해부와 큰가시 고기 아가미 해골의 평면 장착

요약

아가미 갈퀴, 인두 이빨, 분지 뼈를 포함한 분지 골격은 대부분의 물고기에서 식품 가공의 주요 부위 역할을 합니다. 여기에서는 이 내부 골격을 3척추 스틱백으로 해부하고 평평하게 장착하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 다른 다양한 어종에도 적용할 수 있습니다.

초록

척추동물 머리의 후인두 분절은 물고기의 식품 가공의 주요 부위인 분지 골격을 일으킵니다. 물고기 가지 골격의 형태는 종의 식단과 일치합니다. 삼가시 스틱백어류(Gasterosteus aculeatus)는 다양한 형질에서 진화된 차이의 유전적, 발달적 기초를 연구하기 위한 모델 시스템으로 부상했습니다. sticklebacks의 해양 개체군은 수많은 새로운 담수호와 개울을 반복적으로 식민지화했습니다. 이러한 담수 환경에서의 새로운 식단에 대한 적응은 독립적으로 파생된 담수 개체군에서 반복적으로 진화한 일련의 두개안면 변화의 기초가 될 수 있습니다. 여기에는 분지 골격에 대한 세 가지 주요 패턴 변화가 포함됩니다 : 아가미 갈퀴 뼈의 수와 길이 감소, 인두 치아 수의 증가, 분지 뼈 길이 증가. 여기에서는 threespine stickleback fish의 내부 가지 골격을 해부하고 평평하게 장착하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 전체 3차원 분지 골격을 해부하고 이를 대부분 2차원 준비물에 평평하게 장착하면 분지 골격 형태를 쉽게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 해부 방법은 저렴하고 빠르며 비교적 쉬우며 다양한 어종에 적용할 수 있습니다. sticklebacks에서 이 효율적인 방법을 사용하면 유전자 교배에서 골격 형태를 정량화하여 두개안면 패터닝을 제어하는 게놈 영역을 매핑할 수 있습니다.

서론

다양성의 놀라운 양이 특히 물고기들, 척추 동물 중 머리 골격에 존재합니다. 대부분의 경우 이러한 다양성은 다른 공급 전략 ¹ 용이 ^{- 4,} 모두 외부 및 내부 두개 안면 패턴에 큰 변화를 포함 할 수있다. 아가미 골격은 물고기의 목에 내부에 위치하여 구강의 대부분을 둘러싸고있다. 아가미 골격은 아가미를 지원하는 전방 네있는 5 직렬로 동종 세그먼트로 구성되어 있습니다. 함께이 다섯 세그먼트는 물고기와 음식 ⁽⁵⁾ 사이의 인터페이스로 작동합니다. 아가미 레이커, 인두 이빨과 아가미 뼈를 포함하여 특성의 다수의 변화는 다양한 종류의 음식에 효율적 꼴에 기여한다.

큰가시 고기과는 북반구에 걸쳐 민물 호수와 시내 식민지 조상의 해양 양식 후 적응 방사선을받은. 다이어트의 변화민물에서 더 큰 먹이에 바다에서 작은 동물성 플랑크톤에서 여러 두개 안면 특성 ^(6)에 극적인 영양 변화를 가져왔다. 많은 연구가 큰가시 고기과 ⁷ 외부 두개 안면의 차이에 초점을 맞추고 있지만 ^{- 13} 중요한 두개 안면의 변화는 내부 아가미 골격에 반복적으로 진화. 형태 학적으로 구별 큰가시 고기 집단 사이의 비옥 한....

프로토콜

모든 물고기 작품은 캘리포니아 버클리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 R330)에 의해 승인되었다. 안락사 0.1 % 중탄산 나트륨 ³⁹ % 완충 0.025 Tricaine-S에 침지하여 수행 하였다. 모든 단계는 실온에서 수행된다.

1. 준비

참고 : 단단히 밀봉 할 수 있고 수평으로 배치 할 원뿔 튜브 또는 섬광 유리 병에 단계 1.1-1.5를 수행합니다. 물고기는 지속적으로 동요 될 필요가 조심스럽게 반전 또는 염색 액에 물고기의 모든면을 노출하고 얼룩이 균등하게 조직을 통과 할 수 있도록 튜브 또는 튜브의 랙을 흔들어 가능한 한 자주 솔루션을 혼합하려고하지 않습니다. 액체의 무거운 무게가 통을 깰 것 같은 플랫폼 통에 물고기의 큰 배치를 두지 마십시오.

