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방법 논문

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54032

⸱

2016년 5월 18일

 , 
1Department of Infection and Immunity, London School of Hygiene & Tropical Diseases

이 논문에서

요약

이 원고는 말기 감염을 추적하기 위해 아프리카 트리파노좀의 생물 발광 균주를 사용하는 방법을 설명하고 in vivo 라이브 이미징을 사용하여 중추 신경계 내의 감염을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

초록

인간 아프리카 트리파노소마증(HAT)은 기생충이 중추신경계(CNS)에 침입하는 초기 혈액 단계와 후기 단계의 두 단계로 나타나는 다단계 질병입니다. 후기 단계의 생체 내 연구는 전통적인 방법론이 기생충의 존재를 결정하기 위해 뇌를 제거해야 하기 때문에 제한적이었습니다.

Bioluminescence 이미징은 루시페라아제에 의해 transfected 병원체를 실시간으로 시각화할 수 있는 비침습적이고 매우 민감한 형태의 광학 이미징입니다. 생쥐에서 말기 질환을 일으킬 수 있는 형질주입된 트리파노솜 균주를 사용함으로써, 감염 과정 전반에 걸쳐 단일 동물에서 중추신경계 감염의 동역학을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 전신 감염의 이동 및 전파를 관찰할 수 있습니다.

여기에서는 아프리카 트리파노소마증의 생물 발광 모델을 사용하여 CNS 감염을 연구하기 위한 강력한 프로토콜을 설명하며, 선택적 다운스트림 접근 방식으로 추가로 분석할 수 있는 실시간 비침습적 관찰을 제공합니다.

서론

Human African trypanosomiasis (HAT) 또는 수면병은 Trypanosoma brucei spp1의 매개체 매개 원생동물 기생충에 의해 발생합니다. 현재 추정 감염 사례는 매년 7,000명 미만으로 추산되며, 아프리카 대륙 내에서 거의 7,000만 명의 사람들이 기생충 감염 위험에 노출되어 있습니다. 치료하지 않고 방치할 경우 가장 치명적일 수 있는 이 질환은 혈액에 기생충이 존재하는 초기 혈림프계로 구성되며, 기생충이 중추신경계(CNS)에 침입하여 더 이상 초기 트리파노솜 약물로 치료할 수 없는 말기로 진행된다2. 말기 HAT에 대한 현재의 약물 요법은 복잡하고 장기적인 치료 요법과 심각한 부작용 및 보고된 내성을 모두 가지고 있으므로 새로운 약물 요법에 대한 연구가 필수적입니다3,4.

전통적인 마우스 모델 내에서 말기 인간 아프리카 트리파노소마증(HAT)에 대한 연구는 길고 복잡하며, 기생충 부담을 모니터링하기 위해 뇌 조직을 제거해야 합니다5. 동물 감염성 균주 T. b. brucei는 트리파노소마증의 연구 모델로 사용되며 후기 단계는 감염 후 21일(dpi)에 나타납니다. 마우스 모델에서 야생형 비생물발광 기생충 감염을 모니터링하기 위해 말초 혈액 필름 또는 정량적 PCR이 기생충 부담을 결정하는 유일한 방법입니다. 뇌에 기생충이 많이 생긴 경우, 쥐를 도태하고, 뇌를 절제하고, 조직에 qPCR을 수행해야 하기 때문에 감염 말기에 여러 시점을 통해 기생충을 추적하는 것이 불가능합니다. 이로 인해 중추신경계(CNS) 내의 실시간 감염을 추적할 수 없습니다.

