Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

Summary

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Abstract

큰가시 고기 생선은 형태 학적, 생리의 다양한 유전 적 기초를 공부하는 강력한 시스템, 행동 표현형로 ​​떠오르고있다. 해양 및 민물 형태를 교차 할 수있는 능력과 결합 해양 인구 수많은 담수 환경에 적응로 진화 현저 다양한 표현형은 유전자가 형질 발전 제어하는​​ 게놈 영역을 매핑하는데 사용될 수있는 드문 척추 시스템을 제공한다. 우수 게놈 자원 진화 변화의 분자 유전 학적 해부을 용이하게 사용할 수 있습니다. 맵핑 실험 흥미 후보 유전자의리스트를 생성하지만, 기능적 유전자 조작은 유전자의 역할을 테스트하도록 요구된다. 유전자 조절은 TOL2 트랜스의 시스템을 이용하여 게놈에 통합 된 트랜스 제닉 리포터 플라스미드와 함께 BAC에 조사 할 수있다. 특정 후보 유전자 및 시스 - 규정 요소의 기능은 타겟 유도함으로써 평가할 수있다TALEN 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시약 돌연변이. 모든 방법은 수정 된 하나의 셀 큰가시 고기의 배아로 핵산을 도입 필요, 작업이 큰가시 고기 배아의 두께 융모막과 상대적으로 작고 얇은 할구로 도전했다. 여기서, 큰가 배아 내로 핵산 마이크로 인젝션에 대한 상세한 프로토콜은 트랜스 제닉 게놈 편집 유전자의 발현 및 기능을 연구하는 응용뿐 아니라 형질 전환의 성공 여부를 평가하고 안정한 선을 복구하는 방법에 대해 설명한다.

Introduction

생물 다양성은 자연에서 진화 된 표현형 변화의 유전 개발 기지를 결정하는 발생 방법을 이해하는 하나의 기본 구성 요소입니다. 큰가시 고기 생선, Gasterosteus aculeatus는 진화의 유전 적 기초를 공부하는 우수한 모델로 떠오르고있다. 큰가시 고기과 해양 물고기가 북반구의 주위에 수많은 민물 환경을 식민지 것처럼 극적인 형태 학적, 생리 학적 결과, 많은 적응 진화 적 변화를 겪고, 그리고 한 행동 변화 ^1. 스물 한 큰가 집단에서 개인의 게놈 서열 조립 및 고밀도 링크 맵은 상기 조립체 ^2,3-을 개선하기 위해 생성되어왔다. 유전자 맵핑 실험은 진화 표현형 ⁴ 기본 게놈 영역을 식별 한 ^{6 -,} 몇 가지 경우에, 특정 후보 유전자의 기능적 역할 ^7,8 테스트 한. 형태 학적 변화를 기본 게놈 영역의 숫자는 유망한 후보 유전자로 확인되었다, 그러나이 후보는 아직 기능적으로 ⁹ 테스트되지 않은 ^{- 12.} 또한, 큰가시 고기과 인구 유전학 / 유전체학 ^{(13, 14),} 분화 ^(15), 행동 ^(1), 내분비학 ^(16), 생태 독성학 ^(17), 면역학 ^(18)와 기생충학 ^(19)의 연구를위한 일반적인 모델입니다. 각 필드에서의 앞으로의 연구는 큰가시 고기과의 기능 유전자 조작을 수행하는 능력에서 이익을한다. 이들 코딩 서열의 조작에 더하여, 후보 유전자의 역할은 시스 - 규정 시퀀스를 연구함으로써 기능적 증가 감소 또는 후보 유전자의 발현을 제거함으로써 평가 될 수있다. 큰가시 고기과에 미세 주입 및 형질 전환 방법은 잘 ^7,8,20를 설립하고 처음 사용하여 개발 하였다 meganuclease 매개방법 ^(21)는 첫 번째 송사리 ^(22)에 설명. 여기에 제시된 개질 미세 주입 방법은 모두 TOL2 매개 된 형질 전환에 최적화 최근 TALENs 및 CRISPRs 포함한 게놈 편집 시약을 개발되었다.

시스 규정하는 요소에 대한 변경 사항은 시스 규정하는 변화는 돌연변이 ^(23)를 코딩의 부정적인다면 발현 결과를 피할 수로, 형태 학적 진화에 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 추정 시스 규정하는 순서를 테스트하고 비교하는 진화 연구의 증가의 중심 목표되고있다. 또한, 대부분의 인간 질병 변형 심하게 시스 규정하는 기능 소자 및 로직을 연구하는데 필요한 규제 변이체 ^{24, 25} 및 모델 척추 시스템이다. 많은 수의 외부에 자신의 배아를 비옥 물고기 시스 -regulation을 연구하는 강력한 척추 시스템을 제공합니다. 외국 ì되는 TOL2 트랜스포존 시스템게놈에 통합 할 GN DNA가 TOL2의 트랜스가 사이트와 바인딩에 의해 형벌되고, TOL2의 트랜스 mRNA의와 공동 주입 성공적으로 플라스미드 물고기 유전체 ^(26)에 구축 통합하는 높은 효율로 작동 ^{- 28.} 일반적으로 잠재적 인 증강은 TOL2 백본에서 (예 : hsp70l ^29)를 기초 프로모터 및 형광 리포터 유전자 등 EGFP로 (강화 된 녹색 형광 단백질) 또는 mCherry의 상류 복제 및 트랜스의 mRNA ⁽²⁶⁾ 주입된다. 형광 기자의 어느 주입 배아 또는 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 가진 자손의 표현의 관측은 추정 증강에 의해 구동 유전자 발현의 시공간 규제에 대한 정보를 제공합니다. 상기 실험에서 검증 증강은 관심 유전자의 조직 - 특이 과발현을 유도하는데 사용될 수있다.

