모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

요약

시아노박테리아에 여러 게놈 변형을 도입하는 것은 산업 및 기초 연구 목적을 위한 균주 개발에 필수적인 도구입니다. 우리는 모델 시아노박테리아 종 Synechocystis sp. PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 설명합니다.

초록

시아노박테리아는 생태학적으로 중요한 유기체이며 바이오 연료 및 유용한 산업 제품 생산을 위한 잠재적인 플랫폼입니다. 시아노박테리아, 특히 Synechocystis sp. PCC6803 및 Synechococcus sp. PCC7002와 같은 모델 유기체의 유전자 조작은 기초 및 응용 연구 모두를 위한 핵심 도구입니다. 항생제 내성 카세트(하나 이상의 유전자를 포함하는 조작 가능한 DNA 단편)를 삽입하여 염색체 변형을 균주에 도입한 다음 음성 선택 가능한 마커를 사용하여 이 카세트를 제거하는 것은 특히 강력한 기술입니다. 표시되지 않은 돌연변이는 반복적으로 유전적으로 조작될 수 있으며, 원하는 만큼 균주에 많은 변형이 도입될 수 있습니다. 또한, 돌연변이된 균주에서 항생제 내성 단백질을 암호화하는 유전자가 없다는 것은 항생제 내성 유기체가 환경으로 '탈출'할 가능성을 피하기 때문에 바람직합니다. 그러나 시아노박테리아의 반복적인 유전자 조작에 대한 자세한 방법은 과학 문헌에 잘 설명되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하며, 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하여 다중 결실, 관심 유전자 내 단일 지점 돌연변이 및 새로운 유전자 카세트를 삽입하는 돌연변이를 생성하는 데 성공적으로 사용했습니다.

서론

시아 노 박테리아는 지구상의 거의 모든 자연 환경에서 발견되는 박테리아의 진화 고대하고 다양한 문이다. 해양 생태계에서 그들은 특히 풍부 탄소 고정 ^(1)의 약 절반, 바다에서의 질소 고정 ^2와 탄화수소 생산 ³ 톤의 수억의 대부분이 매년 회계, 많은 영양주기에 중요한 역할을한다. 엽록체, 진핵 조류와 식물의 광합성을 담당하는 세포 기관은 숙주 생물체 ^(4)에 의해 침몰 된 cyanobacterium에서 진화 한 것으로 보인다. 시아 노 박테리아는 식물에 보존되어 많은의 광합성, 전자 수송층 ⁽⁵⁾ 및 생화학 적 경로의 연구에 유용한 모델 생물을 증명했다. 추가 시아 노 박테리아에서 점점 그들의 안녕에 전기 ⁷ 및 산업용 화합물을, ^{6 바이오} 연료, 식량 생산을 위해 ^8을 사용하고 있습니다물과 CO _2의 ghly 효율적으로 변환 태양 에너지 ^(9)를 사용하여 바이오 매스합니다. 많은 종은 잠재적으로 농업 생산에 영향을주지 않고 큰 규모로 성장시킬 수있는 시아 노 박테리아를 제안, 최소한의 영양분과 해수와 비 경작지에 재배 할 수있다. 어떤 종은 항진균, 항균 및 항암 화합물 ^{10, 11를} 포함하는 천연 제품의 소스입니다.

돌연변이 체를 생성 할 수있는 능력은 산업 목적을 위해 균주의 개발을위한 시아 노 박테리아 광합성, 생화학 및 생리학을 이해하는 키 필수적이다. 발표 된 연구의 대부분은 유전 적 관심 부위에 항생 물질 내성 카세트의 삽입에 의해 변형 균주 생성한다. 이것은 몇 항생제 내성 카세트 박테리아에서 사용할 수있는 등의 균주에 도입 할 수있는 돌연변이의 수를 제한한다. 항생제 재를 부여하는 유전자를 포함하는 균주sistance 바이오 연료 및 다른 낮은 값 ^{(12)의 제품을} 생산하는 유일한 비용 효과적인 수단이 될 가능성이 개방 연못 산업 생산을 위해 사용될 수 없다. 도장이 돌연변이 체의 생성은 이러한 한계를 극복한다. 표시없는 돌연변이 의도적으로 포함하지 않는 한, 외래 DNA를 함유하지 않고, 여러 번 조작 할 수있다. 따라서, 원하는대로 변형에 많은 변화를 생성 할 수있다. 또한, 수정 위치의 하류 유전자에 극성 효과는 유기체 ^{(13)의보다} 정확한 수정 있도록 최소화 될 수있다.

