Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 ^{1, 2에} 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 ^3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 ^{3,5,6,8,9 구조를} 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종.

폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 ^{10, 11를} 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다.

쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 & C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다.

이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 ⁺ / SOX2 ⁺ 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A ^+), 클럽 (SCGB1A1의 ⁺⁾ 및 기저 (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.

동물 실험은 아픈 어린이 연구소 대한 병원의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행 하였다.

1. 비계 준비

1. 폐의 탈세 포화
   1. CO ₂ 챔버를 사용하여 성체 위 스타 래트를 안락사. 챔버에서 동물을 놓고 분당 챔버 체적 10-30 %의 충전 속도 100 % CO ₂ 노출을 시작합니다.
      1. 무의식에 대한 동물을 관찰; 이 약 2 ~ 3 분 후에 발생합니다. 의식이 기간에 발생하지 않으면, 속도 및 챔버 시일 채우기 확인. 무의식에 이어, 어두운 눈 색깔과 호흡 부족으로 동물을 관찰한다. 모두가 관찰되는 경우, 1 ~ 2 분 동안 CO ₂ 충전을 유지하고 다음 절차를 챔버에서 동물을 제거합니다.
   2. 앞발과 뒷발 다리를 고정하여 표면을 해부에 동물을 고정하고, 70 % 에탄올로 가슴과 복부 영역을 스프레이. 심장과 루 입구흉골을 따라 수직 절개를 이용하여 흉강을 열어 NGS.
   3. 격막을 통해 작은 절개를 만드 먼저 폐 천공의 가능성을 감소, 폐는 수축하게한다. 봉합과 하대 정맥을 결찰 작은 해부 가위 좌심방의 작은 절개를 배치합니다.
   4. 헤파린 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (HBSS 10 U / ㎖ 헤파린)로 채워진 25 G 바늘 준비된 10 ㎖ 주사기를 사용하여 폐순환 통해 버퍼 밀어 우심실에 바늘을 삽입하여 폐 관류 시작 (2 ㎖ / 분의 속도로). 폐는 흰색 켜고 좌심방에서 흐르는 유체 분명히 실행 때까지이 절차를 계속합니다.
   5. 관류 후, 갑상선 연골 근처 플라스틱 카테터와 기관 및 cannulate을 노출하고 봉합 제자리에 고정합니다.
   6. 설치 레토르트 스탠드와 클램프에 10 ML의 주사기를 고정하여 중력 재관류 시스템. 제거하고 Discard 주사기 플런저. 폐 위 20cm에 주사기 배럴의 최대 충전 포인트를 고정합니다. 주사기의 끝 및 유관 기관에 탈세 포화 용액을 제공하기위한 콕 반대쪽 긴 플라스틱 배관에 양방향 콕을 부착. 주사기에 솔루션을 붓고 솔루션이 부착 된 플라스틱 튜브와 카테터를 입력 할 수 있습니다.
      1. 1 분 동안의 총 폐 용량 (약 12 ml)에 충전하여 폐 세척 유체 폐 밖으로 흐르게 기관에서 플라스틱 카테터를 제거한다. H ₂ O의 20cm 아래에 압력을 유지하기 위해 폐 lavaging 때 주사기 10 개 이상의 ml에 기입하지 마십시오
   7. 인산 완충 식염수 (PBS) 10 린스 하였다 여덟 번 탈세 포화 용액 폐 반복 세척.
   8. 목과 가슴에 구멍이없는기도와 폐를 해부와 동물에서 분리합니다. vibratome 자체에 대한 준비까지 4 ° C에서 차가운 PBS에서 조직을 유지ctioning.
2. 두꺼운 섹션 생성
   1. 2 %의 약 15 ml의 (w / v) 아가로 오스 4 % 및 6 % 정도로 작은 직사각형 블록으로 모든 돌출부를 매립 (w / v) 아가로 오스를 준비한다. 은 전자 레인지로 PBS에 저 융점 아가로 오스 분말을 녹인다. 열 블록에 50 ㎖ 튜브에 아가로 오스를 전송하고 겔화를 방지하기 위해 40 ° C 이상 온도를 유지한다.
   2. 작은 가위를 사용하여 각 로브 (뇌, 중앙, 액세서리, 그리고 꼬리 오른쪽 엽과 좌측 엽)을 분리하기 위해 각 엽성 기관지의 끝에서 decellularized 폐를 해부하다. 특허 초과 PBS를 제거하고, 2 %의 내부에 배치하는 흡수 시트를 사용하여 각각의 건조 엽 (W / V) 아가로 가열 블록에있다.
   3. 페트리 접시에 배치, 아가로 오스의 코팅의 5 분 후 각 로브를 제거하고 표면은 냉각 판에 1 분 동안 겔 할 수 있습니다.
   4. 부드럽게 5 분 후, 다시 4 % (w / v) 아가로 오스로 멋진 로브를 배치하고, 6 % (w / v) 아가로 오스와 함께 한 번 더 코팅을 반복합니다.
   5. 순차적 공동 후각 로​​브는 ating 가장자리에서 주변 조직 아가 적어도 3mm 금속베이스 몰드를 사용하여 6 % (w / v) 아가로 오스 별도로 각 로브를 포함. 오리엔트 각 로브는 실험자 대향 금형의 표면에서의 돌출부의 가장 큰 평평한 에지 위치로 집게를 사용. 이 날은 vibratome 절편에 대한 표본 플레이트에 고정 된 측면 될 것입니다.
   6. 블록 전에 vibratome와 절편에 적어도 30 분 동안 냉각 판에 겔 할 수 있습니다. 4 ° C에서 최대 12 시간 동안 가습 실에 보관 블록은 이전 절편 vibratome합니다.
   7. 설치 차가운 PBS ^(12)와 절편 챔버를 작성하여 vibratome. 주변의 얼음 목욕과 절편에 걸쳐 차가운 온도를 유지한다. 금형에서 블록을 제거하고 조직의 가장자리에서 약 3mm를 유지하면서, 로브를 둘러싼 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다.
   8. 접착제를 이용하여 시료 판의 중심에 조직을 고정, 및 t에 접시 잠수함그는 절편 챔버를 PBS-가득합니다. 0.2 mm / 초, 1.85 mm, 및 350 ㎛의 : 각각 이하의 속도, 크기 및 두께의 값을 선택하여 vibratome에 경계가 설정 절편.
      참고 : 로브 방향의 종 방향 및 횡 방향 모두 섹션이 허용됩니다.
   9. 제 각각의 로브 완전히. 섹션 완전히 부 시퀀스의 마지막 날에 의해 분리되지 않는 경우 수동 절단 섹션 작은 가위를 사용하여 무료입니다. 부드럽게 발판 섹션을 수집하고 다음 단계까지 얼음에 PBS에 유의하십시오.
      참고 : 생성 된 섹션은 근위 및 원위 폐 지역과 recellularization에 사용할 수있는 두 소스를 모두 포함한다; 그러나, 표면의 대부분은 말초 폐를 포함합니다.
3. 비계 부분의 오염 제거
   1. 마이크로 원심 튜브 (최대 30 섹션 / 튜브)에 PBS에서 350 마이크론 두께의 발판 섹션을 전송하고 클레아로 처리 (PBS에서 90 U / ㎖) (자료의 목록 참조) 12 -에 실온에서 24 시간,회 전자.
   2. 클레아 제 처리 후, 새로운 마이크로 원심 튜브에 집게를 사용하여 회 전자에 실온에서 6 시간 동안 멸균 상태에서 (PBS 200 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신과 25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B) 항균 용액으로 처리 전송 섹션.
      참고 : 공사장 공중 발판은 사용하기 전에 일주까지 4 °에서 C에 대한 항균 솔루션에 저장할 수 있습니다.
   3. 항균 용액으로 오염 제거 단계에 이어, 멸균 조건에서 두 번 PBS와 발판을 씻어 세포를 파종하기 전에 무료로 차별화 미디어 (SFDM)를 혈청에 전송합니다.