1. 하룻밤 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)와 에탄올에 저장하거나 갓 안락사 생선이나 생선을 수정합니다. 대안 적으로, 4 % 파라 포름을 사용1X PBS 용액 대신에 10 % NBF에서 알데히드.
   주 : DNA를 추출하는 경우에는 에탄올에 고정 및 저장 전에 꼬리 지느러미 또는 가슴의 일부를 클립.
2. 2 시간 동안 (즉, ~의 pH 7.0) 화학 후드에서 제대로 수정 폐기 및 수돗물로 교체합니다. 종종 산성 수 있....

결과

중요한 영양 특성의 다양한 정량화 할 수있는 해부와 평면 탑재 아가미 골격이 프로토콜 결과 (그림 4). 지느러미보기에서 아가미 레이커, 모든 인두 치아 판, 거의 모든 아가미 뼈의 모든 행은 쉽게 시각화, ²² 정량화 할 수있다 ^{- 24,35,36,38,42합니다.} 알리자린 레드 S는 다른 마커 (예, 유전자 변형 GFP ⁴²⁾ 및 시각화하는 다른 방법으로 이중 라벨을 허용하는 로다 민 또는 유사한 적색 필터에 형광. 형광 이미징 또는 표현형을 계획하는 경우 형광은 어둠 속에서 상점 준비합니다, 그래서 빛 빨리 사라져요. 복부보기에서 아가미는 시각과 색소 침착 ^(43)를 정량화 할 수있다. 최상의 상태로 준비 년 동안 100 % 글리세린에 저장 될 수있다.

토론

분지 골격은 식도로 가는 음식을 조작, 여과 및 저작하는 물고기의 목구멍에 있는 복잡한 뼈 세트입니다. 아가미 갈퀴, 인두 치아 및 분지 뼈의 패턴을 포함한 많은 흥미로운 영양 특성은 종 간 및 종 내에서 다릅니다. 이러한 특성의 대부분은 제 자리에서 분지 골격(예: 아가미 레이커 길이, 분지 뼈 길이)으로 정확하게 측정하기 어렵거나 거의 불가능합니다. 이 평면 장착 프로토콜은 모든 분지 골격 요소를 간단한 2차원 평면에 배치하여 여러 특성의 이미징 및 정량화를 용이하게 합니다.

이 프로토콜의 한 가지 한계는 이 평면 장착 2차원 준비 내의 치아, 아가미 갈퀴 및 대부분의 내연골을 쉽게 이미지화하고 정량화할 수 있지만 훨씬 더 많은 3차원 모양을 갖는 두 번째에서 네 번째 외분지는 쉽게 시각화되지 않으며 정확하게 측정하려면 추가 해부가 필요합니다. 이 프로토콜의 두 번째 한계는 이 방법이 어머리에 대한 파괴를 최소화한다는 것입니다. 그러나 접형골.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수산화칼륨 (KOH)	EMD	PX1480-1
글리세롤	시그마-알드리치	G7893-4L
10% 중성 완충 포르말린(NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
알리자린 레드 S	EMD	AX0485-3
현미경 커버 안경 22 mm x 60 mm	VWR	16004-350
100 mm x 10 mm 유리 페트리 Dish	Kimble Chase	23064-10010
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Ellsworth 접착제	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	을 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 부어 해부 플레이트를 만들 수 있습니다
. 모델링 Clay	Sargent Art	22-4000	1 lb 크림
섬광 바이알 (500 케이스)	Wheaton	986586	붕규산 유리 나사 캡
펜크스-뒤몽 #5 이녹스 (생물학 팁)	FST	11252-20	듀모스타는 대체
해부 가위입니다	FST	15003-08	샘플의 크기에 따라 다른 크기를 사용할 수 있습니다
해부 현미경	Leica	S6E with KL300 LED	많은 모델도 잘 작동하며 평평한 바닥을 갖는 것이
마이크로 원심 분리기 튜브 1.7 ml	Denville	C2170
판지 슬라이드 트레이	Fisher	12-587-10

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