삭제할 유전자 측부 시아 노 박테리아 염색체에 지역에 두 개의 DNA 단편 동일한 포함하는 돌연변이 균주, 자살 플라스미드를 생성하려면 먼저 구성된다 (5 '및 3'측면 영역을 지칭). 두 유전자는 이러한 측면 영역 사이에 삽입된다. 이들 중 하나는 항생제 내성 단백질을 코딩; 둘째가 sacB, 어떤 자극 인코딩levansucrase uces, 화합물은 자당에 대한 민감성을 부여. 공정의 제 1 단계에서 표시 돌연변이 일부 외래 DNA를 함유 한 균주가 생성된다. 플라스미드 구조체는 시아 노 박테리아 세포와 혼합하고, DNA를 유기체에 의해 자연적으로 수행된다. 형질 전환은 적절한 항생제와 PCR에 의해 확인 돌연변이 유전자형을 포함하는 한천 플레이트에 성장에 의해 선택된다. 자살 플라스미드 관심 균주 내에서 복제 할 수 없습니다. 따라서 어떤 항생제 내성 콜로니는 관심있는 유전자의 염색체에 삽입함으로써 재조합 사건에 기인 할 것이다. 도장이 돌연변이 체를 생성하기 위해, 돌연변이 표시된 후 바로 5 '및 3'플 랭킹 영역을 포함하는 제 자살 플라스미드와 혼합된다. 외래 DNA의 삽입이 필요할 경우, 이러한 DNA 단편 사이에 삽입 관심의 유전자를 포함하는 카세트 영역 측면 5 '및 3'이루어지는 플라스미드를 사용할 수있다. 실리ction은 자당을 포함하는 한천 플레이트에 성장을 통해입니다. 가 sacB 유전자 산물이 발현되는 경우 수크로오스가 세포에 치명적이기 때문에, 생존 세포 만이 크로스 민감성 유전자, 항생제 내성 유전자 이외에에서 재결합되어있다 두번째 재조합 이벤트가 발생하는 것과이있다 염색체와 플라스미드. 재조합 교환 결과적으로, 측면 영역들과 이들 사이의 DNA가 염색체에 삽입되어있다.

우리는 성공적으로 스티스 특검팀의 동일한 균주에 여러 염색체 돌연변이를 생성하기 위해 이러한 방법을 사용했다. (이하 스티스라고 함) PCC6803 ^{13, 14는} 관심 ^(13)의 유전자로 유전자 카세트의 발현에 대한 하나의 점 돌연변이를 소개합니다. 도장이 녹아웃의 생성 스티스 ^15,16 상세한 방법에서 우리의 작업에 앞서 입증되었지만, 힘 입어중요한 단계의 시각적 표현은 공개적으로 사용할 수 없습니다. 우리는 또한 다른 모델 cyanobacterium, 인 Synechococcus 특검팀에 표시된 녹아웃의 생성을 위해 동일한 방법을 적용했습니다. PCC7002 (이하 인 Synechococcus 함). 이 프로토콜은 돌연변이 검증 이들 균주를 저장하기위한 신속한 프로토콜을 생성하기위한 명확하고 간단한 방법을 제공한다.

프로토콜

문화 미디어 1. 준비

1. Castenholz 1988 년 ^(17)에 따라 BG11 매체를 준비합니다.
   1. 요소와 철 재고 (표 1)를 추적, 100 배 BG11의 재고 솔루션을 준비합니다.
   2. 인산 재고 별도의 용액을 준비 나 ₂ CO ₃ 스톡, N - [트리스 (히드 록시 메틸) 메틸] 아미노 에탄 술폰산 (TES) _{버퍼의 NaHCO3} (표 1).
   3. 인산염과 나 ₂ CO ₃ 주식을 압력솥. - 필터 소독 0.2 μm의 _{필터의 NaHCO3를} TES는 버퍼합니다.
   4. 물 976 ㎖, 100X BG11 10 ㎖, 철분 재고 한 미량 원소 용액 1 ㎖에 결합하여 BG11을 제조하고, 용액을 오토 클레이브. 이 용액을 실온으로 냉각 한 후에 포스페이트 스톡 1 ㎖, 나 ₂ CO ₃ 스톡 1 _{㎖의 NaHCO3} 및 10 ㎖를 추가한다.
   5. BG11 고체 배지를 들어, 한천 15g을 하나의 FLA에 물 700 mL로 추가SK. 제 플라스크에 나트륨 ₂ S 3 g을 넣고 ₂ O _3, 물 226 ㎖, 10 100X BG11 ml의 1 ml의 미량 원소의 철 스톡 1 ㎖. 두 솔루션을 압력솥. 이들 용액을 실온으로 냉각 한 후 이들을 결합하여 하나 포스페이트 재고 ㎖, 나 ₂ CO ₃ 스톡 1 ㎖, TES 완충액 10 ㎖와 _10의 NaHCO3를 가하여.
      주 : 특정 염 용액의 침전을 피하기 위해 개별적으로 제조된다.
2. 자당에 선택의 경우, (w / v)의 자당 용액을 50 %를 준비합니다. 필터 0.2 μm의 필터 솔루션을 소독하고 BG11 / 5 % 자당 판을 생산하는 (BG11 900 ml의 50 % 자당의 100 ㎖) BG11에 추가 할 수 있습니다.
   참고 : BG11 / 5 % 자당 한천 _{플레이트의 NaHCO3를} 추가하지 마십시오. 정상으로 나 ₂ CO _{3를 추가합니다.}
3. 인 Synechococcus의 배양 10 ㎖ 1 M 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산, N의 추가 - (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진을 NR(42) - (2- 에탄 설 폰산) (HEPES) 및 BG11 배지 1 L 비타민 B ₁₂ (표 1) 1 ㎖.
   참고 : 시판 BG11 배지에서 배양 된 균주의 변형이 여기에 설명 된 BG11 미디어 조리법에서보다 훨씬 덜 효율적이므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.

