방법 논문

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

DOI:

10.3791/53982

⸱

2016년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine, 6Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

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이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.

초록

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장골내동맥(IIA) 주사는 동물에서 다양한 암세포의 전이성 병변을 도입하는 효율적인 방법입니다. 널리 사용되는 심장 내 및 경골 내 주사와 비교하여 IIA 주사는 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 많은 양의 암세포를 특이적으로 뒷다리 뼈에 전달할 수 있으므로 시공간적으로 동기화된 초기 단계 집락화 이벤트를 제공하고 파종된 종양 세포의 강력한 정량화와 신속한 검출을 가능하게 합니다. 둘째, 국소 조직을 손상시키지 않고 암세포를 순환계에 주입하여 뼈 집락 형성 과정을 혼란스럽게 하는 염증 및 상처 치유 과정을 방지합니다. 셋째, IIA 주사는 비뼈 기관에서 전이성 성장을 거의 일으키지 않기 때문에 동물이 다른 중요한 전이에 굴복하는 것을 방지하고 나태한 뼈 병변을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 장점은 과거에는 대체로 파악하기 어려웠던 단일 암세포에서 다세포 미세전이로의 진행을 검사하는 데 특히 유용합니다. 생물학적 이미징 및 뼈 조직학의 최첨단 접근 방식과 결합하면 IIA 주입은 뼈 전이와 관련된 다양한 연구 목적에 적용될 수 있습니다.

서론

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전이는 고형 종양에 의한 사망의 90 %를 차지한다. 뼈는 다양한 종류의 암, 특히 유방암과 전립선 암의 전이에 의해 영향을 가장 많이 기관이다. 병원에서 진단하면, 뼈 전이는 일반적으로 이미 자주 신경 학적 증상을 동반 뼈에 골 용해성 또는 골아 중 하나를 변경, 첨단 단계를 입력했습니다.

이전의 연구는 주로 그러나 우리는 현재 골 용해성 프로세스의 개시 전에 뼈의 미세 전이의 이해를 제한, 명백한 골 용해성 골 전이 1-3에 집중했다. 이는 적절한 실험 모델 및 방법 부족 적어도 부분적이다. 유방암 유전자 변형 마우스 모델들은 폐 전이 있지만, 훨씬 덜 효율적 뼈 4. 마찬가지로, 동소 이식 된 종양은 거의 어떤 뼈 열대 4T1 유방 carcinom으로, 자발적인 뼈 전이를 개발하지서브 클론 및 MSP는 예외 5-7로 PyMT 형질 전환 마우스 모델을 과발현. 인트라 경골 뼈 드릴 8-10에 암세포를 제공 할뿐만 아니라 지방 조직의 손상과 염증을 초래한다. 현재 유방암 세포주 내 심장 주입 뼈 정착 11-13 조사 주요 접근하고있다. 암세포 좌심실에 도입 된 후에 그러나 제한된 비율은 최종적 어려운 정량 방식으로 미세 전이를 추적 할 수있게 뼈 골수에 도달한다.

본 연구에서 우리는 선택적하여 지방 조직에 손상을주지 않고 뼈 골수 암 세포 농축, 뒷다리 조직에 암세포를 제공하도록하는 기술, 즉, 인트라 - 장골 동맥 (IIA) 주입 (14)을 설치한다. 때문에 뼈 특이성이 방법은 결국은 An 정착하기 전에 무통 암세포에 충분한 시간을 허용imals 다른 중요한 장기에 차 종양이나 전이에 굴복. 이러한 생물 발광 이미징, 면역 형광 염색 및 골 조직 형태와 같은 다른 기술의 다양한 결합하면 IIA 주입 특히 다중 셀에 하나의 암 세포의 진행을 추적하기 위해, 뼈 전이에 관한 연구 목적의 넓은 범위에 대한 잠재적으로 유용한 미세 전이. 특히, IIA 분사 암 세포 및 골 미세 셀 주변의 여러 유형의 상호 작용을 시각적으로 우리 수 있는지 보여 주었다.

