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방법 논문

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

8.4K 조회수

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DOI:

10.3791/54026

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2016년 6월 9일

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1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

이 논문에서

요약

교모세포종 다형성의 환자 유래 이종이식편은 3D 인간 바이오겔 배양 시스템을 사용하여 살아있는 미세종양으로 소형화할 수 있습니다. 이 생체 내 유사 3D 종양 분석은 키노믹 분석을 포함한 약물 반응 검사 및 분자 프로파일링에 적합합니다.

초록

암 모델링을 위해 환자 유래 이종 이식편을 사용하는 것은 암 생물학 및 약물 반응성에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 노동 집약적입니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 많은 연구 그룹이 암세포의 스페로이드 배양으로 눈을 돌렸습니다. 종양 스페로이드 또는 응집체는 유용하기는 하지만, in vivo에서 발견되는 세포-기질 상호작용을 복제하지 않습니다. 따라서 세포외 매트릭스 스캐폴드를 활용하는 3차원(3D) 배양 접근 방식은 조사를 위한 보다 현실적인 모델 시스템을 제공합니다. 피하 또는 두개내 이종이식편에서 시작하여 종양 조직은 암 줄기세포 신경구와 유사한 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 이러한 세포는 인간 유래 세포외 기질인 3D 인간 바이오겔에 삽입되어 많은 수의 미세종양을 생성합니다. 흥미롭게도 미세종양은 높은 생존력으로 약 한 달 동안 배양할 수 있으며 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)와 같은 표준 세포독성 분석을 사용한 약물 반응 검사 및 Calcein-AM을 사용한 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있습니다. 또한 면역조직화학을 통해 분석하거나 배열 기반 고처리량 키놈 프로파일링과 같은 분자 프로파일링을 위해 수확할 수 있으며, 이에 대해서도 자세히 설명되어 있습니다. 따라서 3D 미세종양은 기존 접근 방식보다 생체 내 종양 생물학을 더 밀접하게 복제할 수 있는 다목적 고처리량 모델 시스템을 나타냅니다.

서론

가장 일반적인 기본 두개 내 악성 뇌 종양은 등급 III 성상 세포종과 등급 IV의 아교 모세포종의 홍반 (아교 모세포종 또는 GBM)입니다. 미국 1-3 GBM 현재 치료와 15개월 -이 종양은 12 사이의 평균 일 년 생존율 가난한 예후를 제공합니다. Multimodality 치료는 테모 졸로 마이드 (TMZ) 및 키나제 타겟 에이전트를 포함한 수술, 방사선, 화학 요법 등이 있습니다. 키나제 신호는 자주 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)의 증가 신호 증가 포스파티딜 이노시톨-3 키나아제 (PI3K)과의 증폭과 종양의 하위 집합 또는 활성화 돌연변이를 포함, GBM에서 조절 곤란된다 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)뿐만 아니라 기타 키나아제 중심 경로를 통해 혈관 신생 4-6 시그널링을 지원 종양. 생체 외 및 생체 내 모델은 자주이 대표 변경을 잃을 현재 7. 또한, 유전 적 프로파일 유전 및 후생 유전 학적 변화는 항상 제 타겟팅 가장 키나아제 직접 작용 단백질 활성의 수준에서의 변화를 예측할 수없고, 동작의 다른 메커니즘 요법 여기서 작용할 수 있다는 사실을 반영 예상 이익을 제공하지 간접적으로.

무한히 계대 수있는 전통적인 불멸화 세포주 긴 인한 유지 및 재현성의 용이성에 약물 시험을위한 표준이었다. 그러나이 모델은 빠르게 원래의 종양에서 크게 차이가 세포 성장을 위해 선택하는 고 영양 (인공) 성장 환경에서 겪고있다. 이와 같이, 환자에 존재하는 등의보다 복잡한 종양 생물학적 시스템을 반영보다 현실적인 모델 시스템을 개발하는데 상당한 관심이 있었다. 종양 이종 이식 생쥐에서 자란 차 종양 ( "xenoline,"환자 유래의 이종 이식 또는 PDX) 있습니다 provi에서 직접 개발이들은보다 확실 임상 적 성공을 예측. 8 이상의 반사 생물학 불구 생각대로 데 특히 암 치료제의 설정에서 더 반사 모델 시스템은, 이러한 모델은 고가이며 수립하고 유지하기 어렵다. 또한, 이들은 높은 처리량 연구 의무가 없다. 필요성이 더 더 정확하게 유전자 마커를 대리하지, 기본 종양에서 분자 변화를 반영하고, 프로파일 및 키나제 활성을 직접 측정을 사용하여 이러한 모델을 테스트 생물학적 모델을 개발하기 위해 분명하다.