생체 내 생물 발광 이미징(BLI)은 실험 전체에 걸쳐 단일 동물에서 추적할 수 있는 마우스 모델에서 기생충 전파 및 질병 진행에 대한 매우 민감하고 비침습적인 검출을 제공할 수 있습니다6. BLI는 루시퍼라제 촉매 반응에 의해 생성된 가시광선 스펙트럼의 빛 방출을 기반으로 합니다. 그런 다음 방출된 광자는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라(7)에 의해 검출됩니다. 이를 위해 병원체를 유전적으로 변형하여 루시페라아제 단백질을 발현하고 기질인 루시페린을 주사에 의해 관심 시점에 도입합니다. 이 방법의 주요 장점은 부작용을 최소화하면서 동일한 동물을 여러 번 이미지화할 수 있는 종단 연구를 수행할 수 있다는 것입니다. 획득된 생물 발광 신호는 정량화될 수 있으므로 병원체 부담을 나타낼 수 있습니다.

적색편이 생물발광(red-shifted bioluminescent T. b. brucei)의 최적화와 검증을 통해 비침습적 절차를 통해 말기 감염을 조사할 수 있게 되었고, 혈액막 현미경 검사보다 일찍 기생충을 검출할 수 있게 되었으며, 후기 트리파노소마증에서 중추신경계 감염 및 약물 스크리닝을 연구하는 데 필요한 시간, 비용 및 동물의 수를 크게 줄일 수 있게 되었다8,9. 이 프로토콜에서는 생쥐의 생물 발광 트리파노좀 감염과 질병 진행 및 CNS 침투의 정량화를 위해 생체 내에서 기생충을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

윤리학
모든 작업은 영국 홈 오피스 동물의 승인 (과학적인 절차) 법 1986 위생 및 열대 의학 동물 복지와 윤리 심의위원회의 런던 학교에서 실시 하였다. 가이드 라인에 도착하는이 보고서에 따른다.

발광 생물 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei의 생체 항로 1.