시아 노 박테리아 균주 2. 성장

1. 문화는 50 ㎖의 최대 볼륨 100 ML 원뿔 플라스크에 균주 120 rpm으로 흔들. 가스 교환을 할 수 있도록 접시의 측면에서 파라 필름 및 구멍 세 개의 작은 구멍 BG11 판을 밀봉합니다. 20 ~ 40 μmol 광자 m 사이의 빛의 강도에 광 생물 반응기에서 형광등 아래 30 ° C에서 모든 균주를 품어 ^-2 초 ^-1.
2. 최고의 멸균 기술을 사용합니다. 층류 후드에있는 모든 시아 노 박테리아 균주를 처리합니다.
   참고 :이 변종 쉽게하는을 contamin 할 수 있습니다, 미디어 포함 자당 배양 할 때 특히 중요하다ated.

플라스미드를 구축의 3 세대

1. 이러한 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)와 같은 프라이머를 설계 소프트웨어를 사용하여 필요한 제한 효소 부위를 포함하여 프라이머의 디자인 세트는 두 ~ 1킬로바이트 영역 5 '및 3'증폭 관심의 유전자. Cyanobase를 통해 시아 노 박테리아 종의 게놈 시퀀스를 참조하십시오 (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). 여기에 사용 된 모든 프라이머는 표 2를 참조하십시오. 설계 할 때 프라이머는 다음과 같은 요소를 고려 :
   1. 증폭 된 영역이 변이 될 유전자, 예를 들어 그림 1의 5 '및 3'영역을 포함하는지 확인하십시오.
   2. 안티센스와 비 코딩 RNA를의 의도하지 않은 돌연변이를 방지하기 위해 유전자 간 영역을 변이하지 마십시오. 스티스에서 돌연변이의 생성을 위해, Mitschke 등으로 문서화 전사 시작 사이트 목록을 참조하십시오. 2011 년 ¹⁸ 안티센스의 돌연변이를 방지하기 위해또는 RNA를 비 코딩.
   3. 선택 측면 영역은 복제를 방해 할 수있는 대장균의 유전자 발현과 같은 인접한 유전자의 완전한 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는 경우.
2. 제조업체의 지침에 따라 높은 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 PCR에 의해 제품을 증폭.
   참고 : 우리의 경험에서이 효소는 몇 가지 오류를 생성합니다.
   1. HF 버퍼와 DMSO의 0, 1.5 또는 3 μL를 포함하는 50 μl의 PCR 반응을 설정합니다. 반응에 따라 게놈 DNA의 100 NG를 사용합니다. 72 °의 최종 신장 단계,이어서 30 초, 10 초, 30 초, 30 초 동안 67 ° C, 72 ° C, 98 ° C 35 라운드 동안 98 ° C의 초기 변성 단계로 구성되는 프로그램을 사용하여 5 분 C. 이것은 일반적으로 일관된 제품을 제공합니다.
3. 겔 전기 영동을 통해 정확한 크기 엔도 뉴 클레아 제 효소로 분해하여 PCR 제품과 샘플을 확인합니다. (w / v) 아가로 오스 겔이 0.02 %를 함유하는 1 %를 실행100 V. 45 분 (v / v)의 에티 디움 브로마이드
   주의 : 에티 디움 브로마이드는 잠재적 인 돌연변이이며, 적절한 보호 처리해야합니다.
4. 제조자의 지시에 따라 DNA 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 또한 아가 로스 젤에서 잘라 조각을 포함하는 플라스미드 단편의 정제를 위해이 키트를 사용합니다. 물 14 μL에 정제 된 DNA를 용출.
5. 복제 단계는, 제조업체의 지시에 따라 30 ㎕의 총 부피에서> 1 시간 동안 37 ° C에서 제한 효소 반응 혼합물을 배양한다.
6. 결찰 단계는 정제 소화 플라스미드 5 μL 정제 분해 인서트의 12 μL, 버퍼의 2 μL와 리가 아제 1 μl를 함유하는 20 ㎕의 총 부피에서> 1 시간 동안 실온에서 결찰 DNA 단편.
