Method Article

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식에 혁명을 일으키고 있습니다. 이 보고서에서는 보다 일관되고 저렴한 결과를 제공하는 원래의 CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) 프로토콜의 수정 사항에 대해 설명합니다.

Abstract

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전통적으로 조직 시각화는 관심 조직을 연속적으로 절편하고 이미지화하여 각 조직 섹션을 고유한 비선형 변형에 노출시켜 중추신경계(CNS)의 세포 형태, 분포 및 연결성을 평가하는 능력을 크게 저해했습니다. 그러나 광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식을 변화시키고 있습니다. 이러한 접근 방식을 통해 온전한 장기 준비를 깊이 조사할 수 있으며, 건강과 질병에서 조직의 구조적 조직에 대한 엄청난 통찰력을 얻을 수 있습니다. CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel)와 같은 기술은 광 산란 지질이 자유롭게 확산될 수 있도록 하는 동시에 중요한 생체 분자에 결합하는 매트릭스를 제공함으로써 이러한 목표를 달성합니다. 지질 제거 후 굴절률 일치를 통해 조직을 투명하게 만들고 3차원(3D)으로 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 원래 CLARITY 프로토콜에 사용된 전기영동 조직 투명화(ETC)는 성공적으로 구현하기 어려울 수 있으며 독점적인 굴절률 정합 솔루션을 사용하면 이 기술을 일상적으로 사용하는 데 비용이 많이 듭니다. 이 보고서는 조직 무결성 향상을 위한 수동 CLARITY와 이전에 설명된 굴절률 정합 솔루션인 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 결합한 간단하고 저렴한 광학 투명화 프로토콜의 구현을 보여줍니다.

Introduction

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완전한 신경 해부학적 구조를 이미지화하는 능력은 건강과 질병에서 뇌를 이해하는 데 매우 중요합니다. 전통적으로 3D 이미징은 축 해상도를 제공하고 깊은 해부학적 구조를 시각화하기 위해 조직 절편이 필요했습니다. 이 접근 방식은 고해상도 데이터 세트를 생성할 수 있지만 정교한 이미지 재구성 기술이 필요하고 노동 집약적입니다. 그 결과, 소량의 조직1-3을 이미징하는 것으로 제한되었습니다. 반면에 광학 절편은 형광 표지된 조직의 고해상도 3D 이미지를 만드는 데 매우 적합합니다. 광학 절편은 본질적으로 3차원이기 때문에 3D 이미지 볼륨을 생성하기 위해 광범위한 계산이 필요하지 않습니다. 그러나 빛의 산란과 조직 불투명도는 조직을 광학적으로 절단할 수 있는 깊이를 제한합니다. 이미징 깊이는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 약 150μm로 제한되며 이광자 여기 현미경4-8을 사용할 경우 800μm 미만으로 제한됩니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 최근 몇 가지 광학 투명화 기술이 개발되었으며 온전한 조직의 깊은 현미경 이미징을 허용하기 위해 더욱 개선되었습니다. 벤질 알코올과 벤질 벤조에이트(BABB)를 사용하여 고정된 조직을 투명하게 만드는 것은 가장 초기의 접근법 중 하나였다9. 그러....

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Protocol

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모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었다. THY1-YFP, PLP-EGFP와 PV-TdTomato 마우스를 실험에 이용했지만, 형광 단백질을 발현하는 마우스를 성공적으로 삭제되고 묘화 될 수있다.

1. 조직 준비

주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA) 및 아크릴 아미드는 독성 및 자극한다. 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호) 이러한 시약을 이용하여 실험을 수행합니다.

  1. (- 3 분 ~ 2) 호흡이 중단 될 때까지 이소 플루 란의 ~ 1 ml의 안락사 챔버에서 동물을 희생.
  2. (- 10 분 5) 혈액이 조직에서 제거 될 때까지 ~ ​​5ml를 설정 연동 펌프를 사용하여 / 분 intracardially 4 ° C에서 관류 액 (표 1)와 마우스를 관류한다.
  3. 정착액 솔루션에 관류 변경 (표 1)(- 10 분 5) 4 ° C에서 목과 꼬리는 크게 보강 할 때까지.
  4. 관류를 종료하고 동물 목을 벨. 조심스럽게 제 두개골 주변 결합 조직을 제거한 후, 두개골의 복부 표면으로부터 뼈를 분리 및

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Results

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뇌의 구조적 조직을 시각화하는 형태와 연결이 건강과 질병에서 뇌 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 광학 청소 기술은 우리가 응집력 형태와 연결을 연구 할 수 있도록, 손상 조직의 3 차원 이미지 세포 인구에 가능합니다.