  1. T.의 냉동 보관 재고 (라고 stabilate)를 제거 비. brucei 변형 액체 질소에서 9 (MTA를 통해 위생 및 열대 의학의 런던 학교 교수 존 켈리에서 구입 가능) GVR35-VSL-2 및 실온에 평형 수 있습니다. 멸균 인산 완충 포도당 식염수 (PBS-G)의 pH 8.0 (1 L PBS + 15g 포도당) (10)에 2 × 10 4 트리 파노 솜 / ㎖로 stabilate을 희석.
    참고 : T.를 비. brucei GVR35-VSL-2는 인간에게 비 감염성이며 SAPO 실험을 수행 할 시설 허가가 필요합니다.
  2. INJ요법 25 G 바늘로 복강 내 경로 (IP)를 통해 trypanosomes에 희석 0.2 ml의와 20-25g 여성 CD1 마우스입니다. 이것은 "기증자 마우스"입니다. 특정 병원체 무료 (SPF) -cage 및 사료 광고 임의로에 감염된 마우스를 놓습니다.
    참고 : CD1 마우스는 이계 변형 및 T. 있습니다 비. brucei GVR35 감염이 변형에 잘 특징이다. 그러나이 프로토콜은 근친 또는 유전자 변형 계통에 적용 가능하지만, 촬상 -6,9-의 민감도에 영향을 미칠 수 털 색깔 중요하다.
  3. 혈액 샘플링에 의해 주변 기생충을 모니터링합니다. 플라스틱 제한 수단에 마우스를 놓고 21 G 바늘이나 사혈와 venepuncture에 의해 꼬리에서 혈액의 5 μl를 타고 붉은 혈액 세포를 용균 쉽게 계산 할 수 있도록 0.85 % 멸균 염화 암모늄 1/10 섞는다.
  4. 노이 바 우어 혈구에서 희석 된 혈액을 계산합니다.
    1. 두 챔버로 희석 된 혈액을로드합니다. 전체 중앙 GR 카운트하나의 챔버의 ID는 n 개의 트리 파노 솜을 얻었다. 혈액 = N × 104 트리 파노 솜 / ㎖에서 트리 파노 솜의 농도는 모든 희석 계수를 조정하고 두 챔버들의 평균을 계산한다.
      주 : 후 약 5~7일 후 감염, 기생충 주연 2 × 104 트리 파노 솜 / ml의 농도로 감염을 수행하기에 충분히 상승한다.
  5. 트리파노소마 수준은 1.6 단계로 이동 필요한 생쥐의 수만큼 높은 경우. 하나의 공여 마우스 6 × 104 트리파노소마 / ml의 기생충 레벨 10 마우스 악성 충분하다.
    참고 : 통계적으로 유의 한 그룹 크기를 들어, N = 6 마우스의 각 치료 그룹 8 필요하다. 감염의 다른 모델의 경우, 파워 계산은 해당 그룹의 크기를 결정하기 위해인가 될 필요가있을 것이다.
  6. (약 5 ~ 10 분 동안 28 ~ 30 ℃에서) 열 상자에 장소 마우스는 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있도록합니다.터미널 마취 유도 20 밀리그램 / 25 G 바늘 kg 펜토 바르 비탈 정맥을 관리합니다. 확인 마우스 부드럽게 움츠림 반사가 없는지 확인하는 발바닥을 눌러 마취.
  7. 비쥬 튜브에 5000 USP 단위 / ㎖의 헤파린을 5 ㎖ 분취하고 및 1 mL의 주사기에 부착 된 바늘로부터 회 흡인하여 21 G 바늘을 Heparinize.
  8. 헤파린 21 G 바늘과 1 ML의 주사기를 가지고 가고, 흉곽 아래 중앙에 바늘을 삽입하여 마취 통로 마우스의 심장 천자를 수행 (혈액의 비드 바늘의베이스에 풀 것) 부드럽게 플런저를 철수 그래서 같은 마음의 실을 축소 할 수 없습니다. 혈액의 0.7 ML의 최소를 수집합니다.
  9. 위의 단계 1.1로 PBS-G의 pH 8.0에서 2 × 10 4 트리 파노 솜 / ㎖의 접종을 생성하기 위해 감염된 혈액을 희석.
    주 :이 시점에서 남아있는 혈액을 8 % 글리세롤, 20 % 열 - 불 활성화 된 태아 (CA)와 혼합하여 stabilate 생산​​ 동결 보존 할 수있다LF 혈청 (하이 - FCS)와 72 % 감염된 혈액. 천천히 액체 질소로 전송하기 전에, C / 분 ° -1 냉각 속도를 달성하기 위해 컨테이너를 동결 느린 동결을 사용하여 -80 ℃에서 동결.

실험 쥐의 2. 감염

  1. 부드럽게 따뜻한 정맥을 팽창하기 위해 가열 상자에 CD1에게 여성 마우스 (~ 21-25g)을 놓습니다. 플라스틱 구속으로 가온 마우스를 넣고, 마우스 당 4,000 트리파노소마 동등한 꼬리 정맥 내로 25 G 바늘 정맥 0.2ml의 접종 물을 희석하여 주입. 출혈을 막기 위해 후 주사 부위에 압력을 넣습니다.
    복강 내 감염은 감염의 유효한 경로이며, 이전의 연구 (10)에 사용되어왔다, 그러나 우리는 정맥 경로보다이 덜 재현 발견 :합니다.
  2. SPF-배출 케이지 3 그룹에 감염된 마우스와 케이지를 무작위로. 대조군으로서, 야생형 비 생물 발광 기생충, T.와 CD1 암컷 마우스를 주입 비. brucei GVR35 (N =삼).
  3. 혈액 영화 현미경을 통해 감염을 모니터링
    1. 스팟 5 μL의 유리 슬라이드 상 venepuncture 또는 사혈에서 혈액 (부드럽게 박막을 생성하기 위해 상기 슬라이드를 통해 혈액의 방울을 밀어 제 유리 슬라이드를 이용) 혈액 도말 표본을 수행한다. 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다.
    2. DH 2 O로 세척하기 전에 10 분 동안 김사 100 % 메탄올 및 얼룩과 혈액 도말 표본을 수정하고 공기 건조를 할 수 있습니다. 100X 목적에서보기 (FOV)의 10 분야에서 트리 파노 솜의 수를 계산합니다.
      주 : 혈액 촬영이 일찍 일일 감염 후 같은 전체 동물의 비 침습적 영상과 함께 실시된다. 동물들을 처리 할 때 샘플을 실온에서 저장하고 나중에 계산 될 수 있으므로, 트리파노소마 정량이 방법은 혈구 계수보다 선호된다.