7. 이하의 방법에 따라, 대장균 DH5α에 형질 전환 세포를 준비한다.
   1. 밤새 E. 성장 대장균
   2. 밤새 배양 한 용액 6 mL의 1 M의 MgCl ₂ (표 1)을 함유하는 1 L 삼각 플라스크에 400 ml의 LB를 접종한다.
   3. 약 4 시간 동안이나 외경 _{600 ㎚가} 0.4-0.6에 도달 할 때까지 220 rpm에서 37 ° C에서 문화를 성장.
   4. 1 시간 동안 얼음에 세포를 놓습니다.
   5. 10 분 동안 2,800 XG에 원심 분리기는 4 ° C에서 세포 펠렛합니다.
   6. 160 ml의 용액 A (표 1)에 뜨는 및 재현 탁를 제거하고 20 분 동안 얼음에 품어.
   7. 10 분 동안 2,800 XG에 원심 분리기는 4 ° C에서 세포 펠렛합니다.
   8. 4 ml의 솔루션 A + 글리세롤 (표 1)에서 상층 액과에 resuspend를 제거합니다.
   9. -80 ° C에서 액체 N _2, 가게에서 동결, 50 μL 씩을 준비합니다.
   10. 유능한 세포의 50 μL와 결찰 혼합물의 5 μl를 혼합하고 얼음에 1 시간 동안 품어.
   11. 열은 90 초, FOLLO 42 ° C에서 세포를 충격2 분 동안 얼음 위에서 배양 결혼.
   12. LB 미디어 (표 1)의 950 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
   13. 나누어지는 (50)와 적절한 항생제와 함께 접시에 200 μL, 암피실린 (100 μg의 / ㎖) 및 / 또는 카나마이신 (/ ㎖ 30 μg의) 중 하나.
       주의 : 카나마이신 암피실린 모두 독성이 적절한 보호 처리해야합니다.
   14. 선택과 적절한 항생제 접종 2 ml의 LB 배지에서 단일 콜로니를 배양한다.
8. 제조자의 지시에 따른 미니 프렙 플라스미드 정제 키트를 사용하여 모든 플라스미드를 정제 하였다.
9. 다음 단계에있어서, 상기 cpcC1C2 유전자 노크 본 구체 예에서, 플라스미드를 생성한다.
   1. 프라이머 cpcC1C2leftfor 및 cpcC1C2leftrev을 (표 2 단계 3.2 참조)를 사용하여 1012 bp의 5 '플 랭킹 영역 (왼쪽 조각)를 증폭. PCR 반응 소량을 제거하고 있는것올바른 크기의 제품은 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 증폭되고있다. XbaI으로 I와 빵 HI (단계 3.5)이 조각과 pUC19를 다이제스트.
   2. 모두 준비 (단계 3.4), 결찰 (단계 3.6) 정화 (단계 3.7) 및 minipreps (단계 3.8)를 통해 플라스미드 정제를위한 별도의 식민지에서 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 사 2 ml의 LB 액체 문화를 설정 변환.
   3. XbaI으로 I / 빵 HI 소화 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 pUC19를에 조각의 삽입을 확인합니다. 2660 BP와 1012 BP의 밴드 플라스미드에 삽입의 올바른 도입을 나타냅니다.
   4. 프라이머 cpcC1C2rightfor 및 cpcC1C2rightrev을 (표 2 단계 3.2 참조)를 사용하여 1016 bp의 3 '플 랭킹 영역 (오른쪽 조각)를 증폭. PCR 반응 소량을 제거하고 올바른 크기의 제품은 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 증폭되었는지 여부를 확인한다. (일을 골목 I 및 에코 RI이 조각과 pUC19를 다이제스트EP 3.5).
   5. 모두 준비 (단계 3.4), 결찰 (단계 3.6) 정화 (단계 3.7) 및 minipreps (단계 3.8)를 통해 플라스미드 정제를위한 별도의 식민지에서 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 사 2 ml의 LB 액체 문화를 설정 변환.