큰 시스 규정하는 지역의 분석, 고품질의 대형 삽입 genom에 대한세균 인공 염색체 (BAC에)를 사용하여 IC 라이브러리는 모두 해양 및 담수 큰가시 고기과 ^(30)로 구성되어있다. 이들의 BAC는 큰 (1백50-2백킬로바이트)의 맥락에서 형광 리포터 유전자의 게놈 영역 ^(31)을 가진 유전자를 대체 recombineered 수있다. 는 BAC 내의 조절 서열에 의해 결정되는 형광 리포터이어서 시공간 패턴으로 표현된다. 물고기 연구 내용 TOL2 사이트 게놈 통합 ^(32,33)를 용이하게하기 BAC에 첨가 될 수있다. 개발의 후기 단계 계내 혼성화에 기술적 도전에서 BAC 형광 판독 큰가 뼈 형태 형성 단백질 6 (Bmp6) ^(20)에 대해 도시 된 바와 같이, 유전자 발현의 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. 또한, 각각의 형광 발현 패턴 계내 혼성화에 달성 될 수없는 시간에 걸쳐 추적 될 수있다. BAC에 또한 additiona을 추가하는데 사용될 수있다게놈 영역의 L 사본은 관심의 유전자의 복용량을 증가시킵니다.

유전자 기능 연구를 위해, 게놈 편집 유기체 ^(34)의 다양한 게놈 서열을 타겟팅하는 변화를 생성하는 데 사용될 수 폭발적으로 확장 필드이다. 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)는 원래 정확하게 선택의 게놈 시퀀스에 직접 결합하여 이중 가닥이 ^{35, 36을} 깰 생성하도록 설계 될 수있다 식물 병원균으로부터 분리 모듈, 순서 특정 뉴 클레아 있습니다. 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR)은 / CAS 시스템은 원래 세균에서 찾을 수 있으며, 상기 가이드 ^(37)에 상보적인 표적 DNA 서열의 틈을 발생하도록하는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 사용 하였다. 종종 TALENs 및 CRISPRs 모두에 의해 생성 된 이중 가닥 나누기 후속 보수는 표적 서열의 기능을 방해 할 수있는 작은 삽입 또는 결실을 남겨35-37. 큰가시 고기과에서 TALENs는 인핸서 ^(20)를 대상으로 유전자 발현을 방해하는 데 사용되었으며, TALENs 및 CRISPRs 모두 성공적 서열 (미공개 데이터)를 코딩 돌연변이를 생산 하였다. 제브라에 사용 CRISPRs의 생성에 대한 상세한 프로토콜은 큰가시 고기과 ³⁸ CRISPRs을 개발하는 지침으로 이용 될 수있다.

형질 전환 및 게놈 편집 실험 새로 수정 된 하나의 배아 세포 내로의 핵산의 도입을 필요로한다. 초기 발달에서 유전자 또는 게놈 편집 툴을 도입함으로써, 배아 유 전적으로 조작 딸 세포의 수를 최대화한다. 주입 된 배아는 시각적으로 형광에 대한 검사 또는 분자 게놈 수정에 대한 상영된다. 항체 2.12.1fx에 기여하는 세포를 타겟으로하는 경우, 형질 전환 또는 돌연변이 포스트 분사 치사율이 높은 경우에도, 자식들의 서브 세트로 전달 될 수있다. 모자이크 물고기 outcrossed 할 수 있습니다 또는교차하고 그들의 자손은 돌연변이 대립 유전자 또는 관심의 안정적 통합 된 형질 전환 유전자를 복구하는 상영. 이 프로토콜은 하나의 셀 큰가시 고기의 배아에 유전자와 게놈 편집 시약을 도입하고 성공적으로 게놈 수정에 대한 모니터링하기위한 방법을 설명합니다.

Protocol

모든 물고기 작품은 캘리포니아 버클리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 R330)에 의해 승인되었다.