3. 생물 발광 이미징 감염을 추적하는

참고 : 감염을 모니터링하려면 전체 ANIM알 비파괴 이미징을 이용할 수있다.

  1. 30 ㎎ / ㎖에서 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 D-루시페린, 반딧불 루시 페라 기판의 재고 솔루션을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 분량 씩 냉동.
    참고 : D-루시페린 민감한 빛 때문에 호일에 분량 씩 포장하여 빛으로부터 보호. 이 활동 11에 영향을 미칠 수있는 반복 루시페린 - 해동 냉동하지 마십시오.
  2. 실온 D-루시페린의 나누어지는을 따뜻하게. (nonbioluminescent 야생 형 기생충 균주에 감염 제어 마우스 포함) 케이지에서 각 마우스를 제거하고 복강 25 G 바늘과 150 밀리그램 / (DPBS에 희석) 가온 D-루시페린의 kg을 주입. / 분 2.5 L에서 2 % 이소 플루오 란 / O 2 믹스 마취를 유도하기 위해 약 5 분 동안 이소 플루오 란 챔버에 마우스를 놓습니다.
    참고 : 그들이 마취 할 때 마우스가 움직이지된다. 여기에 사용되는, 이미 저를 들어, 마우스 3 번에 처리 될 수있다. 마우스는 anesthet 경우이상 30 분 동안화된 안과 인공 눈물 연고 마르지 마우스의 눈을 방지하기 위해 적용될 수있다.
  3. 여기에 설명 된 이미 저를 들어, 소프트웨어를 열고 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 사용하여 시스템을 초기화합니다. 카메라 가열 플레이트가 온도에 도달 한 후에는 이미지를 획득.
    참고 :이 장비는 보통 하룻밤 배경 교정을 수행하는 시스템을 가능하게 꺼져되지 않습니다. 그것은 다시 시작해야하는 경우, 먼저 교정 검사를 실행해야합니다.
  4. (3.5 참조) 이미 저에 마취 마우스를 놓습니다. 어떤 밝은 생물 발광 신호를 통해 출혈을 최소화하기 위해 마우스 사이에 큰 검은 분리기를 사용합니다. 노출 시간의 세트를 이용하여, 화상을 마우스; 뷰 E 매체 비닝 1 F / 정지 개방 필터 및 필드 1, 3, 10, 30, 60 및 180 초 (12.5 X 12.5 cm 2).
    참고 : 야생형 nonbioluminescent GVR35 기생충에 감염 제어 마우스가, 배경을 제공운드, 생물 발광 값입니다. 이 모델과 함께 루시페린의 반응 속도 실험 (그림 6)에서, 우리는 10 분에서 생물 발광 신호 피크 관리를 게시하고 영상은 약 3 마우스 5 분 걸리는 것으로 나타났습니다. 마취와 쥐를 이미징 할 때 고려 사항으로이 척도를 가져 가라.
  5. 쥐의 철저한 영상을 보장하기 위해, 복부, 지느러미와 측면보기를 얻기 위해 회전합니다. 순차적 동물 사이의 이미징을위한 방향의 순서로 일관성을 유지한다.
  6. 촬영 후, 마우스는 SPF-케이지에 반환하기 전에 관찰하에 마취에서 회복 할 수 있습니다.
  7. 21 일 후 감염 될 때까지 매 7 일마다 마우스 이미징 계속합니다. 전체 동물을 통해 생물 발광 신호의 꾸준한 증가가 있어야합니다.
  8. D21, 이미지와 혈액 필름 / kg diminazene aceturate 복강 40 mg을 가진 쥐를 상기하고, 선량으로 쥐에서. 이 약은 주변 기생충을 취소되지만 혈액 꼰 로프 코를 교차하지 않습니다N 장벽, 따라서 CNS 감염 나은 시각화를 가능하게한다.
    참고 Diminazene aceturate의 초기 단계 동물 트리파노소마 증을 치료하기 위해 사용하는 잘 확립 된 약물이다.
  9. D28과 D35에서 이미징 및 모니터링을 계속합니다.

