격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

요약

담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.

초록

지난 3 년간의 엑소 좀 연구는 크게 바이오 마커 및 치료 용도의 식별 및 특성으로 범위를 확장했다.

엑소 좀 최근 마이크로 RNA (미르)을 함유하는 것으로 나타났다. 미르 자체 진단을 위해 가치있는 바이오 마커로 제기했다. 진료소와 병원에서 표본 수집이 매우 변수이기 때문에, 전체 담즙에서 miRNA의 분리가 실질적으로 변화한다. 간단하게 수집 담즙 샘플들로부터 강력한 정확하고 재현성 miRNA의 프로파일을 달성하기 위해서 분리 담즙에서 엑소 좀을 특징 고품질 프로토콜의 개발이 필요했다. 이 방법은 몇 회 원심 분리 및 엑소 좀 펠렛 최종 초 원심 분리 공정과 여과 단계를 필요로한다. 전자 현미경, 웨스턴 블랏은 유동 세포 계측법 및 다중 파라미터 나노 광학 분석이 가능하며, 전자의 품질을 확인하는 것이 중요 특성화 단계는xosomes. 즉, 예쁜 꼬마 선충, 같은 종에서 비특이적, 합성의 miRNA와 해물을 급상승 이러한 엑소 좀에서의 miRNA의 분리를 위해, CEL-은 miR-39, RNA 추출 효율의 정상화를 위해 중요하다. 이 방법에 따라 담즙 액에서 엑소 좀의 분리는 성공의 miRNA는 -80 ° C에서 몇 년 동안 저장된 담즙 샘플에서 프로파일 링 할 수 있습니다.

서론

다른 생물 즉, 유체, 모유, 플라즈마 또는 소변과 마찬가지로, 담즙은 엑소 좀, 지질이 풍부한 소포 ^{1-4가 포함되어 있습니다.} 엑소 좀을 유도하거나받는 셀 ^{(5), (6),} 정상 기능 ^{(4), 7-9의} 일부일 수도 세포 간 통신의 형태 생물학적 기능을 변경할 수있다. 엑소 좀 진단 ^(10)에 대한 바이오 마커의 가치있는 소스를 제공 할 수 miRNA의 종을 포함 할 수 있습니다. miRNAs의 프로파일 질환 ^11-14의 다양한 진단 및 예후 표지자로서 최근에 상당한 관심을 얻고있다.

miRNA의 자체는 생물학적 유체, 아마도 죽은 세포에 의해 발표 및 창고 세포의 양이 크게 기저 질환에 의해 영향을받을 수에서 찾을 수 있습니다. 엑소 좀의 miRNA의 프로필은 반드시 원래 셀 ^{6, 10, 15 ~ 17의} miRNA의 프로파일을 반영하지 않는, 아직 엑소 좀은 부모 가전에 대한 특성 수 있습니다 miRNA의 서명을 수행 할 수있다종양 세포를 원하는 것이다. 종양 유래 엑소 좀은 폐 선암, 전립선 암 등의 종양이 ^{8, 16, 18을} 가진 환자의 혈장에서 발견되었다.

이 방법의 목적은 자신의 이전 처리 절차의 대부분 독립적 인 인간의 담즙 시료에서 엑소 좀의 안정적이고 강력한 격리입니다. 그것은 이러한 담관암 ⁽¹⁹⁾ 담관 질환의 전위 진단의 miRNA의 신뢰성있는 소스로서 담즙을 이용하기 위해 개발되었다. 이 엑소 좀을 분리 속도가 증가함에 따라 원심 여러 단계로 구성되며, 다른 생물학적 유체에 적용 할 수있다.

프로토콜

내시경 역행 췌담 관 조영술에 의한 환자에서 담즙을 취득 (ERCP)는 임상 시험 심사위원회에 의해 인간 대상 연구 프로토콜의 승인을 필요로한다. 여기에 제시된 모든 작업은 존스 홉킨스 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다.

