Method Article

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제 헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 과발현 대장균 배치 모드에서

DOI:

10.3791/54043

⸱

June 18th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP)은 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)의 주요 독성 요소이다. 또한 H.에 중요한 역할을 파이로리는 호중구, 단핵구 및 비만 세포를 포함한 여러 선천성 백혈구 활성화에 의해 유도 된 위장 염증. HP-NAP의 면역 원성 및 면역 속성은 H.에 대한 잠재적 인 진단 및 백신 후보 확인 유문 및 암 치료 용 신약 후보. 임상 적 용도에 사용 그래피 HP-NAP 상당량을 얻기 위해서 효율적인 방법은 높은 수율과 순도의 단백질이 확립되어야 정제한다.

이러한 프로토콜에서는, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지를 이용하여 대장균 (E. 콜라이)에서 과발현 재조합 HP-NAP의 일 단계 제외 크로마토 그래피 정제 방법을 기술 하였다 (예., 세파 덱스)를 난n 개의 배치 모드. 재조합 HP-NAP는 E. 총 단백질의 약 70 %를 구성한다 대장균과 거의 완전히 pH를 9.0에서 세포 용해시의 가용성 분획에서 회수된다. pH가 8.0에서 최적의 조건에서, HP-NAP의 대부분은 언 바운드 분획에서 회수되는 반면, E.에서 내인성 단백질 대장균 효율적으로 수지에 의해 제거된다.

DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 E.에서 기능적 HP-NAP를 얻을 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 대장균. 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

헬리코박터 파이로리 (H. pylori의)는 위염 및 소화성 궤양의 주요 원인이다. 이 박테리아는 또한 암, 세계 보건기구 (WHO)의 일부 연구에 대한 국제기구에 의해 인간 발암 물질로 분류되어, 1994 년에 그것은 추정되었음을 H.의 보급 pylori 감염은 개발 도상국의 70 %와 선진국 (1) 30 ~ 40 %이다. 비록 H.의 감염률 파이로리는 산업화 된 국가에서 H.의 감염률을 감소 개발 도상국에서 파이로리는 여전히이 높다. 표준 치료는 H.을 근절하기 pylori 감염은 프로톤 펌프 억제제, PPI, 2 개의 항생제, 클라리스로 마이신 플러스 아목시실린 또는 메트로니다졸 (3)의 관리로 구성되어 있습니다. H. 항생제 내성 그러나, 상승 파이로리는 궤양 치료 O 방지하는 새로운 전략의 개발을 촉구 - 관련R 감염을 치료. H.에 대한 예방 및 / 또는 치료 백신 개발 H. 파이로리를 제어하는 대안적인 방법을 제공 할 수있다 pylori 감염.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 혈액은 국립 칭화 대학의 임상 시험 심사위원회, 신주, 대만의 사전 서면 동의 및 승인을 건강한 지원자에서 수집 하였다.

E.에서 재조합 HP-NAP의 1 식 대장균

  1. H.에서 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pET42a-NAP 준비 파이로리 26695 균주는 이전 16 설명했다. 설명 된 바와 같이 원하는 포인트 돌연변이 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 준비 (프로토콜, 단계 8 참조).
  2. E.에 상기 DNA 플라스미드 10 ng의 변형 대장균 BL21 (DE3) 42 ° C 45 초 동안 열 충격에 의해 유능한 세포, 행진 50 μg의 / ㎖ 카나마이신, 그리고 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 포함 판 한천 원성 국물에 세포 (LB).
  3. 50 μg의 / ㎖ 카나마이신과 LB 배지 5 ㎖를 포함하는 각각의 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 3에서 precultures로 성장170 rpm으로 진탕 16 시간 동안 11 ° C를.
  4. 1 L 플라스크를 50㎍ / ㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 200 ㎖에 상기 예비 배양 세포를 2 ㎖를 접종한다.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재조합 HP-NAP의 부정적인 정제의 실험 절차의 개략도는 E. 표현 배치 모드에서 DEAE 이온 교환 수지를 사용하여 대장균은도 1에 도시된다. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 네이티브 형태의 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분 (그림 2A와 B)에서 발견된다. 언 바운드 분획 정제 된 HP-NAP는 HP-NAP (그림 2C)에 대한 항체 immunodetected하고, 실버 염색 (그림 2D)에 의해 확인 된 순도 높은 97 % 이상이었다. 네이티브-PAGE (도 2B) 및 겔 여과 크로마토 그래피 (도 3a)에.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 제시 DEAE 음이온 교환 수지와 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피 E 대장균 과발현 재조합 HP-NAP의 정제에 적합하다. 세포 용해 및 정제의 단계에서 사용 된 완충액의 pH 값은 E.에서 HP-NAP의 용해도를 보장하기 위해 매우 중요 대장균 해물 각각 숙주 세포 불순물 재조합 HP-NAP를 효율적으로 분리. 균체을 pH 9.0에 용해되어야하고, 음의 정제는 높은 수율 및 고순도 HP-NAP를 획득하여 pH 8.0에서 수행되어야한다. HP-NAP의 전형적인 복구 90 %이고, 통상 95 % 순도는 24이다. HP-NAP가 결합되지 않은 부분에 존재하기 때문에, 상기 수지의 최소하지만 충분한 양의 불순물을 흡수하고 그것의 최대 용량을 달성하기 위해 사용되어야한다. 우리의 경우에는, 최대 부하 용량 E.에서 가용성 단백질의 1.5 mg을 밀리리터 수지 당 대장균 해물.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HWF와 YCY는 헬리코박터 파일로리 호중구 활성화 단백질의 원스텝 정제 방법에 대한 특허 TW I 432579 및 US 8,673,312의 발명자이다. 원고에 설명된 모든 자료는 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 저자는 이것이 데이터 및 자료 공유에 대한 JoVE의 모든 정책 준수를 변경하지 않음을 확인합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대만 국립 칭화대학교(National Tsing Hua University)의 Chao-Sheng Cheng 박사에게 원이색성 측정을 수행해 주신 것에 감사드립니다. 또한, 미국 메이요 클리닉(Mayo Clinic)의 에반티아 갈라니스(Evanthia Galanis) 박사와 이안코 D. 이안코프(Ianko D. Iankov) 박사에게 항-HP-NAP 단클론 항체를 제공해 주신 데 대해 감사드립니다. IRB 신청에 대한 조언을 제공해 주신 대만 신주 Mackay Memorial Hospital의 Han-Wen Chang 박사와 Chung-Chu Chen 박사님, 대만 신주 Mackay Memorial Hospital의 Te-Lung Tsai 씨에게 고립된 호중구 분석을 감독해 주신 분, 대만 국립 칭화 대학교의 Ju-Chen Weng 씨에게 기술 지원을 주신 데 감사드립니다. 이 연구는 대만 과학기술부(MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 및 NSC98-2311-B-007-006-MY3), 국립 칭화 대학교와 맥케이 기념 병원의 공동 연구 프로그램(100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) 및 국립 칭화 대학교의 연구 프로그램(104N2052E1)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials


