트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
큰가시 고기 생선은 형태 학적, 생리의 다양한 유전 적 기초를 공부하는 강력한 시스템, 행동 표현형로 떠오르고있다. 해양 및 민물 형태를 교차 할 수있는 능력과 결합 해양 인구 수많은 담수 환경에 적응로 진화 현저 다양한 표현형은 유전자가 형질 발전 제어하는 게놈 영역을 매핑하는데 사용될 수있는 드문 척추 시스템을 제공한다. 우수 게놈 자원 진화 변화의 분자 유전 학적 해부을 용이하게 사용할 수 있습니다. 맵핑 실험 흥미 후보 유전자의리스트를 생성하지만, 기능적 유전자 조작은 유전자의 역할을 테스트하도록 요구된다. 유전자 조절은 TOL2 트랜스의 시스템을 이용하여 게놈에 통합 된 트랜스 제닉 리포터 플라스미드와 함께 BAC에 조사 할 수있다. 특정 후보 유전자 및 시스 - 규정 요소의 기능은 타겟 유도함으로써 평가할 수있다TALEN 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시약 돌연변이. 모든 방법은 수정 된 하나의 셀 큰가시 고기의 배아로 핵산을 도입 필요, 작업이 큰가시 고기 배아의 두께 융모막과 상대적으로 작고 얇은 할구로 도전했다. 여기서, 큰가 배아 내로 핵산 마이크로 인젝션에 대한 상세한 프로토콜은 트랜스 제닉 게놈 편집 유전자의 발현 및 기능을 연구하는 응용뿐 아니라 형질 전환의 성공 여부를 평가하고 안정한 선을 복구하는 방법에 대해 설명한다.
서론
생물 다양성은 자연에서 진화 된 표현형 변화의 유전 개발 기지를 결정하는 발생 방법을 이해하는 하나의 기본 구성 요소입니다. 큰가시 고기 생선, Gasterosteus aculeatus는 진화의 유전 적 기초를 공부하는 우수한 모델로 떠오르고있다. 큰가시 고기과 해양 물고기가 북반구의 주위에 수많은 민물 환경을 식민지 것처럼 극적인 형태 학적, 생리 학적 결과, 많은 적응 진화 적 변화를 겪고, 그리고 한 행동 변화 1. 스물 한 큰가 집단에서 개인의 게놈 서열 조립 및 고밀도 링크 맵은 상기 조립체 2,3-을 개선하기 위해 생성되어왔다. 유전자 맵핑 실험은 진화 표현형 4 기본 게놈 영역을 식별 한 6 -, 몇 가지 경우에, 특정 후보 유전자의 기능적 역할 7,8 테스트 한. 형태 학적 변화를 기본 게놈 영역의 숫자는 유망한 후보 유전자로 확인되었다, 그러나이 후보는 아직 기능적으로 9 테스트되지 않은 - 12. 또한, 큰가시 고기과 인구 유전학 / 유전체학 (13, 14), 분화 (15), 행동 (1), 내분비학 (16),
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프로토콜
모든 물고기 작품은 캘리포니아 버클리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 R330)에 의해 승인되었다.
1. 사출에 대한 핵산을 준비
- (피셔 (26)에서 적응) TOL2 플라스미드 형질 전환.
- 선형화 37 ° C에서 1 시간 동안 제공된 버퍼에 10 μg의 트랜스 플라스미드 (PCS-TP) 10 U를 NotI 39 컷.
주 : 재료 전송 계약은 TOL2 플라스미드를 취득해야 할 수 있습니다. - 표준 프로토콜 (40)에 따라 나트륨 아세테이트 이소 아밀 알코올과 에탄올 침전 : 클로로포름 : 24 : 페놀의 1 혼합물 컷 25와 플라스미드의 압축을 풉니 다. 50 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물에 재현 탁 플라스미드.
주 : 페놀 - 클로로포름을 후드에 사용되어야하며, 폐 적절히 기관 가이드 라인에 따라 배치되어야한다. - 제조업체의 지침에 따라 SP6 전사 반응을 설정합니다.
- RNA의 ISOL를 사용하여ATION 키트는 제조업체의 지침에 따라 전사 반응을 정리하는 단계; 50 μL의 RNase없는 물에 RNA를 재현 탁.
- RNA의 1 μl의 나누어지는을 제거합니다. 5 분 동....
- 선형화 37 ° C에서 1 시간 동안 제공된 버퍼에 10 μg의 트랜스 플라스미드 (PCS-TP) 10 U를 NotI 39 컷.
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결과
인핸서 활성을 갖는 리포터 유전자 형질 전환 유전자를 들어, 성공적으로 주입 트랜스 (도 4A, 4C)의 특정 세포 발현을 초래할 것이다. 주입 후 물고기 안정 라인 (도 4b에 도시 된 BAC 안정 선의 예)를 제조하는 outcrossed 수있다. 큰가시 고기의 배아에 DNA를 주입하는 것은 일반적으로 혼자 RNA보다 훨씬 높은 치사율을 초래한다. 그것은 50 %까지 볼 전형적인 (때로는 이상) 치사율 또는 기형 (그림 4D 참조 - F, 4I)를 TOL2 기자를 주입 한 후에는 (유사 이전에 설명 meganuclease 방법 21) 구성한다. 그러나, 그 결과는 광범위 특정 구조 배아 형태 및 기술 수준에 따라 달라질. 활성 강화제를 들어, 배아 40-50 %가 .......