담즙 1. 엑소 좀 격리

1. 내시경 역행 췌담 관 조영술 (ERCP)을 수행합니다. 앙와위에서 환자를 놓고 삽관.
   1. 환자의 구강을 통해 십이지장을 전달하고 십이지장의 두 번째 부분에 삽입하고 주요 유두를 식별합니다.
   2. 선택적 트리플 루멘은 0.035 인치 (0.9 mm) 가이드 와이어 친수성 ​​사전로드 sphincterotome 삽입하여 담관을 cannulate.
   3. 경우에는 바로 간 덕트에서 담낭 관을 구별하기 어려울 수 있기 때문에 왼쪽 간장 덕트 투시하에 가이드 와이어를 사전, 다음을 발전안정된 위치를 취득하는 담관에 5cm를 sphincterotome.
   4. 루어 잠금 장치를 통해 가이드 와이어 포트에 10 ML의 주사기를 연결, 가이드 와이어를 제거하고 부압 10 ㎖를 사용하여 담즙을 대기음.
   5. 가이드 와이어를 다시 삽입하여 담즙 트리를 opacify하기 위해 주입 포트를 통해 조영제를 주입하여 ERCP를 진행하는 담즙이 들어있는 주사기를 제거합니다.
   6. 얼음에 15 ML 튜브에 수집 된 담즙을 전송하고 원심 분리 단계를 진행하기 위해 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
      주의 : 자신과 샘플을 보호하기 위해 장갑을 착용! 이 A 형 간염 바이러스 입자를 포함 할 수있는 감염의 잠재적 인 소스로 담즙 치료!
   7. 얼음 샘플 (들)을 유지합니다. 어느 10 분 동안 4 ° C에서 500 XG에 단계 1.2 원심 분리기를 진행 한 후 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 동결.
      참고 : 몇 년 동안 이런 식으로 저장 샘플은 일상적으로 좋은 결과를 ^19로 사용되어왔다.
2. 미세 원심 튜브에 전송 담즙의 400 μl를 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 세포와 세포 파편을 수집합니다.
3. , 피펫으로 상층 액을 제거 신선한 microcentrifuge 관에 전송하고 더 파편의 상층 액을 취소 4 ° C에서 또 다른 20 분 동안 16,500 XG에서 샘플 (들)을 원심 분리기. 생물 학적 폐기물 튜브를 폐기하십시오. 이와 달리, 대신 초 원심 분리기에서 샘플을 스핀.
4. 상층 액을 수집하고 왼쪽 내지 200 nm보다 큰 모든 입자를 제거하는 바인딩 좋은 흐름 속도와 낮은 단백질이 0.2 μm의 폴리 에테르 설폰 (PES) 멤브레인 필터 주사기와 바이오 안전성 캐비닛을 필터링 할 수 있습니다.
5. 피펫 필터링 된 상층 액을 튜브를 초 원심 분리기와 튜브가 2/3 이상 전체되도록 PBS를 추가합니다. 튜브는보다 작은 액체를 포함 할 경우, 튜브는 원심 분리 동안 붕괴 것입니다! 튜브, 세정 및 멸균을 여러 번 재사용 될 수있다.
6. 펠등 4 ° C에서 70 분 동안 120,000 XG에 초 원심 분리를 통해 엑소 좀. 때로는 작은 노란색 알약을 볼 수있는 초원 심 분리기 튜브의 하단에있는 원심 분리 봐 후, 이러한 엑소 좀이있다.
7. 조심스럽게 경사에 의해 뜨는을 취소하고 10 % v / V를 최종 농도 표백제를 추가하여 폐기물을 소독하고 20 분 동안 서 보자.
8. 하류 실험 어느 적절한 용액의 소량의 펠릿 (들)을 처리 (즉, radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 단백질 격리 미르 격리를위한 RNA 용해 버퍼 버퍼) 또는 인산 50-150 μL 그것을 재현 탁 버퍼링 어느 TEM 또는 나노 입자의 광학 분석하여 엑소 제제 특성 -80 나중에 사용할 °의 C (정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR) 또는 단백질의 추출 등)에 저장 또는 사용할 수있는 생리 식염수 (PBS) .

