Method Article

개발 및 특성화의 체외 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘 2 +] 전 및 질소 산화물 생산

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

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1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

Abstract

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생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형을 나타내고있다. 미세 유체 장치의 개발이 20 년간 엔지니어들이 채택되었지만, 생물학적 응용은 제한 남아있다. 생물학적 응용 프로그램에 의해 검증보다 생리 학적으로 관련 시험 관내 미세 혈관 모델들이 필드에 발전 생체 사이 시험관 연구에서 격차를 해소하는 것이 중요하다. 여기서는 장기 관류 용량을 갖는 미세 유동 장치를 이용하여 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 절차를 제시한다. 또한, 종래의 공 초점 및 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 EC [칼슘] i 및 산화 질소 (NO)의 생산에서 작용제 - 유도 변화의 정량적 측정을위한 응용 프로그램을 보여준다. 형성된 미세 혈관 순연속 관류와 작업이되는 EC 사이의 잘 발달 된 접합을 보여 주었다. 분포를-cadherin의 VE 것은 정적 배양 EC 단층보다 그대로 미세 혈관에서 관찰에 가까운이었다. EC의 일시적인 증가가 유도 ATP [CA는 2+] i 및 NO 생산은 정량적 배양 된 미세 혈관의 기능을 검증 개별 셀 레벨에서 측정되었다. 이 마이크로 유체 장치는 내장 컴퓨터가 기존의 정적 2D 문화보다 생체 내에서의 세포 배양 환경을 가까이하게 잘 조절, 생리 학적으로 관련 흐름에 따라 증가 할 수 있습니다. 마이크로 채널 네트워크 설계 다용도이며, 제조 공정이 단순하고 반복적이다. 이 장치는 쉽게 고해상도 영상화를 가능하게하는 공 초점 현미경 또는 종래의 시스템에 통합 될 수있다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에, 가장 중요한 것은,이 방법은 방법을 조사하기 위해 유용한 도구가 될 것병리학 적으로 환자 샘플에서 변경된 혈액 성분은 인간의 내장 컴퓨터에 영향을 미치는 임상 문제에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 약물 스크리닝을위한 플랫폼으로 개발 될 수있다.

Introduction

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생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형 1,2 나타내고있다. 미세 유체 기술은 원하는 유량 조건 하에서 성장하기 위하여, 특히 혈관의 EC를 들어, 세포 배양을위한 기회를 제공하는 마이크로 기하학적 제약 (서브 밀리미터) 채널 (3)을 통해 유체를 정밀하게 제어 할 수있다. 이러한 기능은 기존의 정적 차원 세포 배양에 비해 생체 내에서의 세포 배양 조건을 가까이합니다. 그들은 마이크로 유체 장치 vasculatures의 다른 유형을 모델링하는 데 사용되는 기계적 및 / 또는 화학적 자극에 대한 EC의 반응을 연구 할 때 매우 중요하다.

정적 세포 배양, 생물 의학 F의 적응과 미세 유체의 응용 프로그램을 통해 마이크로 네트워크에 의해 입증 장점에도 불구하고의 ield 제한 남아있다. 최근의 검토에 의해보고되는 경우,이 필드 (85 %)의 서적의 대부분은 공학 저널 (4)에 정지한다. 미세 유체 장치의 성능은 대부분의 생물 학자들이 같은 트랜스 웰 분석이 소형 장치에 매크로 규모의 배양 접시 / 유리 슬라이드로 현재 기술로 전환하기에 충분한 납....

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Protocol

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1. 미세 유체 소자의 제작

  1. SU-8 (50) 마스터 금형의 표준 포토 리소그래피 제작
    1. 스핀 코팅 전에 실리콘 웨이퍼를 청소합니다. 15 분 동안 이소 프로필 알콜 (IPA) 다음에 15 분 동안 아세톤 노출 된 2 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다. 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 배치하여, 웨이퍼 탈수. 탈수 후, 실온에서 웨이퍼를 냉각.
    2. 스핀 코트 SU-8 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 웨이퍼에 2 ㎖의 SU-8 포토 레지스트를 추가합니다. 30 초 동안 300 rpm으로 / 초 가속 1,000 rpm으로 다음 10 초 동안 100 rpm으로 / 초 가속에서 500 rpm으로,에 웨이퍼를 램프. (보충 비디오 1 참조)
    3. 프리 베이킹을 30 분 동안 95 ° C에서 10 분 후, 소프트 베이크와 65 ℃에서 핫 플레이트상에서 웨이퍼.
    4. 스핀 코팅 된 포토 레지스트에 영화 마스크에서 디자인 패턴을 변환하는 자외선 노출을 사용합니다. 막을 마스크로 얇은 투명 필름에 패턴을 인쇄. 의 상부에 마스크 필름을 놓고포토 레지스트 코팅 - 스핀과 300 엠제이 / cm 2의 용량과 UV에 노출. (보충 비디오 2 참조)
      참고 :이 프로토콜에....