   6. 골목 I / 에코 RI 소화 (단계 3.5) 및 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 pUC19를에 조각의 삽입을 확인합니다. 2660 BP와 1016 BP의 밴드 플라스미드에 삽입의 올바른 도입을 나타냅니다.
      참고 : pUC19를로 지역 '3의 복제에 대한 영역과 골목 I / 에코 RI'5의 복제에 대한 XbaI으로 I / 빵 HI이 사이트 것은 가능한 한 사용됩니다. 가능하면 항상 나중에 복제 단계를 수행하기 쉽게하기 위해 5 '영역 또는 3의 정방향 프라이머'지역의 역방향 프라이머에 빵 HI 사이트를 포함합니다.
   7. 순서는 예를 들면, 삽입 위치, M1 걸친 프라이머를 사용하여 올바른 경우 모두 삽입 서열이 결정(3) 순방향 및 역방향 M13 (표 2). 순서는 오류가 측면 지역에 도입되지 않습니다 보장하기 위해 정확해야합니다.
   8. XbaI으로 I /의 BamHI 소화 된 pUC19 통해 왼쪽에서 단편을 절제. XbaI으로 I / 빵 HI (단계 3.5)와 pUC19를 + 오른쪽 조각을 소화.
   9. 메스 블레이드를 사용하여 DNA의 절제를 통해 아가 로스 겔 (단계 3.3)에서 1,012 bp의 왼쪽 조각 및 3676 bp의 pUC19를 + 오른쪽 조각을 정화.
   10. 모두 준비 (단계 3.4), 결찰 (단계 3.6) 정화 (단계 3.7) 및 minipreps (단계 3.8)를 통해 플라스미드 정제를위한 별도의 식민지에서 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 사 2 ml의 LB 액체 문화를 설정 변환.
   11. XbaI으로 I / 빵 HI 소화 (단계 3.5) 및 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 pUC19를 + 오른쪽 조각에 조각의 삽입을 확인합니다. 3676 BP와 1012 BP의 밴드 플라스미드에 삽입의 올바른 삽입을 (플라스미드 B로이 참조)을 나타냅니다.
   12. 빵 HI 소화를 통해 pUM24cm ^19에서 NPT1 /가 sacB 카세트. 빵 HI와 다이제스트 플라스미드 B (단계 3.5).
       참고 pUM24cm는 클로람페니콜 내성을 부여하는 단백질을 암호화하기 때문에, NPT / 카세트가 sacB 아가 로스 겔로부터 정제 할 필요가 없다. 식민지가 LB에 재배 따라서 경우 / 암피실린은 / 카나마이신 아가 플레이트 저항하는 식민지로 이어질 것 유일하게 가능한 조합은 플라스미드 B.에 NPT1 /가 sacB 카세트의 통합이다
   13. 모두 준비를 정화 (단계 3.4), 결찰 (단계 3.6), (단계 3.7) 및 플라스미드 정제를위한 별도의 식민지에서 암피실린 (100 μg의 / ㎖) 및 카나마이신 (30 μg의 / ㎖)과 사 2 ml의 LB 액체 문화를 설정 변환 minipreps를 통해 (단계 3.8).
   14. 빵 HI 소화 (단계 3.5) 및 겔 전기 영동 (단계 3.3)를 통해 플라스미드 B에 NPT1 /가 sacB 카세트의 삽입을 확인합니다. 4688 BP와 3894 BP의 밴드 번째의 올바른 삽입을 표시전자 플라스미드 (플라스미드 A에는이 참조)에 삽입합니다.
   15. 대안 적으로, 뭉툭한 끝은 플라스미드 B. 좌우측 단편 사이의 상이한 제한 효소 부위에 NPT1 / 카세트가 sacB와 클론은 NPT1 / 카세트가 sacB 좌우 단편 사이에 클로닝한다.
       참고 : 외국 카세트의 발현 후 필요하면이 플라스미드는 다음 표시되지 않은 녹아웃 단계에서 사용되는 플라스미드 (B)의 좌우 조각 사이에 삽입해야합니다.

