의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

요약

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

초록

여기, 우리는 효율적으로 자세한 절차를 설명하고 직접 헤모필루스 인플루엔자를 제공 마우스의 하부 호흡기로. 우리는 H. 제조 과정을 보여 인플루엔자 접종, H.의 내부 기관 점안 폐에 인플루엔자, 차동 유전자 발현 분석을위한 기관지 폐포 세척액 (BALF), 폐포 세척액에서 면역 세포의 분석 및 RNA 분리의 컬렉션입니다. 이 절차는 임의의 박테리아, 바이러스 또는 진균에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 적은 모호성으로보다 효율적으로 하부 호흡기로 세균 접종을 제공하기 때문에 직접 기관 점안은 주로 비강 내 또는 에어로졸 흡입 절차를 통해 바람직하다.

서론

염증은 감염 인자에 대한 방어의 기본 면역 메커니즘입니다. 그것은 병원균 퇴치 및 손상된 조직의 복구를 촉진한다. 또한, 일반 건강 상태 ^1로 회복을 용이하게한다. 그러나, 조절 이상 염증은 종종 만성 염증성 ^질환이 리드. 기도 염증은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 및 폐 섬유증과 같은 ³ 가지 폐 질환의 초기 트리거이다.

비 typeable (봉입) 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)의 상부 및 하부 만성 폐 염증성 질환 ^4,5-와 연관된다. 그것은 만성 폐쇄성 폐 질환 ^4,6,7 어린이와 성인의 하부기도에서 분리 지배적 인 종이다. NTHi 감염 후 염증 반응은 (예컨대 TNF 및 IL-1β와 같은) 염증성 사이토킨의 상향 조절이 특징이며, B를 매개y를 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 수신자와 같은 수용체를 통해 핵 인자 κB (NF-κB) (TLR에) ^8.

마우스 모델 때문에 서로 다른 유전자가 결핍 된 라인의 가용성의 폐 염증성 질환의 기본 병리학을 분석하는 매우 유용한 도구입니다. 여러 방법은 비내 점적 및 에어로졸 흡입....

프로토콜

모든 실험은 베일러 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다.

1. 배양 비 typeable 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)과 접종 준비

1. 초콜릿 한천 플레이트 접시 NTHi를 37 ° C, 5 % CO _2에서 하룻밤 가습 CO ₂ 배양기에서 거꾸로 판을 유지한다. 다음 날, 문화 뇌 심장 주입 국물에 박테리아. 그런 다음, 멸균 1.5 ML 튜브로 국물 1 ㎖를 추가합니다.
2. 실온에서 5 분 동안 4000 × g으로 원심 분리기. 그 다음, 상층 액을 제거하고 멸균 1X PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 일단이 단계를 반복합니다.
3. 분광 광도계로 파장 600nm에서의 희석 배양 흡광도 1X PBS 900 μL에 재현 탁 용액 100 μl를 전송하고 측정한다.
4. 생존 및 집락 형성 단위를 결정초콜렛 아가 플레이트에 1시 10분 연속 희석을 배양 CO _2, 37 ℃에서 밤새 배양하고 5 % 접종 S (CFUs).
5. 이전 단계에서 결정된 가능성에 기초하고 CFUs, 20 × ¹⁰⁶ CFU / ml의 최종 농도로 접종을 조정한다.....

결과

내 기관 점안은 식염수 설치보다 폐포 세척액 (그림 1A, 왼쪽 패널)에서 백혈구의 현저하게 증가 된 수의 결과. 백혈구의 미분 계수 분석 분명히 증가 호중구 침윤 (도 1, 오른쪽 패널)을 보였다. BALF에서 세포의 FACS 분석은 상기 호중구 수의 증가 (도 1b)를 확인했다. 폐 조직을 H & E 염색 섹션의 조직 학적 분석은기도 염증 (도 1C)을 증가 하였다. 이러한 데이터 집합 내 기관 점안은 생쥐의기도 염증을 유도하는 것이 좋습니다. 기도 기전을 조절하는 신호 전달 경로를 연구를 위해이 방법의 사용을 지원하기 위해, 우리는 E3 유비퀴틴 리가 가려움에 대한 결핍 마우스를 사용 하였다. 가려움은 ¹⁵ 염증성 신호 전달 경로를 조절에 관여하는 것으로 알려져있다. 우리는 접종나이와 성별을 일치 야생형 C57BL /.......

토론

여기서, 우리는 박테리아 폐 병원체와 마우스의 폐를 접종 독특하고 최소 침습 절차를 설명합니다. 우리는이 절차 염증성 신호 전달 경로의 유전자 결핍 마우스를 이용하여 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 바이러스 및 진균 감염에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 이러한 비내 에어로졸 또는 흡입 같은 다른 방법을 통해이 절차의 이점 (1)이 절차에서 병원성 접종 직접 하부 호흡기 점적되며 (2) 균액의 크기를 제어 할 수있는 기능; (3) 박테리아 핸들러 노출 위험을 감소시켰다.

수술 박테리아 주입 용 기관의 노출 치료가 주위 조직, 특히 혈관 손상을주지 않도록주의해야 중요한 단계이다.

기관 쉬에 박테리아의 점안에 의한 질식으로 마우스의 사망 가능성을 방지하기 위해주의 깊게 수행 할 수 울드. 접종 (50 μL)을 천천히 출시 및 공기 전과 접종 후 주입하는 것이 좋습니다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
초콜릿 아가 플레이트	Fisher Scientific	CAS50-99-7
덱스트로스 무수	Themo Scientific	R01300
Heparin	Hospira,Inc	RL-3010
Deft 빠른 솔루션	Sigma	GS500-500ML
주사기 바늘 20/26G	BD(	REF305115/175)
Iml 주사기	BD	REF 309602
카테터 20GA	BD	REF
해부 가위, 스트레이트, 10cm 길이의	kentscientific	INS600393
홍채 집게, 톱니형, 10cm 길이의	kentscientific	INS650915
핀셋 #5 스테인리스 스틸, 11cm 길이	kentscientific
10% 포르말린	피셔 사이언티픽	CAS 67-56-1
아가로스	peqlab	35-1020
5ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브	BD	REF 352058
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브	Light Labs	A-7001-R
Reasy Mini  키트	Qiagen	74104
펠렛 페스티유 모터(조직 균질화기)	Sigma	Z359971-1EA
96웰 마이크로타이터 플레이트 V 하단	Thermo	2605
1X PBS	Gibco	10010-023
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
CD45.2-APC	eBioscience	17-0454-81	작업 희석 1:100
Ly-6G-eFlor 450	eBioscience	48-5931-82	작동 희석 1:100
BSA	HyClone	SH30574.03
RBC 용해 완충액 (10X)	Biolegend	420301
Live/Dead 고정성 아쿠아 데드 셀 염색 키트	Invitrogen	L-34957
EDTA (0.5M)	lifetechnologies	15575-020
CD16/ CD32 FcBlock	BD	553142
Facs 튜브 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브	BD	352052
포름 알데히드	Polyscience	4018

381433 INS600095