2. 내배엽 세포 준비

1. 확실한 내배엽 유도
   1. 2I 조건 ^(13)를 사용하여 피더 무료, 혈청 무료 문화에서 마우스 ESC 라인을 유지한다. 트립신에 의해 부착 만능 문화에서 세포를 제거하여 내배엽 유도를 시작합니다.
   2. 20000의 밀도 SFDM 종자 세포를 재현 탁미디어의 변화없이 세포를 3 일 동안 낮은 부착 플레이트 / ㎖는 EB 형성을 허용합니다.
   3. 사흘 부드럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖로 원뿔형 튜브를 사채를 전송하고 실온에서 3 분 동안 바닥에 수집 할 수 있도록 한 후.
   4. 조심스럽게 대기음 미디어와 추가 신선한 SFDM 미디어 50 NG / ㎖ 티빈 A. 보충
   5. 다시 1에서 낮은 부착 판 위에 종자 세포 : 세 가지 추가 일간 2 밀도와 문화가 결정적인 내배엽 분화를 달성했다.
2. 확실한 내배엽 농축
   1. 하루 6 사채를 수집 트립신 해리와 결합 된 형광 항체 ^(14)를 사용하여 C-KIT와 CXCR4 발현에 대한 레이블을 붙입니다.
   2. 두 마커의 발현을 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 정렬 표지 된 세포를 풍부한 최종 내배엽 인구 ^(15)를 얻었다.