이 아니라 2 차원 단층 배양과는 달리, 3 차원 또는 다세포 분석 모델보다 생리 관련 엔드 9-11을 제공 할 수 있다고 인식된다. 일반적인 3D 배양 기질 코팅 미세 전달체 셀 타원체 형성을 수반 접근한다. 종양 타원체는 스피너 플라스크, PHEMA 플레이트를 사용하여 드롭 기술을 걸려 휴대 집계를 통해 생성 할 수 있습니다. t에 대한 제한 사항HESE 방법은 다음과 같습니다 : 일부 세포가 혼합 된 세포 유형으로 안정된 회전 타원체, 변동 성장과 도전을 형성 할 수 없음을. 또한, 많은 합성 (하이드로 겔 폴리머) 및 Engelbreth가-홀름 - 떼 행렬이 3D 문화를 위해 개발 된 마우스 육종에서 (EHS) 행렬, 소 콜라겐)이 12 ~ 14을 연구하는 동물 유래. 마우스 EHS 행렬은 광범위하게 사용되고 있지만, 시험 관내 및 생체 내 (15)에 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져있다.

3D 종양 생물학을 복제하기 위해, 인간 biomatrix 시스템 박사 라즈 싱 등. (16)에 의해 개발되었다. 천연 성장 인자없이 인체를 Biogel 여러 종류의 세포의 장기 배양을 지원 3D 배양 지지체 (비드, 디스크)를 허용한다. 3D 인간의를 Biogel 문화 디자인의 일련의 종양 성장, 접착, 혈관 신생과 침략 속성을 공부 설정됩니다. 장점과 인간의를 Biogel의 특성을 일반에 비해마우스 EHS 겔은 표 1 및 표 2에 요약되어있다.

출처: 인간 Amnions (풀링 조직)
병원체가없는, IRB 면제는 / 승인
ECM 자연 : 비 변성를 Biogel (GLP-생산)
키
구성 요소 : 		COL-I (38 %), 라미닌 (22 %), COL-IV (20 %), COL-III (7 %) 및 ​​Entactin HSPG (<3 %)
GF-무료 : 탐지 EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (비 혈관, 비 독성)

표 1 : 일반 EHS 젤에 비해 인간의 등록 정보를 Biogel.

인간의를 Biogel EHS 젤
자연 인간의 행렬 재구성 마우스 행렬
제어 된 세포 증식 및 분화 세포의 성장 및 분화를 촉진 할 수
생리적 유전자 발현 가변 유전자 발현
3D 조직 같은 문화 모델 플레이트 기반 문화 모델

표 2 : 일반 EHS 젤에 비해 인간를 Biogel 장점.

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프로토콜

참고 : 모든 이종 이식 치료 평가는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 아교 모세포종에 대한 동 소성 종양 모델을 사용하여 수행 하였다.