1. 사출에 대한 핵산을 준비

1. (피셔 ^(26)에서 적응) TOL2 플라스미드 형질 전환.
   1. 선형화 37 ° C에서 1 시간 동안 제공된 버퍼에 10 μg의 트랜스 플라스미드 (PCS-TP) 10 U를 NotI ^{39 컷.}
      주 : 재료 전송 계약은 TOL2 플라스미드를 취득해야 할 수 있습니다.
   2. 표준 프로토콜 ^(40)에 따라 나트륨 아세테이트 이소 아밀 알코올과 에탄올 침전 : 클로로포름 : 24 : 페놀의 1 혼합물 컷 25와 플라스미드의 압축을 풉니 다. 50 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물에 재현 탁 플라스미드.
      주 : 페놀 - 클로로포름을 후드에 사용되어야하며, 폐 적절히 기관 가이드 라인에 따라 배치되어야한다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 SP6 전사 반응을 설정합니다.
   4. RNA의 ISOL를 사용하여ATION 키트는 제조업체의 지침에 따라 전사 반응을 정리하는 단계; 50 μL의 RNase없는 물에 RNA를 재현 탁.
   5. RNA의 1 μl의 나누어지는을 제거합니다. 5 분 동안 65 ° C에 열 차 구조를 즉시 얼음에 진정 변성합니다. -80 ° C에서 전사 반응 잔존 동결.
   6. 하나의 차선에 RNA 크기 표준 완충액을 실행 0.5X TAE 1 % 아가 로스 겔 (트리스 염기, 아세트산, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산)의 RNA 분취을 실행. 예상되는 제품은 2,200 bp의이다; 총 RNA의> 5 % 광범위한 저하를 나타내는 스미어보다 작은 2,200 BP (그림 1)에서 나타나는 경우 폐기하십시오.
   7. 260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화. -80 ° C (적어도 2 년 동안 좋은) 350 NG /의 RNA 분해 효소가없는 물을 저장 한 ㎕를 분취 액에 μL로 희석.
   8. 복제 TOL2 기자 플라스미드 시스와 함께합니다 (TOL2 키트 ^{(41)로부터} pT2HE ⁸ 플라스미드를 사용하여 실시 예에 대한)- 관심의 규제 요소입니다. 간략하게, PCR은 플라스미드에 위치한 제한 효소 부위를 포함하는 프라이머와 관심의 게놈 DNA 서열을 증폭하는 효소 (들), 벡터에 삽입을 결찰 가진 PCR 산물과 벡터를 소화하고 유능한 E.으로 얻어진 플라스미드 변환 대장균 ^40. 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신 린스를 포함하는 키트에 플라스미드를 분리.
   9. 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트로 TOL2 플라스미드의 두 번째 정제를 수행한다. 30 μL의 RNase없는 물에 용출.
      주 :이 단계로부터의 수율이 낮을 수있다 (입력 플라스미드 때로는 50 % 미만).
   10. 의 RNase없는 물 ~ 125 NG / μL에 플라스미드를 희석.

그림 1. 트랜스 mRNA의 젤. 정제 된 전사 반응 프로덕트 (1 μL)를 왼쪽으로 표시되며, 65 ° C로 가열하여 얼음 냉각 및 0.5X TAE 100 V.에서 킬로베이스의 RNA 래더의 크기 (KB)에 버퍼를 실행하는 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 하였다 . 전체 길이 트랜스 mRNA의는 ~ 2.2 킬로바이트에서 밝은 밴드이다. 성능이 저하되거나 불완전한의 mRNA의 작지만 허용 금액은 2.2 킬로바이트 아래에 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. BAC 형질 전환 (BAC Recombineering 기술에 대한 Suster ^{32, 33 참조)}
   1. E.에서 BAC 준비 대장균은 제조사의 프로토콜에 따라 BAC 정제 키트를 사용. 의 RNase없는 물 ~ 250 NG / μL에서 표준 나트륨 아세테이트 - 에탄올 추출 ^(40)에 resuspend의 DNA와 DNA를 복구하는 에탄올 침전을 사용합니다.
   2. 섹션 1.1에서와 같이 트랜스 mRNA의를 준비합니다.
3. TALENs와 돌연변이 유도 (참조 Cermak
4. 관심 ^(42)의 유전자 TALENs를 디자인하는 웹 기반 응용 프로그램을 사용합니다. 가능하면, 디자인 TALENs 분자 분석을 용이하게하기 위해 제한 효소 절단 부위를 방해한다.
5. 전사 복제 TALENs 및 준비 플라스미드 프로토콜 ^35을 발표 다음.
6. 제조업체의 지침에 따른 SP6 전사 반응을 TALEN의 mRNA를 전사 및 섹션 1.1.4에서 트랜스에 기재 한 바와 같이 mRNA의 정리. 분광 광도계로 정량화 된 RNase없는 물 200 NG / μL로 희석. 그것은 적절한 크기와 단계 1.1.6의 설명에 따라 저하되지 보장하기 위해 겔에 TALEN의 mRNA를 실행합니다.
7. 프라이머 디자인 툴 및 표적 DNA 서열 ^43를 사용하여 TALEN 표적 서열을 둘러싸는 대략 100-200 bp의 PCR 증폭하기 위해 프라이머 쌍을 디자인. 단계 1.3.1에 ​​기초하여 표적 부위에서 병변을 시험하는 적절한 제한 효소를 주문한다.

CRISPR 형질 전환 (탈보트 디자인과 CRISPRs의 준비를위한 Amacher ^{38 참조)} :

1. 설계 및 준비 CRISPRs 및 Cas9 mRNA의 프로토콜 ^(38)에 따라, 주문 적절한 검증 프라이머 및 제한 효소로 단계 1.3.4에 설명.

