진동 시간을 조정하지만, 엄격하게 모든 샘플에 대한 일관된 혼합 시간을 보장합니다. 플록의 돌이킬 수없는 혼란을 일으킬 수 있습니다 혼합 연장과 일관성 응집 결과를 왜곡 할 수 흔들어 동안 힘을 적용 명심.
  2. 옵션 둘 이상의 응집제의 동시 적용을 위해 상술 된 절차를 수정한다.
    1. 옵션 1 : 두 개 이상의 응집제 여기 PEI와 키토산의 혼합물을 추가하는 대신에 단일 중합체. 에너지 부에 정의 된 응집제 조합을 사용합니다. 교육청 설정 (1.1) 동안 비와 개별 매개 변수로 고분자의 절대 농도를 통합.
    2. 옵션 2 : 추출물에 두 개 이상의 고분자를 순차적으로 추가합니다.
      1. 교육청 설치하는 동안 추가 요소로 개별 폴리머 농도, 자신의 유형 및 추출물에 각 추가 사이의 배양 시간을 사용합니다.
      2. 또한 단일 중합체의 반복 첨가 응집을 향상시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해이 방법을 사용합니다. 응집제 천천히 첨가 시뮬레이션 단계적 첨가를 사용하여, 예를 들어 네 개의 단계 : 20 ㎖의 부피 4 분에 걸쳐 각각 0.25 mL를 첨가 80g L -1 응집제 재고와 응집제의 첨가를 흉내0.25 mL의 분 -1의 유속.
      3. 모든 경우에, 여기에서 샘플 볼륨으로 여전히 22 ml의 모든 응집제의 최대 양을 추가하여 설치를위한 새로운 최대 최종 샘플 량을 확인하고, 필요한 경우 볼륨 조정 응집제 원액 및 버퍼의 필요한 부피를 계산.
  3. 플록 형성 할 수 있도록, 교육청에서 일반적으로 3-30 분 정의 된 시간에 대한 샘플을 품어. 다른 모든 배양 조건 확인, 예를 들어 온도는 미상에 따라 설정된다.
  4. 관찰 및 문서 플록 형성. 필요 플록 mm의 침전 고형물의 높이를 측정하여 분당 침전으로서 예로 플록 형성의 진행을 기록한다. 필요한 경우, 이러한 밤새 오랜 기간의 응집을 연장.
  5. 응집 된 추출물을 필터링합니다.
    1. 앞서 제조 된 필터 재료를 사용하여 (230) 해당 후에 응집 추출물 명확히필터 재료를 통해 깨끗한 용기 또는 반응 관에 응집 된 샘플을 경사 분리에 의해 배양 시간.
      1. 하지 마십시오 여과 전에 정착 플록을 다시 중단하고 20 ml의 샘플에 대해 3 ~ 4 초에 ~ 300의 속도와 ml의 분 -1 필터에 대응 추출물을 적용합니다.
      2. 상이한 재료 입자 보존의 관점에서 최종 공정에 비해 벤치 탑 실험에서 사용되는 경우 여과 공정의 성능을 확인, 두 종류의 시료 (11)의 입도 분포를 측정하여 예.
    2. 예 탁도계 탁도 및 / 또는 사용에 필요한 적절한 장치로 입자 크기 분포의 측면에서, 여액을 분석한다.
    3. 옵션 : 불안정한 플록의 형성 또는 개혁을 조사하기 위해, 예를 들어 12 ~ 24 시간, 연장 배양 시간 후 분석을 반복합니다.
  6. 잠 약관에 샘플을 분석전자 정의 응답 (1.1.3).
    1. 여과 액에서 샘플을 채취하고 다른 표적 단백질 또는 가치있는 제품의 농도 예를 들어, 추가 응답 매개 변수를 분석 할 수 있습니다.
    2. 옵션 : 프로세스의 질량 균형을 닫 같은 매개 변수에 대한 잔류 물 (주로 고체)을 분석합니다. 특히, 시료 처리되거나 응집제로 처리되지 않은 후 질량 남은 고형물을 비교하여 액체 회수에 응집제의 효과를 정량화.
  7. 데이터 품질을 확인하고 피해자의 소프트웨어로 결과를 전송합니다.
    1. 수집 된 응답 데이터 극단적 인 값, 예를 들어 예기치 않게 높은 값을 찾습니다.
    2. 모든 응답 데이터가 올바르게 해당 실험 조건과 정렬되어 있는지 확인합니다.
    3. 교육청 소프트웨어로 결과를 전송하고 표준 및 무작위 실행 주문이 혼합되지 않습니다 있는지 확인하십시오.

