공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

요약

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

초록

우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합​​ 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.

서론

^{3 -} 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 ^하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. ^{7 -} 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 ^(4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 ^5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. ^{13 -} 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 ^(10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 ^(14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요....

프로토콜

1. 전체 세포 생체 촉매의 제조

참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox ³¹ pET28a- HjLAD ²⁸ 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 _SpNox 및 E. 대장균 _HjLAD, 각각.

1. E.의 단일 식민지의 예방 37 ^O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 _HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N.
2. 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 ^O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 ₆₀₀ ~ 0.6에 도달한다.
3. 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 ^O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다.
   1. 또한, 25 ^O....

결과

보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 _HjLAD 및 E. 대장균 _{SpNox 세포.} 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다.

커플 링 E.에 의해 공동 인자 재생에 L 크실 로스 생산 대장균 _HjLAD 및 E. 대장균

토론

최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 ^(38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 ^(39)의 제조 수율에 크게 의존한다. 이것은 생 촉매 효소 지향 진화 생 촉매 활성 ^셋을 향상시키기 위해 구현 된 "무차별"유전 ^(39)의 신속한 개발을 주도하고있다. 그러나, 레 독스 경로 특정 대사 경로에 대한 단순한 생체 촉매 개선 OTH의 큰 영향으로 인해 생산의 경제 화에 영향을 충분하지이러한 고가의 보조 인자로서 어 필수 반응 요구. 스케일 업에도 향상된 생 촉매와 같은 시스템, 단지 생산 비용을 증가시키는 역할을한다. 따라서, 추가적인 전략.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB 육수	시그마 알드리치	L3022-6X1KG
카나마이신	피셔	BP906-5
이소프로필 &베타;-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)	시그마 알드리치	I6758-10G
트리스 베이스	피셔	BP1521
B-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 수화물	시그마 알드리치	N7004-1G
L-아라비니톨	시그마 알드리치	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
황산	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
에탄올	Fisher	BP2818-4
알긴산 나트륨	시그마 Aldrich	W201502
염화칼슘 이수화물	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 셰이커 인큐베이터	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis 분광 광도계	Agilent Technologies
원심분리기 5810R	Eppendrof
비커,	Fisher
주사기	, Fisher
Needle	Fisher
Pioneer, 분석 및 정밀 계량 저울,	오하우스

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