표시된 스티스 및 인 Synechococcus 돌연변이의 4 세대

1. BG11 매체의 30 ~ 50 ml의에 세포의 전체 루프를 접종하여 새로운 문화를 설정합니다. _{외경가 750nm} 2-3 일 동안 문화를 성장 = 0.2 0.6.
   참고 : 일반적으로 개별 식민지 빛의도 낮은 수준의 광 저해 및 선택 될 것이다하는 접종과 개별 셀의 노출 사용하기에 너무 작은빛 내성 돌연변이 체합니다.
2. 원심 분리기 1-2 5 분 2,300 XG에 문화 ml의 상층 액을 버린다. 이 세포에 손상을 줄 수 있으므로> 2,300 XG에있는 시아 노 박테리아 문화를 원심 분리하지 마십시오. BG11 매체 번 펠렛을 씻으십시오.
   참고 :이 DNA 흡수에 필수적인 필리의 손실이 발생할 수 있으므로 텍싱에 의해 세포를 재현 탁하지 마십시오. 부드러운 피펫 팅에 의해 세포를 재현 탁.
3. 100 μL의 최종 볼륨에 BG11 매체를 추가합니다. 14 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 세포를 전송합니다.
4. 세포에 플라스미드 A의 1 μg의 추가 부드러운 눌러 섞는다. <플라스미드의 10 μl를 추가합니다.
   참고 바람직 플라스미드> 100 NG / μL의 농도로되어야하지만,이보다 낮은 농도는 성공적으로 형질 전환에 적합하다.
5. 인큐베이터에서 수평으로 튜브를 놓습니다. 4 ~ 6 시​​간 동안 문화를 품어.
   주 : 셀 간단히마다 1-2 시간을 눌러 혼합 될 수 있지만, 이것은 필수적이지 않다. 샘플을 배치 할 수있다이 크게 효율성을 개선하지 않더라도 배양기를 흔들어.
6. 항생제없이 BG11 아가 플레이트상의 세포 배양 / 플라스미드 DNA 혼합물의 분취 량을 확산. 일반적으로 20 μL, 80 μL 씩 별도의 접시에 확산된다.
7. 한천 플레이트 ~ 24 시간 후, (한천 0.12 g / ml의 카나마이신 100 mg을 100 ㎕ 20 ㎖ 당) 카나마이신이 포함 된 물에 0.6 %의 2.5-3 ml의 한천 솔루션을 추가 할 수 있습니다. ~ 42 ° C에이 솔루션을 쿨하고, 한천 판의 가장자리에 추가 할 수 있습니다. 플레이트 그래서 용액 표면에 균일 '상부 한천'층을 형성 기울인다.
8. 시간의 추가 기간 동안 한천 플레이트를 품어. 식민지 약 7 일 후 볼 수 있어야합니다.
   참고 : 한천 플레이트를 인큐베이터에서 높은 3을 적층 할 수있다. 일반적으로 식민지 수백 변화에 따라 얻을 수있다.
9. 판 한천 BG11 + 카나마이신 (30 μg의 / ㎖)에 킬 개별 식민지. 6 섹터로 한천 플레이트를 나누고 행진에 무딘 끝 이쑤시개를 사용각 부문에 걸쳐 식민지. 하나의 식민지를 획득하는 형질 전환의 중요한, 단지 성장하지 않습니다.
10. 제조업체의 지시에있어서의 Taq DNA 중합 효소를 사용하여 PCR에 의해 표시 녹아웃을 확인한다. 반응마다의 MgCl ₂ (25 mM)을 2 μl를 추가합니다.
    1. 세포의 작은 비율을 제거하고 50 ㎕의 물과 20 ~ 425-600 μm의 유리 비드를 포함하는 튜브로 옮긴다. ~ 2000 rpm에서 5 분간 진동에서 흔들어서. 5 분 동안 15,700 XG에 원심 분리기와 50 μl의 PCR 반응에 따라 상층 액의 5 μl를 사용합니다.
       참고 : 솔루션을 재현 탁하지 마십시오. 세포 파편은 튜브의 하단에 머물 필요가있다.
11. 돌연변이의 유효성을 검사합니다
    1. (예로서 Primer3) 프라이머 디자인 소프트웨어를 이용하여 넉 아웃 영역에 걸쳐 설계 프라이머. 녹아웃 영역의 ~ 200 bp의 양쪽에서 시작하는 디자인 프라이머.
       참고 : cpcC1C2 돌연변이를 확인하기위한 프라이머는 표 2에 요약되어 있습니다및 cpcC1C2for 및 cpcC1C2rev을 불린다.
    2. 뒤에 붙는 2 분, 1 분, 1 분, 60 ° C, 서열 KB 당 1 분 동안 72 ° C, 95 ° C 35 라운드 동안 95 ° C의 초기 변성 단계로 구성된 프로그램을 이용하여 제품을 증폭 5 분 72 ° C의 최종 확장 단계. 야생형 제어를 포함한다. 이것은 일반적으로 일관된 제품을 제공합니다.
    3. 겔 전기 영동을 통해 유전자형을 확인합니다. 표시 녹아웃 형질 전환 4 ~ 킬로바이트 (왼쪽 및 오른쪽 조각 플러스 NPT1 /가 sacB 카세트 모두 0.2 킬로바이트)와 야생형 밴드의 부재 (그림 2)의 밴드가 표시됩니다.
       주 : 특정의 경우에 ~ 4킬로바이트 대역 인해 PCR 산물의 큰 크기로 표시된 변이체에서 관찰되지 않는다. 야생형의 예상 크기에 해당하는 밴드가 다음 관측되지 않는 경우, 일반적으로이 균주는 현저한 녹아웃이다.
12. 야생형 밴드가 여전히 존재하는 경우 다음의 변형을 연속으로 재 -신선한 BG11 + 카나마이신 (30 μg의 / ㎖) 한천 플레이트와 PCR를 반복합니다. 더 야생형 밴드는 PCR 반응에서 관찰되지 않도록 돌연변이가 분리 될 때까지 다시 스트리킹 과정을 반복.
    참고를 50㎍ / ㎖의 농도로 마이신의 양을 증가 후 100 μg의 / ㎖ 충분히 현저한 돌연변이를 분리하기 위해, 때때로 필수적이다.
13. 균주는 PCR을 통해 표시 돌연변이 프로필을 보여줍니다 경우, 다시 행진을 신선한 BG11 + 카나마이신 (30 μg의 / ㎖) 한천 접시에. 표시가없는 녹아웃을 생성하는 균주를 사용합니다.
    주 :이 프로토콜은 단지 항생제 내성 카세트 표시된 변이체를 생성하는 데 사용될 수있다, 즉 좌우 단편 사이 pUC18K ^{(20)로부터} 단지 NPT1 카세트와 NPT1 /가 sacB 카세트로 대체함으로써..