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토론
형질 전환 또는 게놈 편집 주입 한 세포 큰가시 고기의 배아는 세 가지 주요 과제를 제시한다. 첫째, 제브라 피쉬 배아를 기준으로는 큰가시 고기 배아 융모막은 힘든 종종 바늘을 깰 것입니다. 이 문제는 부분적으로 두껍고 강한 유리 마이크로 피펫을 사용하여 융모막에 수직 주입함으로써 극복 될 수있다 (프로토콜,도 2 참조). 가능한 것과 약간의 물을 확보하는 것은 배아에 추가됩니다 (다만 충분히 융모막이 팽창 멀리 세포에서 리프트를 유발하는 것은) 융모막 경도를 줄일 수 있습니다. 융모막은 시간이 지남에 따라 경화, 그래서 배아를 가습 후 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 그들이 건조하지 않도록 사전 주입 습도 챔버에서 배아를 유지하는 것도 중요하다. 일부 클러치, 심지어 개인 배아는 단순히 훨씬 두껍고 강하다 chorions있다; 때로는 다음 배아로 이동하거나 새 클러치 시도하는 가장 쉬운 솔루션입니다. 하나의 D를 건너 훨씬 쉽다 손상된 바늘을 교체하는 것보다 ifficult 배아........
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH Predoctoral 교육 그랜트 5T32GM007127 (PAE) 및 NSF 대학원 연구 활동 (NAE)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 주입 프로토콜에 대한 유용한 피드백을 CRISPR 생거 시퀀싱 데이터를 생성 BAC의 recombineering 및 주사, 닉 Donde을 수행하는 케빈 Schwalbach에 감사하고, 캐서린 리 파리.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 투과 조명이 있는 실체 현미경 | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| 수동 미세 조작기 | 응용 과학 계측 | MM33 | Marzhauser M33 미세 조작기 |
| 압력 주입 시스템 | 응용 과학 계측 | MPPI-3 | |
| 배압 장치 | 응용 과학 계측 | BPU | |
| 마이크로 피펫 홀더 키트 | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| 마그네틱베이스 홀더 | Applied Scientific Instrumentation | 마그네틱베이스 | |
| 풋 스위치 | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| 철판 (마그네틱베이스) | Narishige | IP | |
| Flaming / Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| 일회용 이송 피펫 | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% 페놀 레드 in DPBS | Sigma | P0290 | 주입 추적자 |
| #5 펜치, 생물학 듀목셀 | 바늘 깨기를 위한 | Fine Science Tools | 11252-30 |
| 마이크로피펫 저장 항아리 | World Precision Instruments | E210 | 바늘을 6 |
| ", 인치당 6개의 이빨을 보관합니다. 플라스터 건조벽 톱 | Lenox | 20571 (S636RP)은 | 주입용 달걀을 |
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| 보로실리케이트 유리 모세혈관, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *제브라피쉬 주입 모세관보다 단단한 유리 |
| 150 x 15mm 페트리 접시 | Fisher | FB0875714 | Raise stickleback 배아 |
| 35mm x 10mm 페트리 접시 | Fisher | 08-757-100A | 저장 계란 사전 주입 |
| 인스턴트 오션 소금 | 인스턴트 오션 | SS15-10 | |
| 중탄산나트륨 | 시그마 | S5761-500G | |
| 트리카인 메탄설포네이트/MS-222 | 웨스턴 케미컬 Inc | MS222 | 어류 마취/안락사 |
| Sp6 전사 키트 | Ambion | AM1340 | TALEN 및 트랜스포사제 mRNA |
| RNeasy 클린업 키트 | Qiagen | 74104 | 정제 트랜스포사제 또는 TALEN RNA |
| QiaQuick PCR 클린업 키트 | Qiagen | 28104 | 클린업 플라스미드 주사 |
| 단백질 분해 효소 K 20 mg/ml | 준비를 위한 | Ambion | AM2546 |
| Nucleobond BAC 100 키트 | BAC DNA 준비를 위한 | Clontech | 740579 |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion 중합효소 | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | 에는 내독소 린스 버퍼가 포함되어 있습니다 |
| QIAQuick 젤 추출 | Qiagen | 28704 | 유도된 돌연변이의 염기서열분석(sequencing) |
| 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 | 시그마 | P2069-100ML | |
| 아세트산 나트륨 | 시그마 | S2889-250G | |
| 에탄올 (분자 생물학 등급) | 시그마 | E7023-500ML | |
| 아가로 스 | 시그마 | A9539 | |
| 50x 트리스 - 아세테이트 -EDTA 버퍼 | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA 사다리 | ThermoFisher | 15623-200 | |
| 나노드롭 분광 광도계 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb 플러스 DNA 래더 | ThermoFisher | 10787-018 | |
| 염화칼 | 시그마 | P9541-500G | |
| 염화마그네슘 | 시그마 | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| 트윈 20 | 시그마 | P1379-500ML | |
| 트리스 pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-스트립 PCR 튜브 | Thermo Scientific | AB-1113 |
참고문헌
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T.....
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재인쇄 및 허가