세포가 뇌의 신경 연결의 복잡한 패턴을 떨어져 애타게 하나를 허용의 하위 집단에 대한 특이 적 프로모터에 의해 구동 형광 단백질을 발현 마우스. 이러한 생쥐 뇌 (도 2a 및 b) 프로젝션 대뇌 피질 및 해마에있는 신경 세포뿐만 아니라 다른 구조의 서브셋에 YFP 표현 때문에 THY1-YFP 트랜스 제닉 마우스는 광 지우기 문헌에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, YFP + 대뇌 피질의 계층 V 뉴런은의에서 피질 기관을 통해 프로젝트대뇌 피질의 뉴런 (15)의 척수.......

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Discussion

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하이드로 겔 포함 된 조직 (수동 CLARITY)의 수동 청소 조직의 큰 조각을 삭제하기위한 간단하고 저렴한 방법이다. 이러한 접근 방식은 전용 설비를 필요로하지 않고, 용이하게 온도 제어 진탕 기에서 수행 될 수있다. 몇 주의 기간 동안, 같은 전체 뇌 또는 척수로도 큰, 매우 유수 조직, 투명하고 현미경에 적합하게 될 것이다. 이 보고서는 CNS 조직의 청산에 초점을 맞추고있다하더라도, 수동 CLARITY 모든 조직에 적용 할 수 있습니다.

광학 정화 기술의 상대적 강점과 약점이 문헌 13,17,22에서 이전에 논의 된,하지만 가장 명확하게 (23)에 배치됩니다. 샘플 다수가 동시에 삭제 및 재현성이 매우 중요하다되고있는 경우 수동 CLARITY 실험에 적합합니다. 티슈는 m을 용이하게하기 위해, 하이드로 겔의 사용은 부가적인 지원을 제공 할ultiple는 조직의 프로빙. 이 보고서에서, 분자량이 작은 염료 DAP.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 넉넉한 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) 부여 1R01NS086981과 콘래드 N. 힐튼 재단의 보건 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 공 초점 현미경과의 귀중한 도움 박사 로랑 Bentolila 박사 마태 복음 Schibler 감사합니다. 우리는 CLARITY 포럼 (http://forum.claritytechniques.org)에 기여한 것들 감사합니다. 우리는 특히이 매혹적인 기술을 가르치는 그의 연구실을 개방 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. 저자는 뇌 매핑 의료 연구 조직, 뇌 매핑 지원 재단, 피어슨 - 난봉꾼 재단, Ahmanson 재단, 캐피탈 그룹 회사 자선 재단, 윌리엄 M. 린다 R. Dietel 자선 기금, 그리고 노스 스타 펀드의 관대 한 지원에 감사 . 이 책에서보고 된 연구는 부분적으로 연구 자원을위한 국립 센터와 국가의 이사의 사무실에 의해 지원되었다보너스 번호 C06RR012169, C06RR015431 및 S10OD011939에서 건강의 알 연구소. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x 인산염 완충 식염수(PBS)FisherBP399-1완충액
32% 파라포름알데히드(PFA)전자 현미경 과학15714-5관류 및 하이드로겔
2,2'-티오디에탄올(TDE)시그마-알드리치166782-500G굴절률 정합 용액
40% 아크릴아미드Bio-Rad161-0140하이드로겔
2% 비스-아크릴아미드Bio-Rad161-0142하이드로겔
VA-044 개시제Wako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044하이드로겔
붕산시그마-알드리치B7901클리어링 버퍼
, 도데실황산나트륨(SDS),피셔BP166-5클리어링 버퍼
, 수산화나트륨, 피셔55255-1버퍼,
아지드화나트륨, 시그마-알드리치52002-100G방부제
, 트리톤 X-100시그마-알드리치X100-500G완충액
HeparinSigma-AldrichH3393-50KU관류
질산나트륨FisherBP360-500관류
DAPI분자 프로브D1306핵 염색
99.9% 이소플루란Phoenix57319-559-06마취제
Hydrocholoric acidFisherA1445-500완충액
유리 바닥 접시WillcoHBSB-5040Willco 접시
재사용 가능한 접착제Bostick371351Blu-Tack
실리콘 엘라스토머세계 정밀 기기KWIK-CASTKwik-Cast
보푸라기 없는 닦음Kimberly-Clark34120KimWipe
마우스 뇌 매트릭스RobozSA-2175절편 조직
매트릭스 블레이드RobozRS-9887절편 조직
연동 펌프Cole-Parmer77122-24pefusion
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경LeicaSP5현미경
이미징 소프트웨어LeicaLAS AF현미경
, , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.

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