표시되지 않은 스티스 돌연변이의 5 세대

1. (c)의 전체 루프를 접종하여 표시 녹아웃의 신선한 문화를 설정BG11 배지에 30 ~ 50 ml를 학습 학생. _{외경가 750nm} 2-3 일 동안 문화를 성장 = 0.2 0.6.
2. 원심 분리기 2300 XG에 문화 10 ml의 5 분 상층 액을 버린다. BG11 매체와 한 번 씻으십시오.
   참고 :이 DNA 흡수에 필수적인 필리의 손실이 발생할 수 있으므로 텍싱에 의해 세포를 재현 탁하지 마십시오. 부드러운 피펫 팅에 의해 세포를 재현 탁.
3. 200 μL의 최종 볼륨에 BG11를 추가합니다. 14 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 세포를 전송합니다.
4. 세포에 플라스미드 B의 DNA 1 μg의 추가 부드러운 눌러 섞는다.
5. 4 ~ 6 시​​간 동안 샘플을 품어. 수평 튜브를 놓습니다.
   주 : 셀 간단히마다 1-2 시간을 눌러 혼합 될 수 있지만, 이것은 필수적이지 않다. 이 효율이 개선되지 않지만 샘플을 진탕 배양기에 배치 될 수있다.
6. 떨고 4 일 총 샘플을 B​​G11 매체의 1.8 ML을 추가하고 품어. 이 재결합은 여러 염색체 사본에서 발생 할 수있는 충분한 시간이다.
7. BG11 / 5 % 자당 아가 플레이트에서 형질 전환 혼합물의 분취 플레이트. 플레이트 50 μL, 10 μL 한천 플레이트에 1 μL. 식민지 잔디는 모든 한천 플레이트 신선한 판에 추가 솔루션과 나누어지는을 희석에 표시합니다. 식민지 약 7 일 후 볼 수 있어야합니다.
8. 무딘 단부 이쑤시개를 이용하여 먼저 한천 플레이트 BG11 + 가나 마이신 (30 μg의 / ㎖)에 30 ~ 50 초 개별 콜로니 BG11 / 5 % 자당 아가 플레이트 패치. BG11 / 5 % 자당 판에 성장하지만, 카나마이신하지 BG11 + 플레이트 가능성이 표시되지 않은 녹아웃있는 모든 박테리아. 두 플레이트상에서 성장하는 박테리아 기인가 sacB 유전자의 돌연변이에 내성 수크로오스 될 가능성이 높다.
9. 표시된 녹아웃을 확인하는 데 사용 된 것과 동일한 프라이머 및 방법을 사용하여 표시되지 않은 녹아웃을 확인합니다. 예를 들어 cpcC1C2for 및 cpcC1C2rev (표 2)에 cpcC1C2 표시되지 않은 녹아웃을 검증. 잠복 녹아웃은 아가 로스 겔 대응 t에 밴드를 표시합니다오 야생형 크기 - 삭제 된 영역 (그림 2).
10. 변형이 표시되지 않은 돌연변이 PCR을 통해 프로필 (단계 4.11.2)와 겔 전기 영동 (그림 2)이 표시되면 다음 다시 행진 신선한 BG11 한천 플레이트에를 항생제없이.

