Method Article

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

DOI:

10.3791/54050

⸱

June 26th, 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에는 마우스 피부의 유전자 라벨링, 외과적 탈신경, 피부 생검 및 전체 마운트 β-갈락토시다아제 염색에 의한 라벨링된 상피 시각화에 대한 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이러한 방법은 정상 및 병리학적 피부의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

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피부 체성 감각 신경은 피부에 작용하는 다양한 자극을 감지하는 기능을 합니다. 신경은 감각적 역할을 하는 것 외에도 최근 연구에 따르면 신경은 아토피 피부염, 건선, 암을 포함한 피부 질환을 조절할 수도 있다고 합니다. 여기에서는 피부 기계감각 기관인 터치 돔(TD)을 유지하는 데 필요한 신경에 대한 요구 사항을 테스트하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 구체적으로, 전체 마운트 염색을 통해 TD를 유전적으로 라벨링, 수확 및 시각화하는 방법과 마우스의 등쪽 피부에 편측 외과적 탈신경을 수행하는 방법에 대해 논의합니다. 이러한 접근 방식을 함께 사용하여 동일한 동물의 탈신경성 피부와 가짜 수술 피부에서 TD 형태와 유전자 발현을 직접 비교할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 피부 병리학의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 검사하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 피부를 반복적으로 샘플링할 수 있는 능력은 시작 후 다양한 단계와 시간에 질병 진행을 모니터링할 수 있는 기회를 제공합니다.

Introduction

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지난 몇 년 동안, 일반적으로 고전적인 신경병증1-4로 간주되지 않는 질병에 대한 신경의 영향에 대한 인식이 넓어지고 있습니다. 피부에서 최근의 실험적 증거는 감각 신경이 건선에서 암에 이르기까지 다양한 병리를 조절할 수 있음을 시사합니다5-9. 이것은 설치류의 외과적 탈신경 및 신경 기능의 약리학적 억제와 같은 기술을 사용하여 입증되었습니다. 건선의 경우, 이러한 연구는 신경 기능 상실 후 인간 건선 플라크가 퇴행하는 이유를 이해하기 위한 기계론적 틀을 제공했습니다7,10-12.

피부 신경은 유전자 발현에도 영향을 미칠 수 있으며(13,14) 정상 피부의 메카노센싱(mechanosense)에 결정적이다15. 특히, 터치 돔(TD) 상피는 1형(SA1) 신경 섬유를 천천히 적응시켜 신경내분비 메르켈 세포와 병치된 원주 표피 세포 패치로 구성됩니다16-18. TD는 가벼운 촉각 감각을 매개하고 고슴도치 경로 활동을 나타내는 것으로 나타났습니다5,19. TD 유지는 신경분포에 의존한다20,21, 신경은 정상적인 TD와 그와 관련된 메르켈 세포를 유지하기 위해 고슴도치 리간드를 분비하기 때문....

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Protocol

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이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물 의학에 대한 미시간 단위의 대학 설립 규정에 따라 수행되었다.

1. 마우스의 유전자 재조합을 유도

참고 : Gli1 TM3 (CRE / ERT2) ALJ / J 마우스 변형 (Gli1-CreERT2) (13)는 상피를 TD하기 위해 타목시펜에 의한 유전자 재조합의 대상으로 할 수 있습니다. Gli1를 생성하는 B6.129S4-GT는 (ROSA) 26Sor tm1Sor / J 기자 마우스 (LacZ를) (22)이 변형 크로스, LacZ를 동물 전체 마운트 아래 염색에 의해 TD 세포를 시각화 할 수 있습니다.

  1. 옥수수 유 12.5 ㎎ / ㎖의 농도로 타목시펜 용액을 준비한다.
    1. 1.5 ML 튜브에서 결정 타목시펜의 20 ㎎, 옥수수 기름을 1 ml의까지 추가 할 수 있습니다. 타목시펜이 완전히 (2-4 시간)에 용해 될 때까지 단단히 같이 와류 믹서에 튜브 및 RT에서 가장 높은 설정에서 지속적으로 소용돌이를 테이프타목시펜 미립자의 부재에 대한 해부 ....

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Results

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생성 타목시펜 - 유도 Gli1 CreERT2 - 발현 생쥐와 LacZ를 리포터 대립함으로써, TD 상피를 시각화하고 시간이 지남에 따라 이들 세포의 운명을 추적 할 수있다. 전체 탈 신경 절차는 통상적으로, 마우스 당 1 시간 내에 완료 될 수 있고, 동물에게 최소의 고통을 야기한다.

