류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

요약

여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 - 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.

초록

성숙한 체세포 프로그래밍 요소의 정의 된 집합을 사용하여 다 능성 줄기 세포와 같은 상태로 되돌릴 수있다. 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 C-Myc와 : 많은 연구는 네 야마나카의 전사 인자를 형질 도입에 의해 다양한 체세포 유형의 유도-다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성했다. iPSCs 연구는 생물학 및 임상 연구의 최첨단에 남아있다. iPSCs 어떤 개인의 조직으로부터 유도 될 수 있기 때문에, 특히, 환자 별 iPSCs은 질병의 병리 생물학 연구 선구 도구로 사용될 수있다. 류마티스 관절염 (RA)은 관절 연골 및 뼈 구조의 파괴에 의해 분류 된 만성 염증성 질환이다. 활막 증식은 RA의 결과로 이어질 주요 원인이나 증상 중 하나입니다. 섬유 아세포 등 활막 (FLSS)가 증식 성 활막의 주성분 세포이다. 공동의 FLSS는 무제한 결국 인접 cartil 침입, 증식나이와 뼈. 현재, 과형성 활막은 수술에 의해 제거 될 수있다. 제거 된 활막은 관절의 염증 상태를 반영하는 재료로서 RA 연구에 사용된다. RA의 발병 기전에 중요한 플레이어, FLSS 생성하여 RA 환자의 iPSCs를 조사하는 재료로서 사용될 수있다. 본 연구에서는 iPSCs를 생성 RA 환자의 FLSS를 사용했다. 렌티 바이러스 시스템을 사용하여, 우리는 FLSS가 RA 환자 별 IPSC를 생성 할 수 있음을 발견했다. FLSS로부터 생성 iPSCs 더 앞으로 RA의 기전을 연구 도구로서 사용할 수있다.

서론

다 능성 줄기 세포는 다양한 임상과 생물 분야에서 차세대 플랫폼이다. 이들은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 회생 의학적 치료에 사용될 수있는 유망한 도구이다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)이 주로 연구 및 다 능성 세포를 이해하기 위해 사용되었다. 그러나, 인간 배반포의 파괴에 의해 분리, hESCs는 여러 윤리적 문제와 연관된다. 2007 년, 박사 신야 야마나카와 그의 팀은 셀 프로그래밍 과정을 역으로 인간 성인의 체세포 ^1,2에서 줄기 세포를 개발했다. 따라서 hESCs는 달리 유도 - 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 윤리적 장애물 회피, 성숙한 체세포에서 생성 될 수있다.

인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 : 일반적으로, iPSCs는 네 개의 외래 유전자의 전달에 의해 생성됩니다. 이러한 야마나카 인자는 원래 렌티 바이러스 및 레트로 바이러스 시스템을 사용하여 제공됩니다. 첫 번째 iPSCs는 마우스 체세포의 C에서 파생 된ELL 학생 ^3. 그 후, 방법은 인간 피부 섬유 아세포 ^1,2- 적용 하였다. 후속 연구는 성공적 소변 ^-4- 피 ^5,6- 같은 다양한 소스로부터 생성 iPSCs ⁷ 각질 및 기타 여러 세포 유형. 그러나 일부 체세포 프로그래밍에 사용되지 않은 세포 및 질병 상태의 특정 조직에서 다양한 세포 유형의 프로그래밍 기능 검사가 여전히 필요하다.

류마티스 관절염 (RA)는 모든 관절을 공격하고 다른 기관에서자가 면역 조건으로 이어질 수있는 질환이다. RA는 선진국에서 성인의 약 1 %에 영향을 미칩니다. 그것은 오히려 일반적인 질환과 그 발생 빈도는 매년 ⁸ 증가한다. 그러나, RA는 초기에는 파악하기 어렵다 파괴 oncebone 손상을 복구 할 수있는 치료가없는 일어난다. 또한, 약효는 환자마다 상이하고, 그 메딕을 예측하기 어렵다필요 오프라인. 따라서, 약물 스크리닝 방법의 개발이 필요하고, RA의 조건을 반영 할 수있는 셀 재료가 필요하다.