환자 유래 GBM 이종 이식 세포의 1. 분리

  1. 시약의 제조
    1. 5 ㎎ / ㎖ 멸균 필터의 농도로 멸균 콜라게나 제 I을 다시 구성한다. -20 ℃에서 1 mL의 분취 량의 쇼핑몰 (최종 농도가 100 ㎖의 효소 용액을 50 ㎍ / ㎖의 경우).
    2. 이 용액에 100 μg의 표피 성장 인자 (EGF)에 녹여 멸균 인산 완충 식염수 (PBS). 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
    3. 이 용액에 100 μg의 FGF-β 멸균 PBS를 녹여. 100 μL (5 μg의 / 100 μL) 10 ng를 / ml의 최종 농도 -20 ° C에서 분취에 보관할 것.
    4. 로 Neurobasal 메드의 다음 한 500 ml의 병 추가아이오와 (NBM)이 완료 NBM을 준비하는 10 ML의 B-27 보충 비타민 A하지 않고, 5 ml의 N2 보충, 100 μL의 EGF, 100 ㎕의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) - 기본, 5 ml의 암포 테리 신 B, 0.5 ml의 겐타 마이신, 5 ml의 L 글루타민.
    5. 조합하여 신선한 효소 용액을 제조 하였다 : 98.5 ml의 PBS를 1 ㎖의 콜라게나 제 1, 0.5 ml의 10 배 트립신 / EDTA와 0.22 μm의 기공 필터를 통하여 여과하여 멸균.
    6. 준비하거나 소량의 멸균 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 칼슘 또는 마그네슘이없는 7 % 소 태아 혈청 (FBS), 1X PBS와 함께 / F12 세포 배양 배지를 얻었다.
  2. 종양 세분화
    참고 : 이전에 만져서 알 수있는 종양 덩어리에서에 오른쪽 측면에서 종양 세포를 주입하고 사용할 수있는 무 흉선 뉴 / 뉴 마우스는이 절차가 필요합니다. 여기에 표시된 예에서, 우리는 환자 유래의 이종 이식 GBM 세포, JX10과 JX12 (17)을 사용했다.
    1. 2 % 클로르헥시딘을 분사하여 작업 영역을 소독하고 작업 영역 재치를 설정일회용 척, 핀셋, 메스, 유리 페트리 접시, 효소 용액, PBS 및 클로르헥시딘 (그림 2A 참조)을 포함하여 시간에 필요한 악기 / 공급하고 있습니다.
    2. 플랭크 종양을 품고 마우스 / 쥐를 안락사. 30 %의 이산화탄소를 이용하여 CO2를 20 % / min의 변위 율을 목표. 마우스가 호흡 정지를 표시 한 후, 약 1 분 (일반적으로 3 분 총)에 대한 CO 2 흐름을 유지한다. 마우스를 챔버로부터 제거하고 경부 탈구 보조 안락사 확인으로 수행된다. 피부 소독 3 % 클로르헥시딘과 동물을 분무.
    3. 마우스가 정상 채, 수 있도록 반원형 피부 절개 ~ 종양 질량 두개골 시작하여 주위에 마우스의 뱃속으로 절개와 # 11 블레이드 멸균 일회용 메스를 사용하여 종양 덩어리 (측면 이식 종양)에서 1.5 cm 꼬리 끝.
    4. 절개의 꼬리 끝에 부드러운 견인과 손가락을 사용하여 종양 덩어리를 통해 피부를 반영하고 피부에 밀어종양을 터치하지 않고 최선 액세스 할 수있는 종양을 상승시킬 표면 (그림 2B 참조).
    5. 부드럽게 복막 벽에서 피부에서 무료로 종양 덩어리 (그림 2C 참조) 집게와 무딘 절개를 사용합니다.
    6. 멸균 유리 페트리 접시 제대로 시체를 버리고 옆이 악기를 배치 (닦지 동안 파괴 방지하기 위해 플라스틱 접시를 사용하지 마십시오)에 집게로 전송 종양 덩어리.
    7. 멸균 악기의 새로운 세트를 사용하여 괴사 조직 및 멤브레인 호스트 결합 조직 취재 종양의 종양 조직을 괴사 조직을 제거하기 위해 (# 11 블레이드, 반 곡선 집게와 메스).
    8. 교반 막대와 멸균 배출-trypsinizing 플라스크에 15 ml의 효소 솔루션을 배치하고 후드에서 천천히 저어 준다.
    9. (부어 또는 PBS로 씻어하기 위해 주사기를 사용할 수있다)을 초과 혈액을 제거하고 멸균 PBS로 5 회 - 멸균 유리 페트리 접시에서 수확 종양 3 씻는다. 부드럽게 요리와 피펫을 기울거나 세척 물질을 대기음. 말하다 Finely이 # 11 메스 블레이드를 사용하여 (그림 2D 참조).
    10. 3 회 - 부드럽게 위아래로 다진 종양과 피펫에 2 효소 용액의 14 ML을 추가합니다. 전송 혼합물 플라스크를 trypsinizing 통풍과 20 분 동안 천천히 교반합니다. 단계 1.2.11의 트립신을 중화하기 위해 각 1.5 ML의 FBS를 첨가하여 5 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 준비한다.
    11. 20 분 후, trypsinizing 플라스크에서 세포 용액을 14 ml의를 수집하고 FBS 하나의 튜브에 추가 할 수 있습니다. 플라스크 교반을 계속하려면 14 ml의 신선한 효소 솔루션을 추가합니다.
    12. 원심 분리기는 실온에서 8 분 동안 150 XG에 세포를 수집하고 상층 액을 버린다. , 펠렛에 완전한 NBM의 45 ML을 추가 부드럽게 혼합 혈청을 씻어 원심 분리를 반복합니다. 5ml를 완료 NBM의 펠렛을 다시 중단하고 얼음에 개최합니다.
    13. 얼음에 하나의 원뿔 튜브에 수집 된 모든 세포를 결합 5 수확의 총 반복 셀 수확 단계.
    14. 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 준비 t그는 통해 DMEM / F12 + 7 % FBS 10 ㎖를 통과 한 후 10 ml의 PBS로 세척하여 스트레이너 셀.
    15. 천천히 (그림 2M 참조)를 통해 드립 할 수 있도록 스트레이너에 세포 현탁액을 추가합니다. 부드럽게 모든 진공을 깨고 일시 중단 된 세포가 자유롭게 통과 할 수 있도록 각각의 새로운 추가 사이에 셀 스트레이너의 탭을 들어 올립니다 (그림 2N 참조).
    16. 상기와 같이 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기. 전체 NBM 10ml에 다시 중단하고 0.04 % 블루 트리 판과 혈구를 사용하여 가능한 세포의 수를 결정하기 위해 계산합니다. microtumor 생성 될 때까지 얼음 세포를 잡습니다.