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프로토콜

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모든 동물의 작업은 의학의 베일러 대학의 동물 관리 지침에 따라 이루어졌다.

1. 셀 준비

주의 : 다른 암 세포주는 IIA 주입은 연구 목적에 따라 사용할 수있다. 우리는 유방암 세포주를 사용한 MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 및 연구에서 전립선 암 세포주 C4-2. 우리는 일반적으로 우리의 연구를 위해 GFP- 및 반딧불이 루시퍼 라제 표지 암 세포를 모두 사용하여 GFP - 루시 페라 표지 MCF7 세포 라인에서 여기에 몇 가지 데이터가 표시됩니다.

  1. 5 % CO 2에서 37 ℃에서 10 % FBS 및 0.1 ㎎ / ㎖의 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM에서 세포를 유지한다.
  2. 0.25 % 트립신 / EDTA 용액으로 90 % 합류 - IIA 주입하기 전에 80에서 세포를 Trypsinize. 셀 카운팅 10 ml의 PBS에서 셀을 두 번 세포를 씻어 다시 중단 차가운 PBS를 사용합니다. 5 분 동안 800 XG에서 PBS, 원심 분리기 세포를 제거합니다.
  3. 세포를 다시 일시 중지빙냉 PBS에서 5 × 106 세포 / ml의 농도.
  4. 100 μL의 GFP- 한 마우스의 IIA 주입을위한 반딧불이 루시퍼 라제 표지 암 세포를 사용합니다.
    주 :. 따라서, 각각의 동물에 의해 수신 된 셀의 수는 5 × 5이 숫자는 세포주의 공격성에 기초하여 변경 될 필요가있다.
  5. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
    주 : 진동은 사출 할 준비가 될 때까지 몇 분마다 세포 응집을 방지하기 위해 필요할 수있다. (예 : MDA-MB-231와 같은) 일부 세포주 (예를 들어, 45 μm의 세포 여과기를 통과하는) 더 엄격한 절차는 응집을 방지하기 위해 필요할 수있다. 혈관의 막힘은 조직 괴사가 발생할 수 있습니다, 따라서 실험을 교란하시기 바랍니다.

2. 동물 준비

  1. 동물의 통증 관리를 위해, 아니 이하 24 이상의 시간 수술 전에 쥐에 건강 보조 식품 5 ㎎ / ㎏ / 일 카프로 펜 (또는 다른 진통제)을 얻었다. 관리수술 전에 0.1 ㎎ / ㎖ 프레 놀핀 피하에 60 분의 용량. 참고 : 옵션 절차는 별도의 에스트라 디올을 제공하기 위해 동물의 뒷면에 에스트라 디올 팔레트를 이식하는 것입니다. 이는 ER + 암 세포 성장 촉진 (예 : MCF-7 세포) (9)을 가속한다.
  2. 복강 내 주사하여 - (100 ㎎ / ㎏ 80)과 자일 라진 (10 -12.5 ㎎ / ㎖) 케타민 6 주 이전 마우스 (약 20g) - 4를 마취.
  3. 발가락 핀치에 의해 20g 마우스와 호흡 속도 50 % 감소의 관찰의 진정 작용의 적절한 수준을 확인하고 점막 핑크 (예를 들어, 마우스 귀 피부 및 발 피부). 수술 중에 이러한 생체 신호 매 15 분 모니터링 유지합니다. 참고 : 동물의 어떤 움직임은 동물이 수술 충분히 마취와 준비가되어 있음을 나타냅니다.
  4. 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  5. , 하복부에 특히 오른쪽 사타구니 영역을 마우스를 면도 곳 수술과 주사는 것발생한다.
    참고 : 무 흉선 누드 마우스를 사용하는 경우이 필요하지 않습니다.
  6. 그 뒷면에 마우스를 올려 그들의 자연적인 위치에 다리를 확산하고 테이프로 이동 해부 판지에 발가락 스틱.
  7. 70 % 이소 프로필 에탄올을 적신 멸균 면봉와 오른쪽 사타구니 부위를 닦아, betadine 수술 스크럽 여러 번 하였다.

