교모세포종 다형성의 환자 유래 이종이식편은 3D 인간 바이오겔 배양 시스템을 사용하여 살아있는 미세종양으로 소형화할 수 있습니다. 이 생체 내 유사 3D 종양 분석은 키노믹 분석을 포함한 약물 반응 검사 및 분자 프로파일링에 적합합니다.
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방법 논문
Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성
이 논문에서
요약
초록
암 모델링을 위해 환자 유래 이종 이식편을 사용하는 것은 암 생물학 및 약물 반응성에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 노동 집약적입니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 많은 연구 그룹이 암세포의 스페로이드 배양으로 눈을 돌렸습니다. 종양 스페로이드 또는 응집체는 유용하기는 하지만, in vivo에서 발견되는 세포-기질 상호작용을 복제하지 않습니다. 따라서 세포외 매트릭스 스캐폴드를 활용하는 3차원(3D) 배양 접근 방식은 조사를 위한 보다 현실적인 모델 시스템을 제공합니다. 피하 또는 두개내 이종이식편에서 시작하여 종양 조직은 암 줄기세포 신경구와 유사한 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 이러한 세포는 인간 유래 세포외 기질인 3D 인간 바이오겔에 삽입되어 많은 수의 미세종양을 생성합니다. 흥미롭게도 미세종양은 높은 생존력으로 약 한 달 동안 배양할 수 있으며 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)와 같은 표준 세포독성 분석을 사용한 약물 반응 검사 및 Calcein-AM을 사용한 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있습니다. 또한 면역조직화학을 통해 분석하거나 배열 기반 고처리량 키놈 프로파일링과 같은 분자 프로파일링을 위해 수확할 수 있으며, 이에 대해서도 자세히 설명되어 있습니다. 따라서 3D 미세종양은 기존 접근 방식보다 생체 내 종양 생물학을 더 밀접하게 복제할 수 있는 다목적 고처리량 모델 시스템을 나타냅니다.
서론
가장 일반적인 기본 두개 내 악성 뇌 종양은 등급 III 성상 세포종과 등급 IV의 아교 모세포종의 홍반 (아교 모세포종 또는 GBM)입니다. 미국 1-3 GBM 현재 치료와 15개월 -이 종양은 12 사이의 평균 일 년 생존율 가난한 예후를 제공합니다. Multimodality 치료는 테모 졸로 마이드 (TMZ) 및 키나제 타겟 에이전트를 포함한 수술, 방사선, 화학 요법 등이 있습니다. 키나제 신호는 자주 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)의 증가 신호 증가 포스파티딜 이노시톨-3 키나아제 (PI3K)과의 증폭과 종양의 하위 집합 또는 활성화 돌연변이를 포함, GBM에서 조절 곤란된다 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)뿐만 아니라 기타 키나아제 중심 경로를 통해 혈관 신생 4-6 시그널링을 지원 종양. 생체 외 및 생체 내 모델은 자주이 대표 변경을 잃을 현재 7. 또한, 유전 적 프로파일 유전 및 후생 유전 학적 변화는 항상 제 타겟팅 가장 키나아제 직접 작용 단백질 활성의 수준에서의 변화를 예측할 수없고, 동작의 다른 메커니즘 요법 여기서 작용할 수 있다는 사실을 반영 예상 이익을 제공하지 간접적으로.
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프로토콜
참고 : 모든 이종 이식 치료 평가는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 아교 모세포종에 대한 동 소성 종양 모델을 사용하여 수행 하였다.
환자 유래 GBM 이종 이식 세포의 1. 분리
- 시약의 제조
- 5 ㎎ / ㎖ 멸균 필터의 농도로 멸균 콜라게나 제 I을 다시 구성한다. -20 ℃에서 1 mL의 분취 량의 쇼핑몰 (최종 농도가 100 ㎖의 효소 용액을 50 ㎍ / ㎖의 경우).
- 이 용액에 100 μg의 표피 성장 인자 (EGF)에 녹여 멸균 인산 완충 식염수 (PBS). 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
- 이 용액에 100 μg의 FGF-β 멸균 PBS를 녹여. 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
- 로 Neurobasal 메드의 다음 한 500 ml의 병 추가아이오와 (NBM)이 완료 NBM을 준비하는 10 ML의 B-27 보충 비타민 A하지 않고, 5 ml의 N2 보충, 100 μL의 EGF, 100 ㎕의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) - 기....
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결과
우리는 3D를 Biogel 배양 시스템은 여러 종류의 세포 장기 성장 및 기능을 지원하는 것을 보여준다. 이 공동 프로젝트에서, 환자 유래 GBM의 xenolines (PDX)는 microtumors의 수백을 생산하는 데 사용됩니다. 해리 세포 (3 × 10 5) 또는 neurosphere를 (40-50)는를 Biogel 비즈 (2mm)에 포함 된 빠른 겔화 후 그들은 NB-미디어 작성 사용자 정의 생물 반응기에서 배양한다. 세포 생존 능력 (칼 세인-AM), 성장 프로파일 (MTT), 및 kinomic 활동 배열 기반의 분석은 측정 하였다. PDX의 microtumors은> 삼주에 대한 다세포 조직과 높은 생존 능력 (> 80 %)를 유지했다. 우리는이 생체 -like 생물학은 3D 셀 매트릭스 구조의 유지 보수 (2D 또는 회전 타원체 문화 불가능)로 인해 믿습니다. 또한 3D 종양 가능성으로 인해 콜라겐 I .......
