이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
내피 세포는 혈관의 내벽 라인 혈관 톤, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성의 조절에 중요한 역할을한다. 내피 세포 기능 장애, 허혈성 심장 질환을 포함한 다양한 심혈 관계 질환의 발생 및 진행에 관여한다. 함수 관상 내피 세포의 특성을 조사하기 위해, 세포 격리 첫 단계이며 이후의 실험을 높은 순도 및 품질을 필요로한다. 이 프로토콜은 성인 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 마우스 심장 해부 및 작은 조각으로 다진된다. 디스 파제 II와 콜라게나 제를 사용하여 심장의 소화 후, 세포를 세척하고, 항 CD31 항체가 결합되는 자성 비드와 인큐베이션. 내피 세포와 구슬은 세척 몇 번이고 이미징 및 분자 생물학적 experime 등 다양한 애플리케이션에서 사용할 준비가국세청. 효율적인 분리는 90 % 이상의 순도 하나의 심장 당 약 104 세포를 얻을 수 있습니다.
서론
다양한 심장 혈관 질병 및 대사성 질환의 마우스 모델은 환자에서 발견되는 것과 유사한 생체 분자 변화를 견딜. 또한, 마우스의 유전 적 변화는 우리 질환의 발생 및 진행에 특정 유전자의 병원성 역할을 조사 할 수있는 강력한 도구이다. 현재, 세포 유형 특이 적 유전자의 노크 또는 -out 생쥐 쉽게 마우스 진정 유전자 변형되었는지 여부를 결정하는 첫 번째 단계는 특정 유형의 세포에서 많은 실험실 mRNA를 측정 및 단백질 수준에서 발생한다.
내피 세포는 혈관 내피 세포되는 EC () 라인 안쪽 혈관 벽의 얇은 단일 층이다. 내피 세포는 혈관 장력, 혈관 투과성, 새로운 혈관 형성 1,2- 조절에 중요한 역할을한다. 내피 기능 장애는 많은 병리학 적 조건과 내피 세포 기능의 변화의 특징은 다양한 자동차로 이어질 수있다diovascular 질병 3,4. 이 병태 생리 학적 조건하에 내피 세포의 기능을 연구하는 것이 중요하다.
가 EC에 5-8을 분리하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 상기 분리 방법은 조직과 종 사용될에 따라 최적화되어야한다. 다양한 조직으로부터의 EC가 표면 마커에 대한 단백질 발현 9 이질성의 ....
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프로토콜
쥐에 대한 연구는 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을하고, 국립 보건 연구소 (NIH) 지침에 따라 수행 하였다.
주 : 섹션 1, 2, 3은 설치와 실험 하루 전에 수행되어야한다.
1. 준비 솔루션
- CD31 완충액 (50 mL) 중
- 50 ML 튜브에 50 ㎖ × 1 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 추가합니다. 0.05 g 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.037 g 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 달아 50 ML 튜브에 추가 분말 용해 될 때까지 약 1 시간 동안 회전 튜브를 넣어. 7.4으로 산도를 조정 새로운 50 ML 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 필터링하고, 사용할 때까지 4 ℃에서 저장한다.
- HEPES와 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (500 mL) 중
- HBSS 용액에 10 mM의 HEPES을 잘 혼합 HEPES의 1.1915 g을 추가합니다. pH를 측정하고 7.4로 조정한다. 4에서 필터 및 저장기음.
- 1 배 Kreb의 솔루션 (1 L)
- 1 L 플라스크에 증류수를 두 배로 10 × Kreb의 솔루션 [표 1] 100 ㎖를 추....
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결과
마우스 마음에서 관상 동맥 내피 세포의 성공적인 분리는 일반적으로 조약돌 모양으로 90 % 이상의 순도 약 10 4 세포를 얻을 수 있습니다. 내피 세포의 순수한 인구를 들어,주의는 오염이없는 무균 환경을 보장하기 위해 프로토콜을 통해주의해야한다. 신장 세포 집단 내 세포의 확대 외관은 다른 유형의 세포, 평활근 세포 및 섬유 아세포 오염을 나타낸다. 내피 세포의 순도 시험 내피 세포 표면 마커, BS-렉틴 acLDL (도 1)으로 세포를 염색하여 수행된다. 두 색을 나타내는 양성 세포의 비율은 MCEC에서 90 % 이상이었다. 이러한 결과는 기술이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다.
| PBS (10 배) ....... |
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토론
연구에서 가장 널리 사용되는 혈관 내피 세포 때문에 편리 성과 용이성 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC에)에있다. 그러나, 많은 연구가 다른 특정 기관 (10)으로부터 내피 세포의 분리에 의해 달성 생리 모델의 이용을 필요로한다. 내피 세포는 심장 조직에서 세포의 매우 작은 인구를 구성; 자신의 분리 및 배양이 매우 어려운 것으로 증명할 수 있습니다.
이 프로토콜 내에서 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 혈액을 잘 세척하는 것입니다. 혈액 내의 백혈구는 세포 표면 마커로서 CD31을 발현하고, 상기 CD31 항체의 결합에 대해 경쟁되는 EC 바와 같이이 필요하다. 다른 내피 세포는 또한 세척, 혈액에 존재할 수있는 바와 같은 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 필수적이다. 두번째 중요한 단계는 분리 과정 전반에 걸쳐 무균 환경을 유지하는 것이다. 모든 오염 resu얻어 세포의 수를 극적으로 감소 LTS. 마지막으로 세 번째 중요한 단계 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 (A. 마키노에 HL115578)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| 소듐 바이카보네이트 | 시그마 | S5761 | |
| D-(+)-글루코스 | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads 팬 마우스 IgG 비즈 | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| 쥐 안티-마우스 CD31 항체 | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (중성 프로테아제) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| 콜라겐분해효소 II.형 | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| 글리세롤 | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| 포스파타제 억제제 칵테일 | Sigma | P0044-1ml | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | 시그마 | H3149-100KU | |
| FBS | 피셔/미디어텍 | MT35010CV | |
| D-발린 | 시그마 | V1255-5G | |
| EGS | 코닝 | 356006 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 피셔/미디어텍 | MT-30-002-CI |
참고문헌
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
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재인쇄 및 허가