3. 일반 장골 정맥과 동맥의 위치 및 분리

  1. 긴 4 번째와 3 번 핸들에서 개최 살균, # 10 탄소 강철 메스 블레이드를 사용하여 오른쪽 아래 복부에 5 일 젖꼭지 사이에 1.2 cm - 1.0의 피부 절개를합니다. 그 후 절개 부위를 제외하고는 동물의 시체를 충당하기 위해 무균 수술 드레이프를 사용합니다.
  2. 표준 벤치 탑 해부 현미경으로 동물을 이동합니다. 주입을위한 4 배의 배율을 사용합니다.
  3. 해부 현미경의 4 배 배율에서 지방 조직과 peritoneu 사이에 무딘 분리 집게를 삽입m, 그리고 장골 혈관과 신경 (그림 1 참조) 노출 양쪽에서 바깥쪽으로 조직을 밀어 넣습니다.
    참고 : 중간 선에서 대동맥 및 동맥 가지의 아래 부분 사이의 동맥이 총장 골 동맥이라고합니다. 주입이 일어나는 곳이다.
  4. 가까운 선박, 선박과 신경 사이 (막 등) 결합 조직을 돌파 똑바로 잘 포셉 한 쌍을 사용합니다.
  5. 왼쪽에 직선 미세 집게를 전환합니다. 오른손을 사용하여 각도 미세 집게 한 쌍을 잡아. 결합 조직이 파괴되어 동일한 위치로 오른쪽 집게를 삽입합니다. 그리고 용기 아래 통해 오른손 집게 스틱.
  6. 동시에 통과하는 오른손 집게를 안내하기 위해 용기의 왼쪽에있는 결합 조직에 왼손 집게를 삽입한다.
  7. 오른손 집게 용기 아래 얻으면, 주변 TI로부터 용기를 분리하려고조금 더 ssue 한 다음 오른쪽 집게의 상단에 보관하십시오.
  8. 오른쪽 집게에 4-0 실크 봉합사의 끝을 제공하기 위해 왼쪽 집게를 사용하고 용기 아래를 부드럽게 천천히 봉합사를 잡아 당깁니다. 참고 : 이제 모두 일반적인 정맥 및 동맥 혈관을 봉합에 의해 해제된다 (그림 2 참조).