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Results

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이 섹션에서는이 프로토콜을 개발 한 배양 된 미세 혈관 네트워크와 얻어진 결과의 일부를 보여줍니다. 마이크로 패턴은 세 개의 레벨 분기 네트워크 (도 1a)이다. 이 설계에서, 네 개의 100 ㎛ 폭 보조 채널로 다시이 126 μm의 넓은 채널, 나뭇 가지로 159 ㎛ 폭 어머니 채널 분기합니다. 의 3D 수치 시뮬레이션이 마이크로 네트워크 내에 전단 응력의 ​​세 가지 레벨을 표시 0.35 μL / 분의 유속 (도 1b)에 따라 전단 응력 분포를 추정 하였다. 마이크로 채널 내의 층류를 교란 또는 보조 유동의 존재없이 유체 역학적으로 안정한 것으로 예상된다. SU-8 마스터 몰드는 표준 포토 리소그래피 공정 (도 1C)를 제조 하였다 후, PDMS 장치는 마이크로 채널 (NE)를 복제하는 소프트 리소그래피를 통해 제조 된투명, 공기 투과성 지지체 (- E

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Discussion

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이 글에서, 우리는 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 프로토콜을 제시, EC 접합 및 F-굴지의 유통 세포 골격 특성화 및 EC의 정량적 측정 [칼슘 2 +] i와 미세 유체 장치를 이용하여 NO 생산. 관류 미세 유체 장치는 생체 내 미세 혈관 형상과 전단 유동 조건의 가까운 시뮬레이션을 허용하는 체외 모델을 제공합니다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에,이 방법은 환자의 시료로부터 변형 된 혈액 성분이 배양 된 미세 혈관에 환자의 혈액 시료를 직접 관류 인간 EC에 영향을 미치는지 병리학 연구 및 임상에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 유용한 수단이 될 수있다 문제. 미세 혈관의 EC 개발 인간은 인간과 동물의 조직과 약물 반응에 잠재적 불일치를 피하기 위해 약물 스크리닝에 사용될 수있다.

ve_content ">이 프로토콜에 도시 된 미세 유동 장치의 기판 상에 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 경쟁의 이익 또는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 지원되었다 HL56237, 당뇨병과 소화기의 국립 연구소 및 신장 질환 연구소 DK97391-03, 국립 과학 재단 (NSF-1227359 및 EPS-1003907)를 부여합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
아세톤Fisher ScientificA929
생검 펀치Miltex33-31 AA
소 알부민MP Biomedicals810014
소 뇌 추출물(BBE)LonzaCC-4098
커버 슬립Fisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
당나귀 안티-염소 IgG (H+L) 보조 항체생명 기술A-11055
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190-250
DRAQ5 (핵 염색) 세포 신호 기술4084
내피 세포 성장 보충제(ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
소 태아 혈청Gibco16000-044
FibronectinGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
돼지 껍질의 젤라Sigma-AldrichG1890-100G
겐타마이신(50mg/ml)Gibco15750-078
유리 커버슬립Fisher Scientific12-548B
유리 파스퇴르 피펫VWR14672
돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염Sigma-AldrichH3393-10KU
HEPES 완충 식염수LonzaCC-5024
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)LonzaCC-2517
이소프로필 알코올(IPA)VWR89125
L-글루타민(200mM)Gibco25030-081
포유류 링거 용액 성분
NaCl(132mM)Fisher ScientificS671-3
KCl(4.6mM)Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 · 7H2O (1.2 mM)Fisher ScientificM63-500
포도당 (5.5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5.0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepes Salt (9.1 mM)Research Organics6007H
Hepes Acid (10.9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Culture MediumLife Technologies10372-019
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Phalloidin (F-actin staining)Sigma-AldrichP1951
Buffered Saline Life technologies14040-133
폴리디메틸실록산(PDMS)다우코닝 코퍼레이션실가드 184
메스엑셀 Int29552
스카치 테이프3M34-8711-3070-3
실리콘 웨이퍼VWR14672
SU-8 포토레지스트MicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 현상액MicroChemY020100
조직 배양 플라스크Sigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
트립신 중화제 용액GibcoR-002-100
트립신/EDTA 용액(TE)GibcoR-001-100
튜빙Cole-ParmerPTFE 마이크로보어 튜브, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
장비 이름Company카탈로그 번호Comments/Description
Biosafety Laminar hoodNuAireNU-425 Class II, Type A2
CCD 카메라HamamatsuORCA
컨포칼 현미경LeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
핫플레이트WenescoHP-1212
인큐베이터Forma Scientific3110
Isotemp 오븐Barnstead3608-5
리소그래피 벤치Karl SussMA6 Contact Lithography
광학 현미경NikonL200 ND &
CCD 카메라Sutter InstrumentLambda 10-2
플라즈마 클리너PVA TePla/Harrick 플라즈마M4L/PDC-32G
스핀 코터Brewer ScienceCee 200X
주사기 펌프 시스템Harvard Apparatus703005
소프트웨어 이름 회사카탈로그 번호설명
CAD 소프트웨어AutodeskAutoCAD 2015
CFD 시뮬레이션 소프트웨어COMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
이미지 획득 및 분석 NO 생산 범용 이미징메타플루오르(Metafluor
틴 )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

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Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

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