사출 시약을 준비 (2)

1. 아래에 설명 된대로 사용 붕규산 모세 혈관은 바늘을 준비합니다.
   주의 : 이러한 모세관 제브라 미세 주입에 사용되는 표준 모세관 없으며, 터프 큰가의 융모막 천공에 중요한 두껍고 강한 유리로 만들어진다.
   1. 항상 바늘을 당기는 때 니트릴 또는 라텍스 장갑을 착용하고, 바늘이 피부 나 피부 오일에 문의 할 수 없습니다.
   2. 마이크로 피펫 풀러 제조업체의 지침에 따라 램프의 시험에 의해 경험적으로 마이크로 피펫 당기는 매개 변수를 확인합니다. 예를 들어, 박스 필라멘트 다음 파라미터 억제했다최적으로 채굴 : (열 = 515, = 지연 = 85, 압력 = 500 속도 = 60 (60)을 당겨). 이러한 설정은 가파르게 약 12 ~ 2mm에 대한 °와 약 ~ 6mm (그림 2) 2 °를 테이퍼 후 긴 확장을 테이퍼 바늘을 생산하고 있습니다.
      참고 : 적절한 매개 변수를 풀러와 필라멘트에 따라 다양하고, 맹목적으로 영구적으로 어렵고 교체 비용이 풀러의 필라멘트를 파괴 할 수 램프 테스트를 통해 첫 번째 매개 변수를 결정하지 않고 프로그램을 사용합니다.
   3. 제조업체의 지침은 2.1.2에서 결정된 설정 붕규산 유리에서 적어도 4 마이크로 피펫 바늘을 끌어 따릅니다.
   4. 수직 날카로운 끝이 아래를 향 모세관 저장 항아리에 보관 바늘.
   5. 주입 전에 바늘을 진정 얼음에 모세관 저장 항아리를 배치합니다. 바늘가 작성되면 증발을 방지하기 위해 항아리에 축축한 종이 타월의 조각을 추가합니다.
2. 계란 (모든 비료RT에서 수행 단계)
   1. 부드럽게 복부를 조이고 배설강을 통해 35 × 10 ㎜ × ² 페트리 접시에 계란을 밀어 방향을 후부하기 위해 전방에 쓰다듬어에 의해 임신하는 여성 큰가시 고기에서 스트립 달걀 클러치. 습도 챔버를 만들기 위해 페트리 접시의 한면 (계란을 터치하지 않음)에 종이 타월의 촉촉한 조각을 추가합니다. 계란 촉촉한 머물 수 있도록 페트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.
   2. 0.1 %의 중탄산 나트륨으로 완충 0.025 % Tricaine-S에서 남성 큰가를 안락사.
   3. 복부를 엽니 다 잘라 고환을 제거하고 250 μL 행크의 솔루션 (행크의 솔루션 준비를위한 전체 프로토콜에 대한 웨스 ^{44 참조)에} 담가서 부드럽게.
   4. 50 μl의 정자 솔루션으로 최대 100 계란을 기름지게하고 부드럽게 모든 계란이 수정 된되도록하는 피펫 팁 함께 저어. 클러치> 100 알 경우, 모든 배아 주입시 한 세포 단계에서되도록 나중에 계란의 절반 비료. 계란은 미 수정 남아있을 수 있습니다실온에서 한 시간까지, 그리고 정자는 일반적으로 행크의 솔루션에 4 ° C에서 1~7일 동안 지속됩니다.
   5. 건조를 방지하기 위해 수정 한 후 페트리 접시 뚜껑으로 덮여 배아를 유지합니다. 등장 (이 시간 동안 주입 재료를 준비)를 팽창 첫 번째 셀에 대한 20 ~ 25 분을 허용합니다.
   6. 큰가시 고기의 물 150mm X 15mm 페트리 접시를 입력합니다. (큰가 물하려면 먼저 추가한다. 3.5 g 인공 해수 혼합물을 탈 이온수에 용해시키고 10 % 중탄산 나트륨을 제조 및 0.217 ml의 10 %의 중탄산 나트륨을 증류수 1 L 당 및 교반 / 염을 용해 격렬히 흔들어).
3. (계란 비료로있는 동안) 주입 솔루션을 준비
   1. 얼음에 표 1 및 저장에 따른 주입 솔루션을 준비합니다.
      참고 : 일부 핵산의 농도 인해 큰가시 고기의 할구의 증가 볼륨에 제브라 피쉬 용으로 제작 된 그 증가하고있다.

시약	TOL2 주입	BAC 주입	TALEN 주입	CRISPR 주입
TOL2의 mRNA	350 NG	350 NG	-	-
DNA	150-200 ng의 플라스미드	200-300 NG의 BAC	-	-
TALEN의 mRNA	-	-	200 ng를 각	-
CRISPR 가이드 RNA	-	-	-	200 NG
Cas9의 mRNA	-	-	-	400 NG
0.5 % 페놀 레드 inDulbecco의 PBS	0.5 μL	0.5 μL	0.5 μL	0.5 μL
RNAse가없는 물	5 μL에	5 μL에	5 μL에	5 μL에

표 1 :. 사출 시약 모든 혼합물을 5 μL의 총 부피를 준비하고 얼음에 보관해야합니다.