섬유 아세포와 같은 활막 (FLSS)는 RA ^9,10의 발병에 적극적으로 세포의 참가자입니다. FLSS는 활막이라고 관절낭과 캐비티 사이의 활액 내막 안감에 존재한다. 조인트지지 구조 및 주변 연골에 영양분을 제공함으로써, FLSS는 일반적으로 관절 기능과 유지에 결정적인 역할을한다. 그러나, RA에서 FLSS는 침략 표현형을 가지고있다. RA FLSS 결국 무한 증식 ^(10)에 의해 주위의 뼈를 파괴, 암과 같은 표현형을 가지고있다. 이 독특한 특성으로 FLSS는 RA의 병리 생물학을 반영 할 수있는 유망한 재료로서 사용될 수있다. 그러나, 이들 세포는 거의 생성되지 않으며, 세포를 시험관 내에서 여러 통로를 통해 진행하면서 세포 표현형 변화 조건. 따라서, 환자의 상태를 나타낼 수있는 도구로서 RA FLSS를 사용하여 복잡 할 수있다.

이론적으로, RA 환자에서 파생 된 iPSCs (RA-iPSCs)는 약물 검사 및 추가 연구를위한 이상적인 도구가 될 수 있습니다. 생성 iPSCs 자기 갱신 능력이 유지 및 시험 관내에서 확장 될 수있다. 능성,이 세포는 RA 및 기타 뼈 관련 질환 ^(11)의 특정 연구 세포 물질 기여 성숙한 연골 세포 및 골 세포 계통으로 분화 될 수있다.

본 연구에서는 분리 및 야마나카 인자를 포함하는 렌티 바이러스를 사용하여 FLSS에서 RA-iPSCs를 생성하는 수술로 제거 활액막 및 방법에서 FLSS을 확장하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.

1. 활막 분리 및 확장

1. 활막 격리
   1. 외과 위 두 쌍의 집게 한 쌍의 소독.
   2. 100mm의 접시에 활막 조직 전송와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)로 세척한다.
   3. 노란 지방 조직과 뼈 잔류 물을 잘라. 둘 베코의 변형 이글의 매체 20 % 태아 소 혈청 (DMEM) (FBS) 5 ㎖를 6 웰 플레이트의 웰에 트리밍 된 조직을 전송하고 추가 할 수 있습니다.
   4. 조각은 일회용 피펫을 관통 할만큼 작은 때까지 가위로 조직을 잘라.
   5. 50 ML 원뿔 튜브에 조직 함유 미디어를 전송합니다. 6 웰 플레이트에 20 % FBS와 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 잔류 물질을 채취 한 후 튜브에 옮긴다.
   6. 얼음에 해동 콜라게나. 0.01 %의 최종 농도로 콜라게나 제를 첨가하고 파라 필름으로 튜브를 밀봉. 4 시간 동안 진탕하면서 37 ℃에서 수조에서 인큐베이션.
   7. 전량을 10 분 동안 300 × g으로 50 mL의 원심 분리, RT가 될 때까지 배양 한 후, 20 % FBS DMEM과 함께 튜브를 채운다.
   8. 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 펠렛을 재현 탁 미디어의 40ml를 추가합니다.
   9. 반복 1.1.10-1.1.11 단계를 반복합니다.
   10. 20 % FBS와 DMEM 25 ml의의 펠렛을 재현 탁하고 아래로 가라 조직의 큰 덩어리를 기다립니다.
   11. 100 밀리미터 접시에 뜨는을 전송, 14 일 동안 5 % CO _2에서 37 ° C에서 품어.
2. 활막 유지 보수 및 확장
   1. 플레이트에서 사용 된 미디어를 버리고 PBS 5 ㎖로 세포를 씻어.
   2. 한 ML PBS / 1 mM의 EDTA를 추가하고 2 분 동안 5 % CO _2에서 37 ° C에서 품어.
   3. 부드럽게 요리와 transfe을 누릅니다R 15 ML 원뿔 튜브에 세포. 2 분 동안 250 XG에서 RT를 세포를 원심 분리기.
   4. 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 20 % FBS와 DMEM 30 ml의 펠렛을 재현 탁.
   5. 눈에 보이는 남은 재료를 남기지 않고, 3 × 100mm 접시에 세포를 전송합니다.
   6. 신선한 매체마다 3 일에 미디어를 교체합니다. 한 ML PBS / 1 mM의 EDTA를 사용하여 80 %의 포화 상태에서 세포를 분할합니다. 사용하기 전에 통로 (3)까지 유지한다. 모든 분할 3 접시에 세포의 각 접시를 나눈다.
      참고 : 통로 (3)에 도달 한 후, 즉시 사용하지 않을 세포가 얼 수있다.