4. 사출 및 후 분사 케어

  1. 31 G 인슐린 주사기에 주입을위한 세포를 준비합니다. 주입 당 PBS에 세포 현탁액 100 ㎕를 사용합니다. 아래로 주입 된 세포를 막고 혈액 흐름을 차단하지 않도록 세포를 분리하고 응집을 방지하기 수회 피펫하고 확인.
  2. 왼쪽 손에 각진 집게로, 집게에 부드럽게 개최 혈관을 갖는 봉합사의 안내에 따라 선박 아래에있는 집게를 넣어, 다음 집게의 두 팔을 엽니 다.
    참고 : 집게의 두 팔 사이의 간격이 난 것입니다njection 사이트입니다.
  3. 주입을위한 준비, 위쪽으로 바늘의 경사와 함께 오른쪽에 100 ㎕의 세포 현탁액로 31 G 바늘을 잡으십시오.
  4. 동맥 루멘에 바늘을 삽입 (피가 바늘 끝을 입력합니다). 그런 다음 세포를 주입하는 천천히 세포 현탁액을 누릅니다. 세포 현탁액을 용기 내의 적혈구를 밀어 것이다. 혈관을 파괴하거나 세포 현탁액을 누설하지 않도록하십시오.
  5. 주입이 완료되면, 조심스럽게 바늘을 철수하고 출혈을 멈추게하기 위해 왼쪽 집게에 선박을 들고 유지. 그런 다음 봉합을 당깁니다.
  6. 왼쪽 집게을 당깁니다, 신속하게 출혈을 멈추게하기 위해 동맥 절개 영역을 누릅니다 면봉을 사용합니다.
    참고 : 일반적으로 5-10 분 연속 압력이 출혈을 멈추게하기에 충분하다.
  7. 중지 출혈하면 수술 영역의 피부 가장자리를 폐쇄 피부 접착제를 사용한다. 귀 태그를 확인하고 주입 된 세포의 분포를 조사하는 신호 생물 발광을 확인합니다.
    참고 : 성공적인 주입은 3 그림과 유사한 이미지가 발생합니다.
    1. 75 밀리그램 / 인트라 궤도 동을 통해 kg 마우스 농도로 PBS에서 / ㎖ 루시페린 100 ㎕를 15 mg을 주입하여 생물 발광 신호를 확인합니다.
      1. 내부 안와 주입 들어, 마우스 눈의 양쪽에 손가락을 넣어 안구 약간 눈 프레임으로부터 튀어 안구 코 사이 28 G 인슐린 주사기 바늘을 넣고 천천히 루시페린를 주입 주사기를 추진하기 위해 압력을 .
        참고 : 올바른 위치에서, 바늘 (2)의 깊이에 도달 할 수 있어야합니다 - 경조직 (뼈)을 치기 전에 3mm를.
      2. 10 생체 내 동물 전체 이미징 이미징 시스템에 마우스 플레이스 - 5 분 내에 60 초 (도 3 참조).
        주 : 선택 사양 인 절차를 추가 에스트라 디올을 제공하기 위해 동물의 뒷면에 에스트라 디올 펠릿을 이식하는 것입니다. 이는 ER + 암 세포의 성장 (예를 들어, MCF-7 가속화셀) 15.
  8. 이 깨어 때까지 따뜻한 가열 패드에 마우스를 둡니다. 포스트 수술 기간 동안 열개과 고통의 흔적을, 출혈을 모니터링 붓기. 고통의 흔적까지 통증 관리를 위해 주어진 진통 범위 (carprofin 건강 보조 식품 제안)와 케이지에 다시 마우스를 넣습니다. 수술 후 칠일 동안 동물에 세심한 관심과주의를 기울이십시오.

5. 모니터링 전이성 성장

  1. 조직 형태 측정 :
    1. 뼈 조직을 베어링 수확 종양 후, 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 뼈를 고정 pH를 3 7.0 14 % EDTA 용액을 석회 - 오일을, 그리고 이전에 포함 (14)을 설명 파라핀 그들을 대상으로 할 수 없다.
    2. 제 파라핀 포함 골이 3 μm의 두께 조직 및 이전 (14) 설명에 따라 헤 마톡 실린 / 에오신 염색의 표준 조직 학적 방법을 수행합니다.
  2. Immunohistochemis시험:
    1. 주제 파라핀 포함 된 종양 베어링 뼈 이전 14 설명 된 바와 같이 다양한 용도로 염색 면역 조직 화학 염색하는 슬라이드. 요약하면, 각각 항 Osterix 항체 및 항 알칼리 포스 파타 아제 (ALP) 항체에 의해 방지 GFP 항체, 및 발현 사이 골 형성 세포 (사전 조골 세포와 조골 세포)에 의해 MCF7 암 세포 발현 사이.

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결과

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그림 1은 해부학 적 위치와 총장 골 동맥 (적색)과 정맥 (파란색)의 관계를 보여줍니다.

그림 2는 해부 현미경 아래 장골 혈관과 신경의 상대적 위치를 보여줍니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 혈관 신경 복막 벽 아래 오른쪽이고 피부 절개가 이루어지고, 복막 멀리 밀려 후에 밝혀 질 수있다. 일반 장골 정맥은 왼쪽에, 그리고 동맥에 비해 더 크고 더 어둡다. 동맥은 중간에, 핑크 보인다. 그것은 정맥보다 얇은하지만 두꺼운 근육 벽이있다. 정맥 및 동맥에 평행하고 서로 밀접하게 연결된다. 멀리 오른쪽에 흰색 천추 신경이다.도 2b는 3-에 의해 주위의 결합 조직, 근육과 신경 분리하고 들어 올려 엉덩 혈관을 보여줍니다0 실크 봉합사. 일...