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토론
프로토콜 내에서 중요한 단계는 주로 생성뿐만 아니라 약물 투여 및 유지 microtumor에 관한 것이다. microtumor 비즈 깨지기 쉽게 찢어 때문에, 극도의주의는 분석 및 유지 보수의 발달 단계에 모두 필요합니다. 에러가 이러한 공정 중 하나가 발생했을 경우, 실험 해석 확장하거나 불필요한 반복 실험 데이터 또는 심지어 배제를 초래 손상 될 수있다.
수정 및 문제 해결, 특히 microtumor 개발 과정은 microtumor 구슬을 사용하는 사용자 소수성 툴의 설계 및 제작을 포함했다. 이 도구는 microtumors의 더 빠르고 정확한 생산이 가능합니다. 또한 microtumors 유지 작은 변형 배지를 바꾸고 세포를 투여하는 과정을 가속화하는 것을 도왔다. 이러한 변형 중 일부는 포함하지만, 다 채널을 이용하여, 이에 한정되지 않은전자 피펫으로 제거하고 96- 웰 플레이트로부터 배지를 대체하는 새로운 약물 투여 용액을 미리 혼합하고, 해당 2 mL를 96- 웰 .......
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공개 사항
R.S.와 R.S.는 Vivo Biosciences의 직원입니다. JCA는 UAB Kinome Core에서 부분적으로 자금을 지원합니다.
감사의 글
, 뇌 종양 SPORE 상 (PD : GY 길레스피, P20CA 151129-03)과 SBIR 계약 (PI : R. 싱, N43CO-2013-00026) : NIH R21 부여 (C. Willey, CA185712-01 PI)에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콜라겐 분해 효소-I | 시그마-알드리치 | CO130 | |
| 트립신 EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 보충제 | Life Technologies | 17502-048 | 1x 최종 농도 |
| B-27 보충제 (비타민 A 제외 | Life Technologies | 12587-010 | 1x 최종 농도 |
| 재조합 인간 FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 10 ng / ml 최종 농도 | |
| 재조합 인간 EGF | Life Technologies | PGH0315 10ng/ml 최종 농도 | |
| L-글루타민 | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2mM 최종 농도 |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 &마이크로; g/ml 최종 농도 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 오메가 사이언티픽 | PS-20 | 100 U/ml 페니실린 G, 100 &마이크로; g/ml 스트렙토마이신 최종 농도 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml 최종 농도 |
| MTT | Life Technologies | M6494 | PBS에서 5 mg/ml로 준비되고 멸균 여과, 웰 SDS에서 1 mg/ml |
| Fisher | BP166 | , 0.01 에서 10%로 준비됨; M HCl, 5% in well | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, 0.01 SDS가 있는 M, 웰 |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 5mM DMSO 재고에서 1mM, 2 &마이크로; PBS 염색 용액의 M, 1 &마이크로; M in well |
| Halt' (M) s 단백질 인산가수분해효소 억제제 칵테일 | 피어스 써모사이언티픽 | 78420 | 1:100 비율, MPER |
| Halt의 단백질 프로테아제 억제제 | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 비율 in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds | |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/ | Mg Lonza | 17-517Q | , MiliQ 초순수로 1배로 희석, 멸균 여과(세포 배양용) |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(Ca/Mg | Corning, Cellgro Mediatech | 20-030-CV | MiliQ 초순수로 1배로 희석, 사전 고정 세척용) |
| 10% 중성 완충 포르말린 | 프로토콜 | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK 키나아제 완충액 | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x PK 버퍼 스톡 2.7 ml dH2O, PTK 시약 키트의 카탈로그 번호 |
| ATP | PamGene | 36000 | PTK 시약 키트의 카탈로그 번호 |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | PTK 시약 키트의 카탈로그 번호 |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 튜브(10x BSA) | Ppk 시약 키트 | ||
| 의 PamGene 36000 카탈로그 번호Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | STK 시약 키트용 카탈로그 번호 |
| STK Primary Antibody Mix(DMAB 튜브) | PamGene | 32205 | STK 시약 키트용 카탈로그 번호 |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 튜브(100x BSA) | PamGene | 32205 | STK 시약 키트용 카탈로그 번호 |
| STK 항체 버퍼 | PamGene | 32205 | STK 시약 키트용 카탈로그 번호 |
| Equipment | |||
| #11 블레이드, 멸균 | Fisher | 3120030 | |
| #3 메스 핸들, 멸균 | Fisher | 08-913-5 | |
| 100mm 유리 페트리 접시 | Fisher | 08-748D | |
| 반곡선 펜치 | Fisher | 12-460-318 | |
| 트립시나이징 플라스크 | Fisher | 10-042-12B | |
| 자기 스티러 | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" 스티어 바 | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D 셀 여과기 | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml 원심분리기 튜브 | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 키노믹 분석 소프트웨어 | PamGene | ||
| Evolve Kinase 분석 소프트웨어 | PamGene | ||
| UpKin App 소프트웨어(업스트림 키나아제 예측) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| 회전식 세포 배양 시스템(RCCS) | 10ml 일회용 HARV가 있는 | Synthecon | RCCS-D |
참고문헌
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
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재인쇄 및 허가