5,19 - 우리의 이전 연구는 신경이 정상 TDs를뿐만 아니라 관련 각질 8 + 메르켈 세포 (C도 3a)을 모두 유지하기위한 중요한 것을 나타낼. 신경도 TD (그림 3D)에 Gli1 식을 촉진하기위한 중요하다. 피부 (그림 1B)에 걸쳐 TD 클러스터의 비교적 드문 .......

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Discussion

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신경은 감각에서뿐만 아니라 포유류의 장기 개발, 유지 보수 및 재생 13,24-27에서뿐만 아니라 중요한 기능을 제공합니다. 신경 최근 다양한 피부 질환에 연루되어있는 바와 같이, 여기에 설명 된 기술은 동물 질병 모델의 다양한 신경 분포에 대한 요구 사항을 연구하는데 사용될 수있다. 사실, 일방적 탈 신경 기술은 동일한 마우스에서 손상 또는 파괴 신경 중 하나와 피부의 직접적인 비교를 할 수 있습니다. 후속 데이터가 짝 t 검정을 활용하여 분석이 동물 대 동물 차이를 보상하기 위해 이상적인 내부 제어를 제공한다.

여기에 설명 된 절차를 크게 LacZ를 리포터 유전자를 이용할 수 있지만, 이러한 실험은 Gli1-CreERT2 대립 유전자는 TD에서 유전자 발현을 변경하기 위해 다른 형광 리포터 또는 조건부 대립 유전자와 결합되도록 구성 될 수있다. 예를 들면 Gli1-CreERT2 생쥐 교차 할 수있다타목시펜.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 쥐 사진 촬영에 도움을 준 Autumn Peterson, 쥐에 도움을 준 Daniel Thoresen, 외과적 탈신경에 도움을 준 Nicole Ward 박사와 Abdelmadjid Belkadi 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 자금 지원(R00AR059796 및 R01AR065409 보조금)의 지원을 받았습니다. 미시간 대학교 피부과학과; 생물 과학 학자 프로그램; 유기 형성 센터(Center for Organogenesis); 미시간 대학교 종합 암 센터; John S. and Suzanne C. Munn 암 기금. S.C.P.는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 자금 지원을 받았습니다(보조금 T32 GM007315). 이 연구는 또한 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 암 연구 센터(Center for Cancer Research)의 NIH 교내 연구 프로그램(NIH Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
알코올 준비 패드PDIB339
AnaSed (Xylazine)LloydNADA 139-236
항체, 항 케라틴 8발달 연구 Hybridoma BankTROMA-I쥐 항체, 1:500 농도에서 사용
항체, 항 케라틴 17세포 신호 전달# 4543토끼 항체, 1 : 1,000 농도에서 사용
항체, 항 신경 필라멘트세포 신호C28E10토끼 항체, 1:500 농도에서 사용
베타딘 준비 패드MedlineMDS093917
Carprofen (Rimadyl)Zoetis
무선 충전식 클리퍼Wahl트리머 모델 8900
옥수수 기름Sigma-AldrichC8267
저온 유지 장치LeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD13061:1,000 농도에서 사용
데옥시콜레이트시그마-알드리치D6750
탈모 크림Nair N/A
디메틸포라미드시그마-알드리치319937
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마-알드리치D8418
글루 타르 알데히드시그마 - 알드리치G5882
ImmEdge 펜벡터 연구소H-4000
케타민 HClHospiraNDC 0409-2051-05
염화 마그네슘시그마M8266
마이크로 커버 유리VWR48404-454
마이크로 슬라이드VWR48311-703
10% 중성 완충 포르말린VWRBDH0502-4LP
6-0 나일론 봉합사DemeTECHNL166012F4P
옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜시그마-알드리치I8896
OCT 화합물사쿠라 티슈-텍4583
파라포름알데히드시그마-알드리치158127
포타슘 페로시아나이드시그마-알드리치P9387
포타슘 페리시아나이드시그마-알드리치702587
인산나트륨 일염기시그마-알드리치P9791
인산나트륨 이염기성 시그마-알드리치S5136
자당시그마-알드리치84097
타목시펜시그마-알드리치T5648-1G
초미세 집게Dumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001사용 전에 디메틸포라마이드에 용해시켜 50배 스톡 생성
성

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woo....

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