4. (; 바늘을 채우기 위해 적어도 10 분을 허용 얼음에) 바늘을 입력합니다.
   1. 바늘 모세관 저장 용기 수직 매달려있는 동안 바늘의 무딘 선단에 0.5 μl를 주입 용액을 피펫 팅하여 적어도 세 개의 바늘 백필. 드롭은 상단에 유지하고면을 아래로 물방울과 거품을 피하지 않는 것을주의하십시오.
   2. 적색 액체는 주로 니들의 뾰족한 선단에 배출 한 후, 바늘의 평활 말단에 다른 0.5 μL를 추가하고 배출 할 수있다.

3. 미세 주입에 대한를 주입 조작과 바늘을 준비

참고 :이 단계에 c은 일반적으로 계란을 시비 후에 수행 될 수있다.

1. 해부 현미경 transillumination 라이트를 켜고 15cm 석고 현미경 빛베이스에 ~ 13cm X 13cm의 유리 기판을 배치 유리 플레이트 ^(7)의 상단에 블레이드를 보았다. 바늘 홀더 향 압흔 함께 사출 장치에 수직 한 방향 톱.
2. 공기 공급 장치의 전원을 켜고 압력이 레귤레이터 ~ 200 kPa로 설정되어 있는지 확인합니다.
3. 컨트롤 박스의 전원을 켜고 설정을 조정합니다. 설정 압력 ~ 150-175 kPa로한다. 180 밀리 초에 분사 기간을 설정합니다.
4. 바늘 홀더를 풀고 고무 홀더의 저항이 느껴질 때까지 홀더로 채워진 바늘을 삽입하고 단단한 손가락까지 조입니다.
5. 약 45 °에 바늘의 각도를 조정합니다.
6. 말은 시야의 중심에 있도록 바늘을 조정하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다. ~ 40 배 배율로 확대와 접촉해서는 안 바늘의 끝 부분에 초점아래의 유리.
7. 부드럽게 시계의 집게와 함께 잡고 바늘의 팁을 휴식. 이상적으로, 수직으로 침입하지 않지만, 오히려 ~ 60 ° 각도로. 가까운 팁 (이하 2-3 집게 폭 멀리 끝에서, 그림 2)에 휴식.

그림 2. 온전한 및 깨진 미세 주사 바늘. 상단 바늘이 끊어지지하고 아래 바늘의 끝은 집게 (화살표)로 세분화되었습니다. 바늘 0.05 % 페놀 레드를 함유하는 용액으로 충전된다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 바늘이 고장 여부를 테스트하기 위해 주입 풋 페달을 여러 번 누르십시오. 몇 도청 후 작은 빨간 방울 t 나올하기 시작한다그는 끝. 그렇지 않은 경우, 약간 높은 바늘을 파괴하려고합니다.
9. 바늘이 기포가있는 경우, 배압 유닛을 증가시키고 기포를 작동 페달 빠르게 여러 번 누른다.
10. 뒤로 압력 조정 :
    1. 유리판에 큰가 물 몇 방울을 배치하는 일회용 전달 피펫을 사용한다.
    2. 조심스럽게 물에 바늘을 낮 춥니 다.
    3. 분홍색 액체의 희미한 스트림 (양의 압력을 나타내는) 바늘에서 나온다 때까지 다시 압력을 높입니다.
       주 : 충분한 배압이 없으면 바늘이 모세관 작용에 의해 세포질을 그리는 것이다. 너무 배압이있는 경우, 주입량은 너무 큰 실수 일 수있다.
    4. 가능한 한 배아를 준비하는 동안 손상되​​지 않도록 바늘을 후퇴 (아래 참조).
11. 액체의 일정한 강한 스트림 바늘 w를 종료하도록 선택적으로, 더 높은 압력 설정에 배압을 조절암탉이 물에 잠긴된다. 이어서, 주입 풋 페달을 가압하는 것은 불필요하다; 그러나, 주사를 통해 주입을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다.
    참고 : 첫 번째 주입 배울 때이 기술을 시도하지 마십시오.