List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
pET42a-NAP N/ARefernce 15 의 보충 데이터에 설명된 대로 작성된 N/A;
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher ScientificInc C6000-03https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
KanamycinAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)시그마-알드리치10837091001프로테아제 억제제
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-알파-토실-L-리시닐-클로로메틸케톤(TLCK)Sigma-AldrichT7254프로테아제 억제제
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-토실-L-페닐알라닌-클로로메틸케톤(TPCK)Sigma-AldrichT4376프로테아제 억제제
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
단백질 표준(소 혈청 알부민)Sigma-AldrichP5619 Bio-Rad 단백질 분석을 위한 표준 단백질
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– 세파덱스   A-25 염화물 형태Sigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
Spectrum/Por 투석 튜브Spectrum Laboratories132720분자량 컷오프 14kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® Mustang®가 있는 유닛; PallMSTG25E3내지 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
마우스 단클론 항체 MAb 16F4N/AN/A;   미국 메이요 클리닉의 에반티아 갈라니스(Evanthia Galanis) 박사와 이안코 D. 이안코프(Ianko D. Iankov) 박사의 선물
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200pgGE Healthcare Life Sciences28989335for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit,protein GE Healthcare Life Sciences17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Life Sciences17-1440-02인간 호중구 정제를 위한 밀도 구배 원심분리
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
평평한 바닥 96웰 흰색 플레이트Thermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511빛으로부터 보호
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
확장하다   긴 템플렛 PCR 체계시그마-알드리11681834001고충실도 PCR 효소 mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn I뉴잉글랜드 BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I뉴잉글랜드 BiolabsR0146S
https://www.neb.com/products/r0146-xhoiE. 대장균 DH5αThermo Fisher Scientific Inc18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
NameCompany제품 번호Comments
Equipment
 
U-2800 더블 빔 UV/VIS 분광 광도계Hitachi N/A는 시장에서 벗어나 새 모델로 업그레이드
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 고압 균질화기Avestin IncC315320http://www.avestin.com/English/c3page.html
히타치 코키 히맥 CP80WX 일반 울트라 원심분리기히타치 코키 90106401E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.htmlÄ에서 가용성 및 불용성 단백질 분획의 분리
를 위해; KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv 모델 62ADS CD 분광 광도계Aviv BiomedicalN/A시판 중단 및 새 모델로 업그레이드
http://www.avivbiomedical.com/circular.php LAS-3000 이미징 시스템FujifilmN/A단종 및 교체
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
화학발광 검출용Wallac 1420(Victor2) 다중 라벨 카운터Perkin-Elmer1420-018
, 내독소 제거를 위한 E membrane ; Refernce 23에 기술된 바와 같이 H. pylori 균주 NCTC 11637의 정제된 HP-NAP에 대해 제기된 1 범위의 유속으로 작동 http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HP NAP PurificationNegative ChromatographyDEAE Ion ExchangeBatch Mode PurificationRecombinant Protein ExpressionEscherichia coliProtein SolubilitypH OptimizationUltracentrifugationBradford Assay

Related Articles