4. 평가에너지 부

  1. 이전 20 바와 같이 예측 모델을 개발하기 위해 회절 광학 소프트웨어에 내장 된 데이터를 분석 도구를 사용한다.
    1. 모델 구축을 촉진하기 위하여 필요한 경우 적절한 데이터 변환 모드를 선택, 여기에 10를 기록합니다. 큰 대 작은 응답 값에 대한 비율보다 큰 (10)는 데이터 변환이 요구 될 수 있음을 나타낸다. 박스 - 콕스 플롯 (35) 예를 들어, 적절한 통계 도구를 사용하여 가장 적합한 변환을 확인합니다.
    2. (i)가 선택된 미상 (1.2)에 들어가고 (II)의 예 변동 (ANOVA)의 분석에 기초하여 조사중인 시스템에 대한 이전의 지식 암컷 소프트웨어 툴하는 2 차 다항식에 동의 기본 모델을 선택 종종 일차 다항식보다 배양 시간의 관찰 된 효과에 잘 맞는다.
    3. 의를 취소하여 반복적으로 중요하지 않은 모델의 요소, 예를 들면 P> 0.05, 또는 요소의 상호 작용을 제거reby 모델의 복잡성을 감소시키고 그것의 예측 능력을 증가시킨다.
    4. R 2, 조정 R 2를 비교하여 모델의 품질을 확인하고 스튜던트 잔차의 정규 확률 플롯과 함께 R 2를 예측 잔차 - 대 - 실행, 예측 된 대 - 실제와 박스 - 콕스 (36)을 나타내는. 모든 R 2 값은 0.2 범위 내에 있어야한다.
    5. 최종 모델은 부정적인 농도가 예측되지 않습니다 예를 들어 물리학, 열역학의 기본 가정에 동의해야합니다.
  2. 여기에서 조사중인 시스템, 낮은 탁도에 가장 유리한 조건을 예측하는 모델을 사용합니다.
    1. 가장 중요한 반응과 선호 상태를 선택, 최소한의 탁도를 예. 내장 된 몇 가지 미상 소프트웨어 패키지 (36)의 기능 바람직 기능 또는 유사한 도구를 극대화하여 이러한 선택을 결합합니다.
    2. 의도 한 애플리케이션에 따라 오모델 f를 선택 확인은 조건이 가장 유리한 것으로 예측 후속 실험로를 선택 초기 미상의 일부가되지 않은 경우에는 최적의 조건 및 / 또는 예를 들어, 일반적으로 모델의 예측 능력을 확인하기 위해 실행됩니다.

5. 모델을 개선하고 예측 능력을 확인

  1. 가장 바람직한 운전 조건에 초기 설계 공간을 좁힐는 0-1,000 혼탁 탁도 단위 (NTU) 범위의 예를 들어 낮은 탁도는 모델 예측 (4.2)을 기반으로.
  2. 새로운 미상가 유의 적 또는 관련으로 확인 된 경우에만 그 요인을 포함하여,이 범위 내에서 설정 (4.1.2)).
    주 : 인자는 프로세스 모델 분석하지만 무관의 관점에서 중요 할 수 있고, 반응에 미치는 영향은 1 %가 다른 요소에 비해 <즉이다.
  3. 모델 예측의 품질이 requiremen 일치 할 때까지 반복 1-5.2 단계TS, 즉 소프트웨어에 의해 나타낸 바와 같이, 모델의 표준 편차는 의도 된 애플리케이션에 충분하다. 예를 들면 정제에 하나의 응집제를 사용하여 이러한 반복을 위해 필요한 경우 실험 전략을 수정합니다.
  4. 전송 및 파일럿 규모 또는 최종 생산 규모로 스케일 다운 모델의 결과를 확인합니다.