2. 엑소 좀 확인투과 전자 현미경 (TEM) 또는 CryoEM

1. 피펫 팅에 의해 PBS 100 ㎕의 세포 외 소포를 재현 탁. 처음으로 분리를 수행 할 때 특히 이상적으로, -20 ° C에서 저장되거나되지 않은 -80 ° C 엑소 좀을 사용한다.
2. 2 분 동안 400 메쉬 탄소 코팅 Parlodion 구리 그리드에 20 μL 나누어지는 (약 2 μg의)를 흡착하고 실온에서 건조 할 수 있습니다.
3. 건조 준비에 신중 방울을 배치하여 실온에서 5 분 동안 1 % (v / v)의 글루 타르 알데히드 (EM-등급)의 엑소 좀을 수정합니다.
4. 5 분 동안 물을 두 번 그리드를 세척 한 다음 30 초 동안 1 % 인 텅스텐 산 (PTA)와 얼룩 전기 자동차를 대조.
5. 80 킬로 볼트의 가속 전압 20,000X의 배율에서 시작하여 입자의 크기를 결정할 때까지 증가 100,000X 전자 현미경 이미지를 획득.
   참고 : 다른 최상의 상태로 준비를 Formvar 탄소 코팅 200 메쉬 구리 또는 니켈 그리드 및 대비 염색 리에 레이어처럼10-15 분 KE 1 % 2 % 우라 닐 아세테이트 또한 가능하다.
6. (: 3 비율 1) CryoEM를 들어, 60 ㎕의 단백질 G 골드 10 나노와 20 μL 나누어지는 (약 2 μg의)를 섞는다. 이 엑소 직경을 결정하는 것을 도울 것이다.
7. 글로우 방전 C-평면 구멍 투성이의 탄소 격자에 샘플을 전송하고 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. 액체 에탄에 즉시 침지하여 그리드를 고정.
8. 액체 질소에 cryoholder에서 그리드를 탑재합니다.
9. 20,000X 및 100,000X의 배율 200 kV로의 이미지를 획득.

다중 매개 변수 나노 입자 광학 분석 3. 엑소 좀 확인

1. 피펫 팅에 의해 PBS 100 ㎕에 고립 된 엑소 좀을 재현 탁.
2. 여러 비율로 600 ㎕의 PBS에 희석 엑소 좀 (같은 1시 50분, 1 : 100, 1 : 300, 1 : 600, 1 : 1200).
3. manufactu는에 따라 실시간으로 해당 기기와 소프트웨어 레이저 광의 산란에 의한 엑소 좀 시각화총통의 프로토콜 ^20.
4. 입자가 표시 될 때까지 입자가 부드럽게 보이도록 포커스 조정 촬영 모드에서 카메라의 수준을 증가시킨다.
5. 표준 모드에서, 입자는 여전히 볼 수있는 최저 레벨에 카메라를 감소하는 동안 필요한 카메라 셔터 게인을 조정하는 경우,이를 달성하기 위해.
6. 시각적 장치를 세척하고 PBS에 희석을 조정하지 않을 경우, 20 ~ 100 입자가 화면에 볼 수 있습니다 보장하기 위해 확인합니다.
7. 그런 다음 30 ~ 60 사이의 초 캡처 시간을 조정합니다. 비디오가 캡처 된 후에, 모든 입자가 화면에 확인 될 때​​까지 처리 파라미터를 조정하고 비디오 파일을 처리한다.