2. 다른 조직 세분화 프로토콜

  1. 조직 dissociator 및 세분화 시스템 자동화.
    1. 프로그램 "종양 _02_02"를 눌러 시작을 선택하고 32 초 동안 실행, 휴대 dissociator로 세분화 튜브를 놓습니다. 전달 튜브는 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 발생하는 회전기.
    2. 원심 분리기는 실온에서 8 분 동안 150 XG에서 세포를 중단하고 상층 액을 버린다. 세포를 원심 분리하는 동안, 세포 현탁액의 처리 시약을 설정. 10 ml의를 무 혈청 NBM 천천히 씹다 정지를 추가합니다.
    3. 30 × 106 생존 세포 (~ 0.3 ㎖) - 원심 분리 후, ~ 10를 함유하는 세포 펠렛을 얻었다. (도 2O을 참조) 10 mL의 무 혈청 NBM에 펠렛을 재현 탁 -. 제외 분석하여 가능한 세포를 결정한다 (단계 3.2.2 참조).

3. Microtumor 세대

  1. 시약의 제조
    1. 1.1.4에서와 같이 전체 NBM을 준비하고 내부 프로토콜 당 (3 ㎎ / ㎖에서 HDHG) 중화 고밀도 인간의를 Biogel (HuBiogel)를 준비합니다. 유사를 Biogel 행렬이 또한 사용될 수있다.
  2. Microtumor 생산 및 문화
    1. 얼음에 완전한 NBM에서 단일 세포 현탁액 등 갓 해리 PDX 세포를 얻습니다.
    2. 셀 스와 믹스트리 판 블루 용액 (PBS에 0.4 %)과 같은 부피를 가진 spension은 트리 판 블루 배제에 의해 셀 (18)의 수 및 생존력을 결정 hemacytometer를 사용하여 분석한다. 50,000 세포를 생성하는 데 필요한 볼륨 / 제거 microtumor 볼륨 = (50,000 세포 / 종양 * # 종양) / (가능한 셀 / 1 ml의 계산)과 신선한 원뿔 튜브에 배치 할 경우.
    3. 상온에서 8 분 동안, 150 × g으로 원심 분리하여 세포를 농축시켰다. 뜨는을 취소하고 FBS 1 부 세포와 4 부 HDHG의 최종 비율로 얼음처럼 차가운 HDHG 솔루션 세포 펠렛을 resuspend.
    4. microtumors (2mm 비즈 50,000 세포를 포함하는 각)를 생성하기 위해 (소수성 코팅) 96 핀 강판에 핀 세포 HDHG 혼합물 당 ​​10 μl를 분배하는 전자 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
    5. 구슬을 겔화 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 가습 5 % CO 2) 내부 3D 종양 구슬을 배치합니다.
    6. 겔화 후 (10 μ를 microtumors를 전송상기 전자 멀티 채널 피펫 및 맞춤 핀 장치를 사용하여 전체 NBM 함유 맞춤 현탁 배양 챔버 (50 ㎖) 또는 대량 배양 접시 (10cm로 l)).
    7. 1 일 이후 - 조직 문화 인큐베이터 2 일 50 μL의 NBM / 웰 피펫을 분배 넓은 입을 사용하여 수행하는 다양한 분석 및 분석 프로토콜을 포함하는 96 웰 배양 플레이트에 microtumors을 전송합니다.
  3. 약물 치료와 microtumors의 유지 보수
    1. 약물 테스트를위한 최종 농도를 선택합니다.
      주 : 약물이 2 차원 배양의 효능을 알고있는 경우, 선택 배의 중간 투여 량 농도가 IC (50)가 위아래 5 도즈 레벨 총 희석액을 3 배 선택한다. 이 IC (50)는 2D 문화의 약 9 μm의 경우 예를 들어, 54 μM, 약물 테스트를위한 최종 농도 162 μM을 2 μM, 6 μM, 18 μM 선택합니다.