균주 6. 장기 저장

1. BG11 매체의 30 ~ 50 ml의에 세포의 전체 루프를 접종하여 변형의 새로운 문화를 설정합니다. _{외경가 750nm} 3-4 일 동안 문화를 성장 = 0.4를 0.7으로.
2. BG11의 ~ 2 용액에 BG11과에 resuspend 한 번 세포를 씻으십시오.
3. 하나의 튜브에 집중 세포의 0.8 ML을 추가합니다. 그런 다음 80 % 필터 살균 글리세롤 0.2 ml에 추가 할 수 있습니다.
4. 옵션 : 다른 관에 농축 된 세포의 0.93 ML을 추가합니다. 이 튜브에 DMSO의 0.07 ML을 추가합니다.
   주의 : DMSO는 독성이 적절한 보호 처리해야합니다.
5. -80 ° C에서 모두 튜브를 저장합니다. 균주 튜브를 제거하고 무딘 치아와 일부 세포를 긁어 회복하려면항생제없이 한천 판에 선택합니다. 정상적으로 멸균 루프를 이용 킬.

그림 1 : 표시 및 표시되지 않은 녹아웃, 스티스의 예 cpcC1 및 cpcC2의 생성을위한 플라스미드 건설 (B) cpcC1 및 cpcC2 인접 유전자가있는 스티스 게놈의 (A) 지역.. 돌연변이 삭제 될 게놈 영역은 흑색으로 강조이다. PCR로 증폭 된 게놈의 (C) 사이트. 5 '(청색으로 표시) 측면 영역과 3'(적색으로 표시) 측면 영역으로 pUC19에 클로닝하기위한 제한 효소 부위로 증폭된다. 영역의 측면에 5 '(또는 3')을 pUC19에 + 3 '(또는 5로 된 pUC19로부터 잘라 내고 삽입9, 플라스미드 B. (D) pUM24에서 NPT1 /가 sacB 카세트가 플라스미드 A.를 생성하는 영역을 측면 5 '및 3'사이 쿵 HI 분해를 통해 절제 및 삽입을 생성하기 위해 지역 플라스미드를 측면) 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

결과

플라스미드 설계는 모두 표시되고 표시되지 않은 돌연변이 체의 생성에 성공에 중요하다.도 1 플라스미드 (A)의 일례를 제공하고 B는 스티스 유전자 cpcC1 및 cpcC2 ¹³ 결실 돌연변이 체의 생성에 사용. 각 경우에 5 '및 3'플 랭킹 영역은 약 900-1,000 염기쌍이다. 우리가 성공적으로 상용화에 박차를 가하고있는 최소 약 500 bp의 하였지만 감소 측면 영역을 사용할 수있다. B 플라스미드는 5 '및 3'~ 1킬로바이트 측면 영역 또는 천연 유전자 서열의 변형 된 버전 사이의 유전자 카세트를 포함 할 수있다.

...

토론

표시되지 않은 돌연변이의 발생에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1)주의 플라스미드 디자인은 대상 지역이 변경 될 수 있도록; 2) 샘플 자당에, 특히 배양 무균 유지 보장; 3) 도금 처음에 24 시간 이상 한천 플러스 항생제 첨가하여 항생제, 부족 BG11 아가 플레이트 상에 표시 돌연변이 생성 세포를 형질 전환; 4) 배양은 BG11 플러스 자당 한천 플레이트에 도금하기 전에 4 완전 일 돌연변이 표시 : 5)로 표시 돌연변이가 완전히 분리 된 것을 보장하고 6) 완전히 돌연변이 균주의 유전자형을 확인. 이 마지막 단계에서, 삭제 된 영역의 일부를 증폭하기위한 프라이머의 추가는 그것을 제거되었음을 확인하기 위해 사용될 수있다. 서던 블롯은 힘든 상태도 사용될 수있다. 그러나, 우리의 경험은이 문서에서 설명하는 절차는 돌연변이의 적절한 검증을위한 충분한 것입니다. 이 절차는 또한 Synechococ의 현저한 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다기분이야 elongatus PCC7942. 그러나,이 cyan...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	시그마	230391
CaCl2	Sigma	C1016
구연산	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	시그마	331058
CuSO4.5H2O	시그마	209198
Co(NO3)2.6H2O	시그마	239267
구연산 철 암모늄	Sigma	F5879
K2HPO4	시그마	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	시그마	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	시그마	H3375
시아노코발라민	시그마	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto 한천	BD	214010
설탕	Fisher	SUC001
페트리 접시 90mm 트리플 벤트	Greiner	633185
0.2 µ m 필터	Sartorius	16534
100 ml 원뿔형 플라스크	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion 고충실도 DNA 중합효소	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA 정제 키트	MoBio	12100-300
제한 엔도뉴클레아제	NEB
T4 리가제	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani 육수	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamycin sulfate	Sigma	60615
Ampicillin	Sigma	A9518
GeneJET 플라스미드 miniprep kit	Thermo Scientific	K0503
14 ml round-bottom tube	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
425-600 µ m 유리 구슬	Sigma	G8772
글리세롤	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
형광 전구	Gro-Lux	69
HT multitron photobioreactor	Infors