서쪽 오점 4. 엑소 좀 특성

1. 얼음처럼 차가운 radioimmunoprecipitation 분석 100 ㎕에서 담즙의 2-5 ml의의를 Lyse의 엑소 좀 펠릿 (RIPA)는 최대 피펫 팅하여 단백질 분해 효소 억제제와 버퍼 아래 철저하게 30 초 동안 적극적으로 해물을 섞어소용돌이에 효과적으로 단백질을 가용화합니다.
2. 대부분의 시간에 필요하지는 않지만, 완전한 용해를 보장하기 위해 10 초마다 2 펄스 얼음 샘플의 초음파 펄스를 사용한다.
3. 5 분 동안 4 ° C에서 15,000 XG에서 원심 분리하여 불용성 물질을 펠렛 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다.
4. 선택의 방법은 제조사의 프로토콜에 따라 (즉, bicinchoninic 산 (BCA), 쿠마 수정 로리 660 nm의 단백질 분석 등)으로 단백질 농도를 결정한다. 동일한 방법은 실험간에 비교할 수 결과를 달성하기 위해 지속적으로 사용되는 방법은 긴만큼 중요하지 않다.
5. 전기 영동 (PAGE)하는 폴리 아크릴 아미드 겔의 웰에 5 분 동안 95 ℃에서 시료를 가열 한 후 부하 램리 버퍼에 샘플 당 50 μg의 단백질을.
6. 1.5 시간의 PAGE 겔에 샘플을 Electrophorese 및 나일론 막에에서 분리 된 단백질을 전송합니다.
7. 비이어서 희석 항 CD63, 항 TSG-101와 같은 엑소 특이 항체 부화 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS-T)를 TBS 버퍼에서 5 % 무 지방 우유 멤브레인 (들)을 잠금 1 : 500, 바람직 O / N 4 ° C에서.
8. TBS-T 3 × 10 분으로 막을 세척 한 다음 실온에서 1-2 시간 동안 TBS-T에서 5 % 무 지방 우유에 HRP - 복합 이차 항체와 일치하는 적절한으로 품어.
9. 멤브레인 (들) TBS-T와 3 × 5 분을 씻고 제조 업체의 프로토콜에 따라 화학 발광 시약으로 특정 단백질을 검출한다.
10. 이미지 필름 제조자의 프로토콜에 따른 디지털 이미징 시스템 멤브레인.

격리 된 엑소 좀 5. 마이크로 RNA 분리

주 : 담즙 엑소 좀에서의 miRNA의 분리는 시판되는 키트에 기초하여 변형 된 miRNA의 분리를 사용하여 수행되지만, 기타 RNA 분리 방법이 사용되거나 적용될 수있다.

1. 추가 300# 181; 리터 용해 / (400 ㎕의 담즙에서 격리) 엑소 좀 펠렛, 소용돌이, 피펫 또는 완전히 균일 한 해물을 얻기 위해 엑소 좀을 용균하는 바늘 / 주사기 통과에 건물 버퍼입니다.
2. miRNA의 균질 현탁액 첨가제의 1/10 (30 μL) 볼륨을 추가하고 텍싱 또는 튜브 몇 시간을 반전하여 잘 섞는다.
3. 얼음에 10 분 동안 믹스를 품어.
4. 산 페놀의 볼륨을 추가 : 초기 균질 (300 μL)와 동일한 클로로포름.
5. 30 ~ 60 초 동안 5 5 fmol / μL CEL-은 miR 39 μL와 소용돌이를 추가합니다.
6. 10,000 RT는 수성 (위) 분리에 XG 및 유기 (아래) 단계에서 5 분 동안 원심 분리기.
7. 이전 볼륨을 지적하면서 조심스럽게 새로운 튜브에 피펫 및 전송하여 상위 단계를 대기음. 적절한 유기 폐기물 용기에 유기 상을 폐기하십시오.
8. 작은 RNA를 철저하게 TU을 텍싱 또는 반전에 의해 복구 된 수상에 1/3 볼륨 100 % 에탄올을 추가하고 혼합에 대한 풍부합니다여러 번합니다.
9. 피펫으로 한 번에 최대 700 μL의 필터 카트리지 상 해물 / 에탄올 혼합물.
10. 10,000 XG의 최대 15 초 동안 카트리지를 원심 분리기 또는 필터를 통해 혼합물을 통과 진공을 적용합니다.
11. 여액을 수집하고, 용 해물 / 에탄올 혼합물 700 μl를 초과하는 경우, 새로운 튜브에 관류 전송할 모든 여액을 수집하는 절차를 반복한다. 이러한 필터는 작은 RNA를 결여 RNA 분획을 포함하고 이러한 큰 RNA를 복구하는데 사용될 수있다.
12. 총 여과 액을 RT 100 % 에탄올의 2/3 볼륨을 추가하고 텍싱에 의해 철저하게 섞는다.
13. 피펫 제 2 필터 카트리지 상에 여과 액 / 에탄올 혼합물. 동시에인가 할 수있는 최대 부피는 700 μL 체감 전에.
14. 10,000 XG에 15 초 동안 원심 분리기 또는 단계 5.10에 설명 된대로 진공을 적용합니다.
15. 흐름을-통해 폐기, 여과 된 여과 물 / 에탄올 혼합물의 모든 때까지 반복합니다.
16. (700)를 적용(81) 상기 필터 카트리지 (L)의 miRNA 세척 용액 1, 5-10 초 또는 진공을 적용하고, 통과 물을 폐기 원심 분리기.
17. 단계 5.16에서 수행으로 500 ㎕의 세척 용액을 2/3로 필터를 씻으십시오.
18. 단계 516에서와 같이 세척을 세척액 2/3 500 μL로 두 번 반복하여 플로우 스루를 버리고 다시 포집 관에서 필터를 배치했다.
19. 필터 모든 잔류 유체를 제거하기 만 XG에서 1 분 동안 필터 카트리지 스핀.
20. 새로운 포집 관에 필터 카트리지를 전송하고, 필터의 중심 열 (95 ° C) 클레아없는 물 100 μL를 적용한다.
21. RNA를 복구하는 최대 속도로 20 ~ 30 초 동안 스핀 어셈블리.
22. 용출액을 수집하고 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장합니다.