    2. 디메틸 sulfoxi에서 완전한 NBM에 2 배 약물 투여 솔루션을 준비드 (DMSO) 주식. 5 도즈 3 배 연속 희석액을 제조 1 % DMSO 매체 투약 용액을 희석.
    3. 0.5 %의 최종 DMSO 농도를 달성하기 위해 웰 분석 플레이트에서의 50 μl를 함유 microtumor에 투여 용액 50 μL를 추가한다. 3.3.1에서 결정된 각 약물의 투여 량에서 각각의 복제 (예를 들어, 4)에 대해 반복합니다.
    4. 37 ° C에서 문화를 유지, 5 % CO 2, 1 가습 조직 문화 인큐베이터 - 십사일. 위와 같이 미디어 및 약액를 새로 고침하여 두 번 매주 피드 문화.

4. 형태 학적 및 Microtumors의 표현형 분석

  1. 표준 라이브 세포 얼룩을 사용하여 microtumors의 세포 형태를 결정합니다.
    1. DMSO에 칼 세인-AM의 1 mM의 주식을 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
    2. 원하는 배양 간격 (1, 7, 14 일)에서 1 μM의 최종 농도를 96 웰 플레이트 (칼슘 / 마그네슘)없이 PBS에서 제조 된 칼 세인 AM 용액을 추가한다.
    3. 품다2 배, 4 배에서 형광 현미경을 사용하여 37 ° C, 5 % CO 2, 가습 인큐베이터 및 이미지에서 20 분, 그리고 10 배 (여자 : 450-490 나노 미터 대역 통과, 방출 : 515 nm의 긴 패스, 500 nm의 이색) .
  2. Microtumor 성장 / 증식 분석
    1. 12 mM의 주식을 준비하기 위해 (칼슘 / 마그네슘없이) PBS에 MTT 분말을 녹여. -20 ° C에서 살균 필터, 나누어지는 및 저장.
    2. 원하는 배양 간격 (1, 7, 14 일)에서, 100 ㎕의 배양 부피 당 96- 웰 플레이트에 MTT 용액 20 μl를 추가한다. 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간을 품어.
    3. 0.01 M HCl을 10 % SDS의 신선한 분해 용액을 준비하고 접시에 배양 볼륨에 동일한 금액을 추가합니다. 하룻밤 37 ° C 배양기에서 밀봉 판을 품어.
    4. 멀티 플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 참조하십시오.
  3. Kinomic 분석을위한 Microtumor 준비
    1. 프로 100 배 각각 100 비율 : 4 ° C에 미리 차게 한 다음 1을 추가하여 용해 버퍼를 준비TEIN 인산 가수 분해 효소 억제제 (PPI)와 100 배 단백질 프로테아제 억제제 (PI). 잘 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
    2. 이전 세 1.5 ml의 microcentrifuge 관의 각 2 microtumors. 상층 액을 제거하고 4 ° C에서 30 분 각 튜브를 Lyse에 PPI와 PI를 포함하는 용해 버퍼의 40 μl를 추가합니다.
    3. 피펫 샘플을 적극적으로 종양 구슬을 깰 수 있습니다. kinomic 분석 할 때까지 -80 ° C에서 4 ° C 저장 샘플에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기.