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결과

다른 중합체와 담배 추출액 응집

상기 방법은 성공적으로 모노클로 날 항체 (에이즈 중화 항체 2G12)와 형광 단백질 (을 DsRed) (도 1) (16)의 제조시 담배 추출물 응집하는 방법을 개발하는 데 사용하고, 이후 전사 된 렉틴, 말라리아 백신 후보와 융합 단백질 (게시되지 않은 데이터)를 포함하는 다른 단백질. 일반적으로, 응집제의 적용 ~ 6000 NTU (추출 후 10,000 NTU)에 ~ 1000 NTU에서 가방 필터링 식물 추출물의 탁도를 감소시켰다. 초기 선별 실험에서, 91-실행 IV-최적 설계 (이 요소는 응집 효율 13,27에 영향을주기 때문에) 세 가지 다른 농도의 18 가지 고분자를 테스트하는 데 사용하고, ~ 12 시간 배양 perio을 통해 응집을 관찰D

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토론

가장 중요한 점은 입자의 응집을 특징 암컷을 설정할 때 디자인은 원칙적으로 예를 들면 pH가, 폴리머 계 중합체의 농도 (16)의 영향을 예상하거나 가능한 효과 (36, 38)을 검출하고 설명 할 수 있어야한다는 것이다 고려한다. 따라서, 실제의 실험을 시작하기 전에 설계 공간 (FDS)의 비율을 평가하는 것이 중요하다. FDS는 예 250의 혼탁도의 차이를 검출하는 공지의 변동 시스템 주어진 두 실험 결과 사이에 미리 정의의 차이를 검출 할 수있는 내 (설계 인자, 예를 들면 pH를 적용) 다차원 실험 공간의 분율 NTU는 125 NTU의 다양성을 제공. FDS 추가 실행과 디자인을 보강함으로써 증가 될 수 있고, 공정 제어 (36)를 안내하기위한 설계를위한 ≥0.95해야합니다. 또한, 런의 수가 허가하지 않는 경우 t그 전체 실험은 하루에 수행되어야하는 블록을 고려하여 미상으로 미리 정의되어야한다 뱃치 및 일일 변동....

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공개 사항

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감사의 글

형질전환 담배 씨앗을 제공한 Thomas Rademacher 박사와 담배 식물을 재배한 Ibrahim Al Amedi에게 감사드립니다. 편집에 도움을 주신 Richard M Twyman 박사님과 유익한 토론을 해주신 Rainer Fischer 교수님께 감사드립니다. 이 연구는 유럽연구위원회(European Research Council)의 ''미래-제약회사(Future-Pharma)'', 제안서 번호 269110, 프라운호퍼 미래 재단(Fraunhofer-Zukunftsstiftung) 및 보조금 번호에 따른 프라운호퍼-게젤샤프트(Fraunhofer-Gesellschaft) 내부 프로그램의 일부 자금 지원을 받았습니다. 125-600164를 유치하십시오.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2100P 휴대용 탁도계Hach4650000탁도계
2G12 항체PolymunAB002참조 항체
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR 장치
BP-410Furh2632410001백 필터
Catiofast VSHBASF79002360응집제
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuge
Centrifuge tube 15 mlLabomedic2017106반응관
Centrifuge tube 50 ml self-standingLabomedic1110504Reaction tube
ChitosanCarl Roth GmbH5375.1응집제
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoE소프트웨어
Disodium phosphateCarl Roth GmbH  4984.3 미디어 구성 요소
Ferty 2 MegaKammlott5.220072비료
Forma -86C ULT 냉동고ThermoFisher88400냉동
고 온실n.a.n.a.식물 재배
용 Grodan Rockwool 큐브 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool 블록
HEPESCarl Roth GmbH9105.3미디어 구성 요소
K700P 60DPall5302305뎁스 필터 레이어
KS50P 60DPallB12486뎁스 필터 레이어
MiraclothLabomedic475855-1R필터 천
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH 측정기 / 전도도 측정기
Osram cool white 36 WOsram4930440광원
PhytotronIlka Zelln.a.식물 재배용
Polymin PBASF79002360응집제
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110맞춤형 블레이드 도구가 있는 균질화 장치
Protein ALife technologies10-1006항체 결합 단백질
염화나트륨Carl Roth GmbHP029.2미디어 구성 요소
시너지 효과 HTBioTekSIAFRT형광 플레이트 리더
TRISCarl Roth GmbH4855.3매체 구성 요소
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3매체 구성 요소
VelaPad 60PallVP60G03KNH4필터 하우징
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS 입자 크기 분포 측정

참고문헌

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