결과

엑소 좀 일반 현미경에 의해 검출 또는 유세포하기에는 너무 작기 때문에, 전자 현미경 또는 나노 입자의 광학 분석이 수행되어야한다. 나노 입자의 광학 분석은 또한 정량적이고 크기 분포 및 농도를 제공하는 전자 현미경 위에 이점을 갖는다. 장비는 시료에 유리 프리즘을 통해 정밀하게 초점을 맞춘 레이저 빔을 소개합니다. 격리 소포 브라운 운동은 EMCCD 고감도 카메라로 캡처 프레임마다 추적한다. 나노 입자 추적 분석 (NTA) 소프트웨어 대책이 브라운 운동 프레임. 크기 모드 및 담즙 엑소 제제의 분포를 계산하는 프레임 (1) 인간 담즙 샘플로부터 단리 엑소 전형적인 NTA 분석의 결과를 나타낸도.

또는, 전자 현미경을 이용할 수있다도 2A는 인간으로부터 분리 엑소 담즙에...

토론

확실 담즙 분리 엑소 좀을 이용하기 위해, 창에 고품질의 샘플을 얻기 위해 일관된 고품질의 분리 방법을 채용하는 것이 중요하다. 이 논문에 정의 된 방법론은 인간의 담즙에서 엑소 좀과의 miRNA를 분리하는 잘 확립 된 방법입니다. 그것은 최소한 전자 현미경이나 나노 입자의 광학 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다 고립 엑소 좀의 특성 몇 가지 중요한 단계를 강조한다.

이 miRNA의 안정성에 관해서 엑소 좀의 분리에서 가장 중요한 단계는 적어도 가능한 빨리 신선한 담즙 처리하는 것이다. RT 또는 여러 동결 - 해동 사이클을 받고 저장하더라도 달리 격리 엑소 좀은 매우 안정한 반면 RT에서 전체 담즙 또는 하나의 동결 - 해동 사이클의 장기간 보관 크게 miRNA의 함량을 감소시킬 수있다. 한 문제의 샘플은 -80 ° C, 엑소 좀 미르의 성공적인 분리에 저장되어있는로담즙의 NA는 샘플에서 miRNA의 서명을 식별하는 데 좋은 재현성으로 수행 될 수있다. 초기에 적절한 miRN...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 & 마이크로; m 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터	Corning	431229
thinwall 폴리알로머 초원심분리기 튜브	Beckman Coulter	331374
SW40Ti 로터	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
나노 입자 추적 분석(NTA) 소프트웨어	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Complete Protease Inhibitor	Roche 유통 Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 항체	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871