Microtumors 5. Kinomic 프로파일

  1. 단백질 티로신 키나제 (PTK) 프로파일
    1. 해동 시약 (10 배 단백질 키나제 (PK) 버퍼 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 프로파일에 위치 # 2 주사기에 4 ° C로드 PK 버퍼 (300 ㎕의 10 배 PK 버퍼 재고 2.7 ml의 DH 2 O)에 플랫폼.
    2. 소프트웨어 내에서 샘플을 주석, 키나아제 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 PTK 프로토콜 파일을 눌러 'START'를로드스캔 칩 후 프로그램입니다. 다음 프로파일 링 플랫폼과 부하 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 25 μl의 배열 당 위에 배치 칩 단계를 차단 소프트웨어로 제어 프로토콜을 시작 LOAD를 누릅니다.
    3. 10 mM의 아데노신 삼인산 (ATP)를 만들기 위해 54 μL의 DH 2 O 100 mM의 ATP 주식의 6 μM을 희석. 소프트웨어가 3 차 및 최종 세척 단계 (화면에 표시)를 시작하면 해물의 15 μg의는 DH 2 O와 28 μL까지 가져 가져 혼합 배열에 추가 할 수 있습니다.
    4. (최대 12 샘플) PTK 마스터 믹스 (MM)를 준비합니다. (이미 60 μl의 10 배 BSA를 포함) (DTT)를 디티 오 트레이 톨을 재구성하고 PTK-MM1 관, 6 μL DTT, 60 ㎕의 10 배 PK 솔루션을 추가하는 32.6 μL의 DH 2 O를 추가합니다.
    5. 다음 126 PTK-MM1의 μL, 60 μL의 PTK 첨가제 등을 추가 나타납니다 키나아제 분석 소프트웨어 '로드'프롬프트 될 때까지 기다립니다 60 μl의 10 mM의 MM2에 ATP (4.5 ㎕를 PY20 FITC 항체를 분주 이전 포함)과 혼합한다.각 샘플 해물 튜브와 피펫 믹스 5 번이 PTK 마스터 믹스 16 μl를 추가합니다.
    6. 커버 유리가 깨끗한 지 확인 후 35 μl의 용 해물 / 배열, 가까운 회전 목마 뚜껑 눌러 LOAD 버튼 당 마스터 믹스를 추가합니다.
  2. 세린 / 트레오닌 키나제 (STK) 프로파일 :
    1. 해동 시약 4 ° C까지 (10 배 PK 버퍼, 10 배 STK 버퍼, 2 %의 BSA). 로드 PK 완충액 주사기 위치 # 1, 1:10 STK 버퍼 주사기 위치 # 2로 (2.7 mL의 DH 2 0 300 μL)로 (2.7 mL의 DH 2 0 300 μL).
    2. 스캔 칩 후 프로그램 내에서 샘플을 주석, 키나아제 분석 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 열고 STK 프로토콜 파일과 보도 START를로드합니다. 프로파일 링 플랫폼과 부하 후 25 어레이 당 2 % BSA의 μL, 소프트웨어 제어 프로토콜 차단 단계를 시작 LOAD를 눌러 상에 배치 칩입니다.
    3. 54 μL의 DH 2 O. 100 mM의 ATP 6 μM 희석 최종 (3 차) 세척 단계 믹스 중해물의 2 μg의 및 DH 2 O와 32.6 μL로 불러, 혼합 배열에 추가 할 수 있습니다.
    4. STK-MM1 튜브에 70 μl의 10 배 PK 추가 (7 ㎕의 100 배 BSA를 포함), 다음 STK-MM1 튜브에 42 μL의 DH 2 O를 추가 STK 마스터 믹스합니다.
    5. 다음 키나아제 분석 소프트웨어 '로드'프롬프트 될 때까지 기다립니다 : STK-MM1 18 μl의 10 mM의 ATP를 추가하고 각 샘플 용 해물 9 μL의 MM1를 추가합니다. 잘 섞다.
    6. 커버 유리가 깨끗한 지 확인하고 35 μl의 용 해물 / 배열, 가까운 회전 목마 뚜껑 눌러 LOAD 당 마스터 믹스를 추가합니다.
    7. 최종 (3 차) 세척 단계 중 (3.03 μl를 STK 차 항체 믹스를 포함) DMAB 관에 1.05 μL의 STK-FITC 차 항체를 추가 DMAB에 39.6 μL AB 버퍼를 추가, 추가 356.0 μL의 DH DMAB 2 O는, 각각의 배열에 DMAB 30 μl를 추가하고 보도 LOAD .
  3. Kinomic 데이터 (19, 20)의 분석
    1. 오픈 분석 소프트웨어 및 이미지 분석 응용 프로그램을로드합니다. 자체[선택] 이미지 PTK 또는 STK 데이터를 선택 문서 번호 일치하는 배열 레이아웃 파일 (STK에 대한 PTK에 대한 86312 및 87102)에 대한 바코드와 타임 스탬프 전체 배열 이미지가 들어있는 폴더 및로드는 이전에 배열 주석 파일을 생성합니다.
    2. 모든 이미지의 정확한 리딩을 확인하고 응용 프로그램을 확장 노출 시간을 실행합니다. 통계적으로 노출 / 경사 LOG2 변환 된 값을 비교하고, 예비 세탁 운동 곡선을 19-21으로 확인합니다.
    3. 상류 키나제 22, 23에 대한 조건 사이의 변경된 kinomic 프로필을 조회 할 수 상류 키나제 예측 소프트웨어를 실행합니다.