4. 미세 주입

1. 수정 후 약 25 분, 유리 플레이트 클러치 및 전송 5-10 배아를 제거하기 위해 2 개의 10 μL 피펫 팁을 사용합니다.
2. 아직도 부드럽게 톱날의 개별 들여 쓰기로 배아를 분리, 피펫 팁을 사용. 배아에 구멍을하지 않도록주의하십시오.
3. 끝 전송 피펫 너무 큰가시 고기 배아는 내부에 맞는 잘라 사용, 배아를 충당하기 위해 충분히 큰가시 고기의 물을 넣어 3-5 초 후 물 코팅의 작은 볼륨을 떠나 피펫으로 과량의 물을 제거에 물을 떠나 각각의 배아.
   너무 많은 물이 chorions을 강화하고 바늘을 중단하게됩니다 만, 물을 작은 볼륨이 채널을 들어 올릴 필요가있다 참고 :멀리 세포와 노른자에서 오리온 (그림 3A - B).
4. 멀리 배아 먼부터 유리판을 밀어 최초의 배아는 시야의 약 25 %를 채우도록 확대합니다.
5. 시야에 바늘을 내린 다음 부드럽게 할구, 노른자 (그림 3B)의 상단에 세포질의 거친, 약간 노란색 제기 범프를 식별하기 위해 배아를 회전 한 다음 있도록 회전 10 μL 피펫 팁을 사용 (톱날,도 3c의 압입에서 배아를 유지하면서)이 바늘 할구의 단부에 수직 바로.
   참고 : 난황 액 배아가 회전으로 ​​이동할 수있다, 그래서 할구의 위치에 대한 참조 프레임으로 사용하지 않습니다.
6. 세포질에 바늘을 낮 춥니 다하지만 기본 노른자를 통해 밀어하지 않습니다. 바늘을 깨는 피하기 위해 융모막을 관통 할 때 천천히 고르게 압력을 적용합니다. 경우]바늘 굴곡이 심한, 철회와 약간 다른 위치에 다시 시도하십시오.
7. 약간 확산 가장자리와 붉은 덩어리가 세포질의 약 ~ 팔분의 일 직경을 채우도록 주입하기 위해 발 페달을 3 ~ 4 회 우울 (그림 3D 참조).
   1. 세포질 (그림 3E) 아래 노른자에 주입을 나타냅니다, 확산 시작하지 않는 날카로운 모서리와 붉은 덩어리를 획득하지 마십시오.
   2. 밝은 분홍빛이 도는 붉은 반점이 빠르게 확산하면 할구에 구멍에 더 바늘을 삽입합니다.
   3. 사출 러스 즉시 노란색으로 변 경우, 다시 (그림 3 층) 대상이 된 할구을 보장하고 주입하는 배아를 돌립니다.

큰가시 고기의 배아 그림 3. 외관 전과 주입 후. 모든 배아는 일에서 작성한 것임(C '와 G 제외) 현미경을 통해 내려다보고의 전자 관점입니다. (A) 물을 추가하기 전에 수정 된 배아는 노른자의 상단에 떠있는 기름 방울과 균일 한 모양을 가지고있다. 노른자에서 돌출 및 프로필에서 볼 수있는 할구를 공개, 물은 융모막 팽창을 추가 한 후 (B). 배아의 (C) 회전되도록 바늘은 융모막과 할구에 수직으로 들어갑니다. (C ') 세포질의 팁과 융모막을 천공 한 바늘의 측면보기. 시간이 지남에 따라 퇴색 확산 가장자리에 붉은 반점에서 세포질 결과에 (D) 주입. 정의 가장자리에 붉은 반점에서 세포질 결과를 기초 노른자로 (E) 주입. 황색 적색에서의 pH에 의한 색상 변화에 세포질 결과 반대 노른자로 (F) 주입. (G) 측면서브 이상적인 주입 위치를 통해 X가 함께 주입 결과의보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 이 바늘로 찌르는 경우 배아를 누르고 10 μL 피펫 팁을 사용하여 바늘을 철회하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다.
9. 바늘이 후퇴 한 후, 바늘 다음 배아를 정렬 유리판 슬라이드.
10. 모든 배아를 주입 한 후, 큰가시 고기의 물이 가득 150mm 배양 접시에 전송 피펫과 장소에 다음 배아에 물을 추가 수집하는 전송 피펫을 사용합니다.
11. 너무 많은 물을 축적하는 것을 방지하기 위해 종이 타월 유리판을 건조.
12. 톱를 반복 4.10 통해 4.4 단계에 신선한 배아를 배포합니다.
13. ~ uninjected 컨트롤과 같은 태아의 10 %가 uninjected 배아 정상적으로 발전 보장하고 t에 대한 야생형 대조군으로 사용하기 위해 보관고 분자량 분석은 후술.

5. 포스트 사출 케어

1. ^{10 부화} 할 때까지 주사 후 18 ° C에서 배양 접시에서 배아를 품어. 부화 후, 수족관에서 후면 유충 ^(10)를 설명 된대로.
2. 부드럽게 주입 후 큰가시 고기 물 일일를 부어 신선한 큰가시 고기의 물을 교체합니다. 적어도 신선한 큰가시 고기 물 그 후 격일로 교체하십시오.
3. 매일 죽었거나 조작 된 배아를 확인합니다. 물을 오염 부패를 방지하기 위해 이러한 배아를 제거합니다.