렌티 인코딩 야마나카 인자를 사용하여 2. 재 프로그래밍 FLSS

1. 전달 (D0)
   1. 성장 배지에서 6 개의 웰 플레이트의 웰 당 종자 3 × ¹⁰⁴ 세포 (DMEM 500 ㎖를 10 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된). 5 % CO에서 37 ° C에서 세포 O / N을 품어2.
   2. 4 ° C에서 냉동과 해동의 인 Oct4, Klf4, Sox2이와 C-Myc와 다음 날, 4 야마나카 인자를 포함하는 렌티 바이러스의 한 유리 병을 제거합니다. 주 : 렌티 바이러스는 이전 연구 ^(11)에 기재된 절차에 의해 제조 하였다.
   3. 바이러스를 해동하는 동안, 10 μg의 / ㎖ hexadimethrine 브로마이드를 50㎍ / ㎖의 아스코르브 산을 함유하는 (DMEM 20 % FBS 플러스 항생제) FLS 성장 매체 미디어를 변경합니다.
   4. 미디어를 변경 한 후, 세포에 렌티 바이러스의 30 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. 감염을 개선하기 위해, 680 × g으로 30 분 동안 35 ℃에서 플레이트를 원심 분리.
   5. 원심 분리 후, 5 % CO _2에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
2. 재 프로그래밍까지 유지 보수 볼 수 있습니다
   1. 삼일를 들어, 0.1 mM의 나트륨 부티레이트 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산을 포함하는 FLS 성장 매체와 매일 미디어를 교체합니다.
   2. 다음날, FLS의 성장 배지의 혼합물로 용지를 교체하고0.1 mM의 나트륨 부티레이트를 50㎍ / ㎖의 아스코르브 산을 포함한다 : (1 비율 1) IPSC 매체.
      주 : IPSC 매체의 구성 요소는 재료 / 장비 목록에 주어진다.
3. 콜로니 형성을위한 분할 세포
   1. 비트로 넥틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
      1. ^칼슘과 마그네슘 ^2+없이 6 ml의 PBS에 60 μL의 비트로 넥틴을 추가합니다. 각 우물에 혼합 2 ㎖를 넣고 적어도 1 시간 동안 RT에서 품어. 참고 : 비트로 넥틴의 작업 농도는 5 μg의 / ㎖이다.
   2. D5에서 PBS로 세포를 씻어.
   3. 세포를 분리하고 2 분 동안 37 ° C, 5 % CO _2에서 배양 1 ml의 PBS / 1 mM의 EDTA를 추가합니다.
   4. 2 분 동안 250 XG에서 RT를 세포와 원심 분리기를 수확.
   5. (9 : 3, 1 : 6, 1) 다른 confluencies를 달성하기 위해 3 개의 다른 비율로 세포 분열. 세포 펠렛과에 resuspend 미디어 900 μl를 추가합니다. 6- 웰당 세포 혼합액의 300, 150, 100 μL를 추가각각 9 : 3, 1 : 6, 1 웰 플레이트 (1)의 비율을 달성한다.
   6. 식민지가 나타날 때까지 IPSC 매체와 매일 미디어를 교체합니다. 식민지는 약 D18 이후에 나타납니다. 주의 :이 단계에서 IPSC 콜로니 않은 재 프로그래밍 FLSS와 공존.
4. 식민지 따기
   1. 웰에 500 μL의 비트로 넥틴을 첨가하여 48- 웰 비트로 넥틴 코팅 플레이트를 준비하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서 배양한다.
   2. 클린 벤치에 현미경을 놓고 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 제거합니다.
   3. 48 웰 플레이트에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 10 mM이의 Rho 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (ROCK) 억제제로 보충 500 μl의 IPSC 미디어를 추가 할 수 있습니다.
   4. 10P 피펫 팁을 사용하여, 식민지 주위를 잘라. 48 웰 플레이트 잘 하나에 집어 식민지를 전송합니다.
   5. 몇몇 콜로니를 픽업 한 후, 37 ° C, 5 % CO _2에서 세포를 배양한다.
   6. 식민지가 큰 ENO 때까지 세포를 유지우 전송. 참고 : 식민지 100X 배율에서 볼 현미경의 가시 필드에서 얻을 때 우리는 일반적으로 세포를 유출.