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결과

우리는 3D를 Biogel 배양 시스템은 여러 종류의 세포 장기 성장 및 기능을 지원하는 것을 보여준다. 이 공동 프로젝트에서, 환자 유래 GBM의 xenolines (PDX)는 microtumors의 수백을 생산하는 데 사용됩니다. 해리 세포 (3 × 10 5) 또는 neurosphere를 (40-50)는를 Biogel 비즈 (2mm)에 포함 된 빠른 겔화 후 그들은 NB-미디어 작성 사용자 정의 생물 반응기에서 배양한다. 세포 생존 능력 (칼 세인-AM), 성장 프로파일 (MTT), 및 kinomic 활동 배열 기반의 분석은 측정 하였다. PDX의 microtumors은> 삼주에 대한 다세포 조직과 높은 생존 능력 (> 80 %)를 유지했다. 우리는이 생체 -like 생물학은 3D 셀 매트릭스 구조의 유지 보수 (2D 또는 회전 타원체 문화 불가능)로 인해 믿습니다. 또한 3D 종양 가능성으로 인해 콜라겐 I ...

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토론

프로토콜 내에서 중요한 단계는 주로 생성뿐만 아니라 약물 투여 및 유지 microtumor에 관한 것이다. microtumor 비즈 깨지기 쉽게 찢어 때문에, 극도의주의는 분석 및 유지 보수의 발달 단계에 모두 필요합니다. 에러가 이러한 공정 중 하나가 발생했을 경우, 실험 해석 확장하거나 불필요한 반복 실험 데이터 또는 심지어 배제를 초래 손상 될 수있다.

수정 및 문제 해결, 특히 microtumor 개발 과정은 microtumor 구슬을 사용하는 사용자 소수성 툴의 설계 및 제작을 포함했다. 이 도구는 microtumors의 더 빠르고 정확한 생산이 가능합니다. 또한 microtumors 유지 작은 변형 배지를 바꾸고 세포를 투여하는 과정을 가속화하는 것을 도왔다. 이러한 변형 중 일부는 포함하지만, 다 채널을 이용하여, 이에 한정되지 않은전자 피펫으로 제거하고 96- 웰 플레이트로부터 배지를 대체하는 새로운 약물 투여 용액을 미리 혼합하고, 해당 2 mL를 96- 웰 ...

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공개 사항

R.S.와 R.S.는 Vivo Biosciences의 직원입니다. JCA는 UAB Kinome Core에서 부분적으로 자금을 지원합니다.