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토론

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만 장골 동맥 암세포 주입 대상이지만, 우리는 주변 조직 모두에서 장골 동맥과 정맥을 분리하는 것을 권장하고 번들로 이들을 함께 리프트. 정맥 및 동맥 광범위하게 서로 접촉하기 때문이고, 정맥 혈관 벽이 얇고 파괴하기 쉽다. 암 세포에서만 동맥에 주입되지만 따라서 성공적인 주사의 경우, 시간과 함께 두 개의 용기를 유지하는 노력을 절약. 도 2에 도시 된 바와 같이 4-0 실크 봉합사는이 과정을 돕기 위해 사용된다. 봉합사는 중지 출혈이 발생해야 도움이 될 수있다.

IIA 주입 대부분 단계 해부 현미경 하에서 수행 될 필요가있다. 마우스 선박의 절차 도전 만드는 부드럽고 작은 수 있습니다. 경험 100 % - 그러나, 충분한 연습 후 성공률 90에 도달 할 수있다.

이 기술로, 연구자가 될 수있는전통적으로 "비 전이성"생각을 포함하여 자신이 좋아하는 암 세포 모델의 뼈 식민지 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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장 연구실의 연구는 X. H.-F.의 지원을 받았습니다. Z.의 NCI CA151293, CA183878, 유방암 연구 재단, 미국 국방부 DAMD W81XWH-13-1-0195, CA149196-04, McNair Medical Institute 및 H.W.의 미국 국방부 DAMD W81XWH-13-1-0296.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Materials
DMEMHyCloneSH30022.01
FBSGibco16000
Pen/Strep Amphatericin BLonza Biowhittaker17-745E
PBSLonza Biowhittaker17-516F
Trypsin/EDTA 솔루션HyCloneSH30042.01
45 &뮤; M 세포 여과기VWR 국제 연구소195-2545
MediGel CPF with carprofen 의 수의학 치료에서 통제된 품목통증 관리를 위한
부프레노르핀 통증 관리를 위해의 수의학 치료에서 통제 항목
Estradiol 펠릿미국SE-121
케타민 및 자일라진BCM
수의사 연고BCM에서 수의학 관리에서 통제 항목 눈건조를 피하십시오
털이 많은 생쥐
이소 프로필 에탄올ACROS67-63-0
베타 딘 외과 수술 스크럽의 수의학 치료에서 통제 항목
Ted Pella, Inc549-3CS-10다중
번호 3 핸들Ted Pella, Inc541-31오토 클레이브 필요
멸균 수술 드레이프Sai 주입 기술PSS-SD1
스트레이트 펜치 Roboz 수술 기구RS-5132오토클레이브 필요
스트레이트 파인파인 파이치 파인 사이언스 도구11253-20오토클레이브 필요
모서리 파인 펜치파인 사이언스 도구11253-25오토클레이브 필요
4-0 Vicryl 실크 봉합Johnson & Johnson Health CareJ214H
31 G 인슐린 주사기BD328418다중
Q-팁 면봉(멸균)VWR International Laboratory89031-272
피부 접착제Henry Schein Animal Health31477수술 부위 피부 폐쇄
귀 태그 어플리케이터Fine Science Tools24220-00
귀 태그Fine Science Tools24220-50
D-luciferinGold BiotechnologyLUCK빛을 피하고 얼음에 올려 놓으십시오
28 G 인슐린 주사기BD329410안와 내 주입용
ParaformadehydeAlfa Aesar30525-89-4조직 고정용
EDTAOmniPur4050뼈 조직 석회화
용< strong>NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Dissection microscopeLeicaLeica S6E stereo
IVIS Lumina II 이미징 시스템Advanced Molecular Vision
NameCompany카탈로그 번호Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)Clontech632381
Anti-ALP 항체Abcamab108337
Anti-Osterix 항체Abcamab22552
BCMBCM의 혁신적인 연구 에서 통제 항목 면도기 Oster 78005-050 용 BCM # 10 메스 블레이드사

참고문헌

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