3. 면역 형광 염색법

1. 셀 준비
   1. 12 웰 플레이트에 멸균 18mm 커버 유리를 놓습니다.
   2. 냉각 덮개 유리를 세척하는 PBS 1 ML을 추가합니다.
   3. 10 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴 액 1ml로 교체하십시오.
   4. 적어도 1 시간 동안 실온에서 접시를 품어.
   5. 매일 미디어를 변경, 37 ° C, 5 % CO _2에서 칠일의 비트로 넥틴 코팅 된 12 웰 플레이트와 문화의 비트로 넥틴 솔루션 및 플레이트 iPSCs를 폐기하십시오.
2. 세포 얼룩
   1. 배양 배지를 버리고 한 번 PBS로 세포를 씻어.
   2. RT에서 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 세포를 고정한다.
   3. RT에서 5 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
   4. permeabilization를 제거PBS는 RT에서 30 분 동안 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액과 블록.
   5. . PBS 표 1에 따라 2 % BSA를 함유하는 항체 희석 RT에서 2 시간 동안 일차 항체와 세포를 인큐베이션.
   6. 이차 항체 (1 : 200으로 희석)를 첨가하고 빛을 피 RT에서 1 시간 동안 세포를 배양한다.
   7. 1 μL / 10 분 ㎖의 DAPI로 세포를 치료.
   8. antifade 시약 슬라이드 글라스 위에 커버 글라스를 놓고 광을 피하고 24 시간 동안 RT에서 배양한다.
   9. 형광 현미경으로 표현을 확인합니다.

4. 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)

1. 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 ^(11)를 사용하여 세포 펠렛에서 mRNA의 압축을 풉니 다.
2. 역전사 ^(11)를 사용하여 총 mRNA의 2 μg의에서의 cDNA를 증폭.
3. TEM의 cDNA 2 μl를 사용하여 PCR에 필요한 성분을 혼합플레이트 ^(11).
4. RT-PCR을 수행하고 겔 전기 영동 ^(11)에 의한 결과를 확인합니다.

5. 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색

1. 37 ° C에서 5~7일에 대한 문화 iPSCs 전에 염색을 5 % CO _2.
2. 미디어를 대기음 1 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정합니다.
3. 정착액을 취소하고 1X 린스 버퍼로 세포를 씻어.
4. AP 염색 용 시약을 준비합니다. 다음과 같은 비율로 시약을 혼합 : 빠른 레드 바이올렛 : 나프톨 AS-BI 인산 용액 : 물 = 2 : 1 : 1.
5. 광을 피하는 실온에서 15 분 동안 염색 용액으로 세포를 인큐베이션.
6. 염색 액을 버리고 린스 버퍼로 세포를 씻어.
7. 건조 방지 및 시야 현미경을 사용하여 발현을 확인하기 위해 PBS로 세포를 커버.