감사의 글

, 뇌 종양 SPORE 상 (PD : GY 길레스피, P20CA 151129-03)과 SBIR 계약 (PI : R. 싱, N43CO-2013-00026) : NIH R21 부여 (C. Willey, CA185712-01 PI)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소-I 시그마-알드리치CO130
트립신 EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 보충제Life Technologies17502-0481x 최종 농도
B-27 보충제 (비타민 A 제외Life Technologies12587-0101x 최종 농도
재조합 인간 FGF-basicLife TechnologiesPHG0266 10 ng / ml 최종 농도
재조합 인간 EGFLife TechnologiesPGH0315 10ng/ml 최종 농도
L-글루타민Corning Cellgro Mediatech25-005-CI2mM 최종 농도
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 &마이크로; g/ml 최종 농도
페니실린 스트렙토마이신오메가 사이언티픽PS-20100 U/ml 페니실린 G, 100 &마이크로; g/ml 스트렙토마이신 최종 농도
GentamicinLife Technologies15750-06050 ng/ml 최종 농도
MTTLife TechnologiesM6494PBS에서 5 mg/ml로 준비되고 멸균 여과, 웰 SDS에서 1 mg/ml
FisherBP166, 0.01 에서 10%로 준비됨; M HCl, 5% in well
HClFisherA144SI-212for MTT lysis buffer, 0.01  SDS가 있는 M, 웰
Calcein AMLife TechnologiesC14305mM DMSO 재고에서 1mM, 2  &마이크로; PBS 염색 용액의 M, 1  &마이크로; M in well
Halt' (M) s 단백질 인산가수분해효소 억제제 칵테일 피어스 써모사이언티픽784201:100 비율, MPER 
Halt의 단백질 프로테아제 억제제 Pierce ThermoScientific877861:100 비율 in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisher BP231for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza17-517Q, MiliQ 초순수로 1배로 희석, 멸균 여과(세포 배양용)
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(Ca/MgCorning, Cellgro Mediatech20-030-CVMiliQ 초순수로 1배로 희석, 사전 고정 세척용)
10% 중성 완충 포르말린프로토콜032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
High Density HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt's Protein Phosphatase InhibitorPierce78420
Halt's Protein Protease InhibitorPierce87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER)Thermo Scientific78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chipPamGene86312
PTK 키나아제 완충액PamGene36000300 µ l 10x PK 버퍼 스톡 2.7  ml dH2O, PTK 시약 키트의 카탈로그 번호
ATPPamGene36000PTK 시약 키트의 카탈로그 번호
PY20- FITC-conjugated antibodyPamGene36000PTK 시약 키트의 카탈로그 번호
PTK AdditivePamGene32114
PTK-MM1 튜브(10x BSA)Ppk 시약 키트
의 PamGene 36000 카탈로그 번호Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chipPamGene87102
STK kinase bufferPamGene32205STK 시약 키트용 카탈로그 번호
STK Primary Antibody Mix(DMAB 튜브)PamGene32205STK 시약 키트용 카탈로그 번호
FITC-conjugated Secondary AntibodyPamGene32203
STK-MM1 튜브(100x BSA)PamGene32205STK 시약 키트용 카탈로그 번호
STK 항체 버퍼PamGene32205STK 시약 키트용 카탈로그 번호
Equipment
#11 블레이드, 멸균Fisher3120030
#3 메스 핸들, 멸균Fisher08-913-5
100mm 유리 페트리 접시Fisher08-748D
반곡선 펜치Fisher12-460-318
트립시나이징 플라스크Fisher10-042-12B
자기 스티러Fisher14-490-200
3/4" 스티어 바Fisher14-512-125
B-D 셀 여과기 Fisher#352340
B-D 50 ml 원심분리기 튜브Fisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 키노믹 분석 소프트웨어 PamGene
Evolve Kinase 분석 소프트웨어PamGene
UpKin App 소프트웨어(업스트림 키나아제 예측)PamGene
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
회전식 세포 배양 시스템(RCCS)10ml 일회용 HARV가 있는SyntheconRCCS-D
) 는 MTT 용해 완충액에 대해 에서 , ,

참고문헌

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