4. CNS 감염을 확인

  1. D35에서, 위에서 설명한 바와 같이 이미지 마우스 (3.1-3.4 단계).
  2. 촬영 후, 추가 분석을 위해 혈액을 수집, 단계 1.6-1.8에 설명 된대로 마우스는 마취에게서 피를 뽑다 마우스를 복구 할 수 있습니다.
  3. 심장 천자 후, 20 ml의 PBS와 마우스를 관류 (옵션 : 3 밀리그램 / 관류 액에 루시페린 ml의 추가) 기관에서 혈액을 취소하고 시간 간격 뇌 영역에서 삭제했을 수 있습니다 루시페​​린 레이블을 재 도입하는 마음을 통해 단계 4.1.
  4. 부드럽게 뇌 있도록, 만곡 가위를 이용하여 두개골의 원주 둘레베이스로부터 절단하고, 두개골 상부를 올려 뇌를 제거부드럽게 곡선 집게 함께 해제된다.
  5. 적절한 루시페린이 절제 뇌에 추가 된 보장하기 위해, 검은 색 플라스틱 피펫 이전 이미지로 기관을 통해 15 ㎎ / ㎖ 루시페린의 50 μL의 한 부분에 절제된 뇌를 놓습니다. 위와 같이 설정을 사용하여 이미지. 이것은 뇌 반구에 감염의 지역화를 시연 할 예정이다.
    주 : 앞서 8 바와 같이 절제 뇌 기생충의 하류 정량화 qPCR에 의해 수행 될 수있다. 다른 대안 다운 스트림 응용 프로그램은 고정 다음 뇌 조직에 기생충을 식별하기 위해 조직 학적 또는 면역 조직 화학을 포함 할 수 있습니다.

생물 발광 이미징 5. 정량

주 : 생물 발광 이미징 소프트웨어이자 (ROI)의 영역을 사용하여 정량화 배경 생물 발광 대해 보정 될 수있다.

  1. 투자 수익 (ROI) 도구를 사용하면, 전체 동물의 정량 A의 직사각형 ROI를 생성차 마우스의 꼬리의베이스에 코 끝을 충당하기 위해 마우스를 이미지 위에 올려 놓으. 각 동물마다 포인트에 동일한 크기의 창을 사용. 뇌에 대한 ROI를 볼 때, 이미지에 마우스 두부를 위에 위치시키는, 동일한 방법으로 원형 ROI를 사용한다.
  2. 원하는 경우, 감염의 시각적 표현에 대해 동일한 스펙트럼에 나타나는 이미지를 조정합니다.
    참고 : 여기에 사용되는 소프트웨어가 자동으로 최소 및 최대 광자 계수 조정 각 이미지의 색상 맵을 생성한다. 일련의 이미지 사이의 시각적 비교를 사용하려면, 컬러 스케일은 모든 이미지에 대해 동일한 값으로 설정해야합니다.
    1. 가장 높은 생물 발광 및 도구 팔레트에서 '이미지 조정'탭을 갖는 이미지를 사용하여, 로그 스케일과 적절한 컬러 규모의 최소 및 최대 (경험적으로 결정되는)을 선택합니다. 실험을 통해 모든 이미지에이 비율을 적용합니다.