3. R​​ecellularization 설치

1. 공기 - 액체 계면문화 설치
   1. 멸균 집게를 사용 소수성 부동 막 (8 μm의 기공 크기)에 SFDM 각 decellularized 발판 섹션 (단계 1.2.9)를 전송합니다. 비계를 확인 섹션 막에 균일하게 확산됩니다.
   2. 각각 SFDM의 1 또는 0.5 ml의에 우물을 작성하여 6 또는 12 웰 플레이트를 준비합니다. 부드럽게 공기 - 액체 배양 설정을 작성, 멤브레인 미디어의 상단에 떠 있도록 우물에 막을 배치합니다.
2. 3D 비계의 시드
   1. 최종 내배엽 마커 (단계 2.2.2)에 대한 다음 FACS는 혈구를 사용하여 정렬 세포를 계산 SFDM에서 5 분,에 resuspend 400 XG에 스핀 다운. 약 100,000 세포 / 10 μL / 골격을 함유하는 부피를 얻기 위해 세포를 재현 탁.
   2. 직접 단계 3.1.2에서 각각의 준비 섹션에 피펫, 세포의 10 μl를 발판을 recellularize합니다.
   3. 문화의 모든 48 시간을 SFDM 미디어를 교체합니다. 약간의 경사에 접시를 들고가 기존의 미디어를 대기음문화를 방해 방지 할 수 있습니다. 천천히 떠있는 막으로 가라 앉는 것을 방지하기 위해 잘의 측면을 따라 문화에 신선한 SFDM를 추가합니다.
   4. 성숙한기도 상피 세포에 접종 세포의 분화를 달성하기까지 21 일 동안 공기 - 액체 문화를 유지한다.
      주 : Recellularized 절 세포 배양 물 ⁽¹⁶⁾ 중 임의의 시점에서 조직 면역 염색법 (IF) 현미경을 위해 처리 될 수있다.

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 최종 내배엽의 강력한 차별화 상피 세포가 decellularized 폐 비계 부분에 씨앗을 품고 세포의 확장 된 문화를 사용하여 달성 될 수기도 성숙한합니다. decellularized 지지체는 (1) 숙주 세포가 완전히 제거되도록하는 것을 특징으로한다, (2) 세포 외 매트릭스 단백질 분화 지지체를 사용하기 전에 보존하는 것이 권장된다. 도 1a에 도시 된 바와 같이 탈세 포화는 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 조직 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 고배율 주사 전자 현미경 (SEM) 비계의 분석은 숙주 세포 그대로 매트릭스 구조의 유무를 확인한다. 매트릭스 단백질 및 면역 인장 시험에 의한 잔존 지지체의 추가 특성화 preservat을 위해 수행 될 수있다탈세 포화 (16) 다음 ECM의 이온.

도 2a에 도시 된 바와 같이 전지 집합체 (사채)의 형성 여섯 일 결과 SFDM 매체는 ESC에 비 접착 배양. 최종 내배엽 유도에서 처리 결과를 티빈의 세 가지 일. 최종 내배엽에 ESC의 계보 제한이 상향 조절 및 내배엽 계통 관련 유전자 및 단백질 17의 발현에 의해 확인 될 수 있고, 형태 학적으로 주장 할 수 없습니다. 내배엽 유도 효율이 사용 ESC 라인에 따라 50-70% 내지. 실험은 마우스 ESC 라인에서 수행되었다 : R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (을 DsRed -MST), 129 / 올라 (BRY-GFP / Foxa2-hCD4)이 원고에 예시 된 모든 데이터가 사용되는 동안 R1 셀 선. 이중 양성 CXCR4 + / C-KIT + 최종 내배엽 인구는도 2b에 도시 된 바와 같이, 정렬 시딩3D 폐 발판 위에, 그리고 SFDM 공기 - 액체 인터페이스에서 최대 21 일 동안 배양 하였다. 정렬하고 조직을 제한도 2c에 도시 된 바와 같이 차별화가 이기종 일에서 정렬되지 않은 세포의 배양과 6 EBS을 (를) 달성으로 최종 내배엽에 대해 풍부하게하는 것이 중요하다. 비계에 정렬 된 세포에 의해 형성 구조는 그림 2C-D에 도시 된 바와 같이 폐 (배아 일 13.5)를 개발 연상시킨다. 우리의 경험에 의하면, 10 만 분류 세포 / 지지체의 파종 밀도가 가장 발판 다시 채우기를 산출했다.