사출 결과 6. 분석

1. 형광 기자의 분사를 들어, GFP 또는 RFP 필터 (형광 유전자에 따라 다름)와 형광 해부 현미경을 사용하여 어두운 방에서 매일 배아를 모니터링 할 수 있습니다. 디지털 사진 및 / 또는 서면 설명 및 다른 EXPRES 물고기 수의 집계와 유전자 발현의 패턴을 기록 해부학시온 도메인 (그림 4, 5).
   참고 : 큰가시 고기과, 4 일 후 수정 (DPF)에서 시작 GFP 필터에서 볼 수 있습니다 별 모양의 색소 세포를 autofluorescent 있습니다.
   1. 안정적인 라인을 생성 검출 형광와 배아를 저장하고 ¹⁰ 설명 된대로 성년에 성장합니다.
   2. 교배에 성공 유전자 전송을 나타내는 형광 자손을 찾기 위해 단계 6.1에 설명 된대로 형광 섹션 2.2 및 화면 자손에 설명 된 체외 수정 절차를 사용하여 야생형 물고기에 성인 물고기를 주입.
   3. 부화, 자유 수영 애벌레에서 형광을 시각화하기 위해 물고기를 마취시키다 물고기 정지 이미지로 이동 될 때까지 대기하도록 150mm 페트리 접시에 500 ㎕의 0.8 % Tricaine을 추가합니다. 즉시 관찰 및 이미징 다음과 같은 신선한 큰가시 고기의 물에 여러 번 씻어.
   4. 선택적으로, 더 이미징을위한 형광을 유지하기에 애벌레를 안락사0.025 % (250 ㎎ / ℓ) Tricaine 0.1 %의 중탄산 나트륨으로 완충 4 ° C에서 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 중 4 % 파라 포름 알데히드에서 4 시간 동안 고정한다. 최대 2 주 동안 1X PBS에 저장합니다.
      참고 : 시간이 지남에 배경 자동 형광 증가.
2. 진단 PCR / CRISPRs 또는 TALENs와 돌연변이 유도를위한 소화 유전자형은 - 최저 이일 후 시비에서 수행.
   1. 12 잘 PCR 스트립 튜브의 처음 10 우물에 10 주입 배아 (여전히 chorions 2 DPF를) 배치 전송 피펫을 사용합니다. 마지막 두 우물에 uninjected 제어 물고기를 놓습니다.
   2. 초과 큰가시 고기의 물을 제거합니다.
   3. 각 웰에 50 ㎕의 용해 완충액 (10 mM 트리스 pH를 8.3의 50 mM의 KCl, 1.5 밀리미터의 MgCl _2, 0.3 % 트윈 -20, 0.3 % NP-40)를 추가한다.
   4. 튜브에 배치 모자와는 열 순환기에서 20 분 동안 95 ° C에서 품어.
      참고 : 노른자는 끓는 단계 이후에 흰색과 고무 켜집니다.
   5. 뚜껑을 제거하고 다른 CLE를 사용1,000 μL 피펫 팁은 각 튜브의 배아를 담가서 부드럽게합니다.
      참고 : 백색 파편은 튜브의 바닥에 수집된다.
   6. 각 웰에 10 ㎎ / ㎖ 프로 테의 K의 2.5 μl를 추가합니다.
   7. 뚜껑을 교체하고 20 분은 곰팡이의 성장을 방지하기 위해 -20 ° C에서 테 K. 스토어를 불 활성화 95 ° C 다음에 단백질을 소화하기 위해 1 시간, 55 ° C에서 품어.
   8. 제조업체의 지침에 따라 높은 충실도 중합 효소를 사용하여 PCR을 수행합니다. DNA의 템플릿으로 배아 해물을 사용합니다.
      주 : DNA 템플릿 튜브의 상단에서 액체를 제거하기주의, 튜브의 하단에 눈에 띄는 융모막이나 노른자 파편을 피하는.
   9. 1X 특정 효소 완충액 및 샘플 당 0.25 ㎕의 효소를 함유하는 제한 효소 마스터 믹스 동일 부피의 PCR 생성물을 섞는다. 항상 PCR 제품 예상 크기 확인하는 겔상에서 분석하는 미가공 PCR 생성물의 반을 저장한다. PCR을은에 대한 적절한 조건에서 효소와 혼합 배양제한 효소.
      참고 : 일부 효소 PCR 제품에 효소 버퍼의 다른 비율을 요구할 수있다; uninjected 컨트롤이 완전한 소화를 표시하지 않는 경우 버퍼 농도를 조정합니다.
   10. 소화 후, 옆의 DNA 사이즈 래더을 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 제품 예상되는 생성물 크기를 확인한다.
       참고 : 주입 된 배아 포경 밴드는 (그림 6) 분자 병변의 존재를 표시하고 uninjected 컨트롤은 완벽하게 결과를 해석하는 소화해야합니다.
   11. , 병변을 확인 아가 로스 젤에서 포경 밴드를 잘라 겔 추출 키트와 함께 DNA를 정화합니다. 이상적으로 병변을 확인하려면 PCR 프라이머 내부의 시퀀싱 프라이머를 사용하여, 생거 시퀀싱을 사용합니다. F ₀ 배아 주입에서는 병변의 혼합 가능성 상거의 품질을 초래 존재할 것이다하는 표적 부위 근처 저하 읽었다.
   12. 안정적인 라인을 생산하기 위해 분자 병변에 대한 긍정적 인 화면 클러치의 모든 주입 된 배아를 저장합니다. 지물고기, 교배를 행 및 6.2.11 단계 6.2.1에 설명 된대로 다음 분자 병변 F ₍₁₎ 배아의 일부를 화면. 이형 항공사는 확인 된 경우, 나머지 F에게 성년와 꼬리 지느러미 클립에서 추출한 DNA를 이용하여 이형 개인을 식별 _한 배아를 성장.