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결과

이 프로토콜은 T.와 마우스의 감염 다음 질병의 진행을 수행하는 방법을 보여줍니다 비. brucei는 인간의 아프리카 트리파노소마 증의 모델이. 그림 1 치료 및 이미징 단계의 시간표를 보여주는 실험 프로토콜의 타임 라인을 보여줍니다.이 주변 기생충을 정량하는 데 사용되는 고정 김사 묻은 혈액 도말 검사에서보기의 전형적인 필드를 보여줍니다 그림, 트리 파노 솜과 적혈구 현재와. 동물에서 감염의 개발은 각 시점에서 이미징 된 동일 동물 실험의 과정을 통해 감염된 동물을 보여준다도 3에서와 생물 발광 측정 하였다 될 수있다. 감염 신호 개 파종하고 강렬한대로 생물 발광의 증가 BLI 높은 영역으로, 제 이십일일 통해 모든 동물에서 관찰 될 수있는 과정을 통해 (적색으로 표시비장 지역에서) 열지도 축척에서. ...

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토론

생물 발광의 T. 개발 비. brucei GVR35 변형 후반 단계에 이른에서 트리파노소마 감염의 시각화 할 수 있습니다. 이전 감염 모델 기생충은 뇌에있는 경우 혈액 막 현미경에서 실시간으로, 말기를 검출 할 수 없었다 및 기생 부하 (12)를 결정하기 위해 감염된 마우스에서 뇌의 컬링 및 제거가 필요했다. 하나의 마우스 감염의 전체 및 모든 단계에서 관찰 할 수 감염의 빠른 질적 평가를 통해 추적 할 수 있습니다 같이 생물 발광 간 마우스 변동성을 줄일 수 있습니다. 생물 발광 영상의 매우 민감한 방법은 낮은 수준의 감염이 현미경 9 ml의 검출 5 × 10 3 trypanosomes에 / 비교 영상을 통해 검출 적은 100 trypanosomes에 함께 혈액 영화 현미경보다 일찍 식별 할 수 있습니다. 또한, 실험 전반에 걸쳐 동일한 동물에 이어 제거큰 동물의 사용량을 줄이는 각 시점에 대한 별도의 동물 집단에 대한 필요성이야. <...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 T.를 제공하는 존 켈리 마틴 테일러 (위생 및 열대 의학의 런던 학교) 감사합니다 비. brucei GVR35-VSL-2 및 생체 내 이미징에 대한 조언 박사 안드레아 Zelmer (LSHTM). 이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 글로벌 건강 프로그램 (허가 번호 OPPGH5337)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBSSigma, UKP4417정제 pH 7.4
포도Sigma, UKG827099.5%(분자) 등급
염화암모늄Sigma, UKA943499.5%(분자) 등급
헤파린(리튬 염)Sigma, UKH0878
Hi-FCSGibco, Life Technologies, UK10500-064500ml
DPBSSigma, UKD4031멸균 여과
Mr. FrostyNalgene, 영국
GiemsaSigma, UKG5637
D-LuciferinPerkin Elmer, UK
Sigma, UK115144-35-9
Diminazene aceturateSigma, UKD7770분석 등급
IVIS Lumina IIPerkin Elmer, 영국독점 소프트웨어에서 사용 가능한 기타 바이오이미저e.
기기에는 자체
Greiner Bio-oneN2516
21G 바늘Greiner Bio-oneN2138
트윈 프로스트 현미경 슬라이드VWR, UK631-0117
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브StarLab, UKI1415-1000
7ml 비주관StarLab, UKE1412-0710
마우스 리트레이너Sigma, 영국Z756903우리의 구속기는 사내에서 제작되었으며 유사한 모델입니다.
당 Bruker, Kodak Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, Perkin Elmer, Perkin Elmer IVIS 기기용 영국 다른 1ml 주사기 Fisher Scientific, 영국 10142104 20ml 주사기 Fisher Scientific, 영국 10743785 25G 바늘이 있을 수 있습니다.

참고문헌

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  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).
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