폐 혈통으로 차별화 비계 문화 다음 칠일 이른로 관찰된다. NKX2-1 및 SOX2 양성기도 상피 전구 세포는도 3a에 도시 된 바와 같이, IF 촛점 분석을 이용하여 검출된다. SOX2 긍정적 인, NKX2-1 음성 세포는 폐 리튬로 분화하지 않은 것 만능 내배엽 세포는neage. 더 이상 문화 이들 세포는 NKX2-1을 표현하거나 미세 환경에서 적절한 지원없이 세포 사멸을 받아야 시작할 수 있습니다. 21 일 배양 분석도 3b에 도시 된 바와 같이 + TUBB4A 섬모 세포 SCGB1A1 클럽 + 세포 및 TRP63 + / + KRT5 기저 세포를 함유하는 성숙한기도 상피 인구 드러나면. 21 일 문화의 표면의 SEM 분석은 마우스기도에 줄기 세포 유래 문화의 형태 학적 유사성을 보여준다.

(16) 전술 한 바와 같이 최종 내배엽의 시드와 동일한 조건에서 배양 할 때 두 격리 된 기질 단백질 (콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌) 및 decellularized 쥐의 신장 골격은 폐 계통의 분화를 촉진 할 수 없습니다. 이것은 폐 유래의 골격에 의해 생성 된 3 차원 미세 환경이 seede의 폐 계통의 분화를 촉진 할 수있는 능력의 신장 유래 발판 구별 있음을 보여줍니다D 내배엽 세포.

그림 1. 탈세 포화 기술은 세포 성분을 제거하고 ECM을 유지합니다. (A) H & E (상단 패널)와 DAPI 탈세 포화 다음 핵의 부재를 보여주는 자연 decellularized 폐 조직의 (하판) 염색. 오른쪽 패널은 최적의 탈세 포화없이 폐에서 조직 섹션의 예를 보여줍니다. 화살촉은 recellularization 전에 기술을 최적화의 중요성을 강조, 불완전한 탈세 포화에 발판에 남아있는 핵을 보여줍니다. 스케일 바는 25 μm의 =. 세포와 decellularized 비계에 매트릭스 아키텍처의 보존의 부재를 보여주는 자연 decellularized 폐의 (B) SEM 이미지. 스케일 바 = 10 μm의. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 2. 정렬 된 최적의 recellularization에 결정적인 내배엽 결과를 ESC 유래. 최종 내배엽 분화를 촉진하는 치료를 티빈의 삼일 다음 (A) 6 일 배아 체 (사채). (나) 사채는 최종 내배엽 인구를 분리하는 이중 표면 마커 CXCR4의 발현 및 C-KIT에 대한 FACS으로 분류되어 있습니다. 이 인구는 decellularized 인공 지지체에 파종한다. 7 일 문화의 날 (21)에 recellularized 비계의 (은 C) H & E 염색. 왼쪽 패널은 정렬 된 셀 시드 다음,기도와 같은 구조를 구성 나타내고, 오른쪽 패널은 사전 recellularization에 세포 정렬의 중요성을 강조 발판에 무질서, 높은 증식 정렬되지 않은 세포를 나타냅니다. 규모바 = 30 μm의. 배아 일 13.5 마우스 폐의 (D) H & E 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자연 폐 골격에 최종 내배엽 그림 3. 확장 된 문화는 상피 세포를기도하는 차별화를 지시한다. (A) 근위 폐 전구 세포 (NKX2-1 + / SOX2의 +)는 decellularized 지지체에 배양 7 일 다음 검출된다. 스케일 바는 15 μm의 =. (B) 왼쪽 그림 쇼 구조물의 기부 측에 기저막 단백질 라미닌으로 늘어선 상피 세포 (CDH1 +) 구조 pseudostratified 성숙. 섬 모세포 (TUBB4A의 +), CLU 완료 센터 및 우측 영상 쇼 성숙한기도 상피B 세포 (SCGB1A1의 +)와 기저 세포 (KRT5 + / TRP63 +). 왼쪽 이미지 스케일 바 = 30 μm의; 중앙과 오른쪽 이미지 스케일 바 = 15 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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