Results

인핸서 활성을 갖는 리포터 유전자 형질 전환 유전자를 들어, 성공적으로 주입 트랜스 (도 4A, 4C)의 특정 세포 발현을 초래할 것이다. 주입 후 물고기 안정 라인 (도 4b에 도시 된 BAC 안정 선의 예)를 제조하는 outcrossed 수있다. 큰가시 고기의 배아에 DNA를 주입하는 것은 일반적으로 혼자 RNA보다 훨씬 높은 치사율을 초래한다. 그것은 50 %까지 볼 전형적인 (때로는 이상) 치사율 또는 기형 (그림 4D 참조 - F, 4I)를 TOL2 기자를 주입 한 후에는 (유사 이전에 설명 meganuclease 방법 ²¹⁾ 구성한다. 그러나, 그 결과는 광범위 특정 구조 배아 형태 및 기술 수​​준에 따라 달라질. 활성 강화제를 들어, 배아 40-50 %가 ...

Discussion

형질 전환 또는 게놈 편집 주입 한 세포 큰가시 고기의 배아는 세 가지 주요 과제를 제시한다. 첫째, 제브라 피쉬 배아를 기준으로는 큰가시 고기 배아 융모막은 힘든 종종 바늘을 깰 것입니다. 이 문제는 부분적으로 두껍고 강한 유리 마이크로 피펫을 사용하여 융모막에 수직 주입함으로써 극복 될 수있다 (프로토콜,도 2 참조). 가능한 것과 약간의 물을 확보하는 것은 배아에 추가됩니다 (다만 충분히 융모막이 팽창 멀리 세포에서 리프트를 유발하는 것은) 융모막 경도를 줄일 수 있습니다. 융모막은 시간이 지남에 따라 경화, 그래서 배아를 가습 후 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 그들이 건조하지 않도록 사전 주입 습도 챔버에서 배아를 유지하는 것도 중요하다. 일부 클러치, 심지어 개인 배아는 단순히 훨씬 두껍고 강하다 chorions있다; 때로는 다음 배아로 이동하거나 새 클러치 시도하는 가장 쉬운 솔루션입니다. 하나의 D를 건너 훨씬 쉽다 손상된 바늘을 교체하는 것보다 ifficult 배아....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
투과 조명이 있는 실체 현미경	Leica	S6e/ KL300 LED
수동 미세 조작기	응용 과학 계측	MM33	Marzhauser M33 미세 조작기
압력 주입 시스템	응용 과학 계측	MPPI-3
배압 장치	응용 과학 계측	BPU
마이크로 피펫 홀더 키트	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
마그네틱베이스 홀더	Applied Scientific Instrumentation	마그네틱베이스
풋 스위치	Applied Scientific Instrumentation	FSW
철판 (마그네틱베이스)	Narishige	IP
Flaming / Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
일회용 이송 피펫	Fisher	13-711-7M
0.5% 페놀 레드 in DPBS	Sigma	P0290	주입 추적자
#5 펜치, 생물학 듀목셀	바늘 깨기를 위한	Fine Science Tools	11252-30
마이크로피펫 저장 항아리	World Precision Instruments	E210	바늘을 6
", 인치당 6개의 이빨을 보관합니다. 플라스터 건조벽 톱	Lenox	20571 (S636RP)은	주입용 달걀을
13cm x 13cm 유리 접시	어떤 철물점	에서든지-
보로실리케이트 유리 모세혈관, 1.0 mm OD/0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100-F4	*제브라피쉬 주입 모세관보다 단단한 유리
150 x 15mm 페트리 접시	Fisher	FB0875714	Raise stickleback 배아
35mm x 10mm 페트리 접시	Fisher	08-757-100A	저장 계란 사전 주입
인스턴트 오션 소금	인스턴트 오션	SS15-10
중탄산나트륨	시그마	S5761-500G
트리카인 메탄설포네이트/MS-222	웨스턴 케미컬 Inc	MS222	어류 마취/안락사
Sp6 전사 키트	Ambion	AM1340	TALEN 및 트랜스포사제 mRNA
RNeasy 클린업 키트	Qiagen	74104	정제 트랜스포사제 또는 TALEN RNA
QiaQuick PCR 클린업 키트	Qiagen	28104	클린업 플라스미드 주사
단백질 분해 효소 K 20 mg/ml	준비를 위한	Ambion	AM2546
Nucleobond BAC 100 키트	BAC DNA 준비를 위한	Clontech	740579
NotI	NEB	R0189L
Phusion 중합효소	Fisher	F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit	Qiagen	12943	에는 내독소 린스 버퍼가 포함되어 있습니다
QIAQuick 젤 추출	Qiagen	28704	유도된 돌연변이의 염기서열분석(sequencing)
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올	시그마	P2069-100ML
아세트산 나트륨	시그마	S2889-250G
에탄올 (분자 생물학 등급)	시그마	E7023-500ML
아가로 스	시그마	A9539
50x 트리스 - 아세테이트 -EDTA 버퍼	ThermoFisher	B49
0.5-10 Kb RNA 사다리	ThermoFisher	15623-200
나노드롭  분광 광도계	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
파라포름알데히드	시그마	158127-500G
10x PBS	ThermoFisher	70011-044
1kb 플러스 DNA 래더	ThermoFisher	10787-018
염화칼	시그마	P9541-500G
염화마그네슘	시그마	M8266-100G
NP-40	ThermoFisher	28324
트윈 20	시그마	P1379-500ML
트리스 pH 8.3	Teknova	T1083
12-스트립 PCR 튜브	Thermo Scientific	AB-1113