결과

본 연구에서 우리는 렌티 바이러스 시스템을 사용 FLSS로부터 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 기술한다.도 1a는 FLS 분리 프로토콜의 간단한 방식을 나타낸다. 활막 제거 수술 후, 조직은 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 잘게 하였다. 콜라겐 조직의 덩어리로부터 세포를 분리시켰다. 세포를 추가로 처리하기 전에 14 일간 배양 하였다.도 1b는 격리 FLSS의 형태를 나타낸다. 세포를 사용하기 전에 3 통로를 유지했다. FLSS는 일반 섬유 아 세포와 유사한 특성을 공유 할 수 있습니다. 우리의 격리 FLSS은 섬유 성 마커, 멘틴 및 피브로넥틴를 표명했다. 격리 RA FLSS는 또한 대 식세포 같은 활막 마커 CD68 (도 1C)의 낮은 발현을 보였다.

토론

iPSCs의 발견 전에 과학자들은 주로 차별화를 통해 줄기 세포 생물학 및 다른 세포 계통을 연구하기는 ESC를 사용했다. 그러나,는 ESC는 초기 단계의 배아 인 배반포의 내부 매스에서 유래. 는 ESC를 분리하기 위해, 배반포의 파괴를 극복하기 불가능한 윤리적 문제를 제기 불가피하다. 는 ESC가 stemness와 다 능성 특성을 갖고 있지만, 또한, 이들은 개인으로부터 수득 될 수없고, 때로는 맞춤 분석 및 질병 검사를위한 이상적인 도구 아니다.

2007 년, 다카하시 등의 알. 인간 섬유 아세포 ^2에서 생성 된 iPSCs. 이론적으로는 ESC 달리 iPSCs 모든 성인 체세포에서 생성 될 수있다. 이러한 장점으로, iPSCs은 자동 세포 이식을위한 이상적인 도구가 될 것으로 생각된다. 또한, 후생 메모리의 개념, iPSCs 병원성 조건, 즉, 시뮬레이션을위한 이상적인 셀 재료로 생각되고. 질병 모델링. 혈액 세포, 소...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mm 접시	TPP	93100
6웰 플레이트	TPP	92006
50ml 코니컬 튜브	SPL	50050
15ml 코니컬 튜브	SPL	50015
10ml 일회용 피펫	Falcon	7551
5ml 일회용 피펫	Falcon	7543
12웰 플레이트	TPP	92012
FLS 절연 재료
수술용 가위
수술용 집게
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
페니실린 스트렙토마이신	Sigma Aldrich	P4333
소 태아 혈청(FBS)	Life Technologies	16000-044
콜라겐분해	Sigma Aldrich	C6885-100MG
파라필름	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM 비필수 아미노산 솔루션(100x)	Life Technologies	11140-050
β-메르캅토에탄올	시그마 Aldrich	M3148
폴리브레인	케미콘	TR-1003-G
페니실린 스트렙토마이신	Life Technologies	P4333
소 태아 혈청 (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
렌티바이러스
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC 배지 성분 (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC 배지 성분 (Conc.: 543 μ g/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC 미디어 성분  (농도: 14ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC 매체 성분 (Conc.: 10.7 μ g/ml)
기본 FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC 미디어 성분  (농도: 100ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC 배지 성분 (Conc.: 20 μ g/ml)
인간 TGFβ 1	Peprotech	100-21	iPSC 미디어 성분 (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC 미디어 성분  (Conc.: 64 μ g/ml)
폴리브레네	케미콘	TR-1003
부티르산나트륨	시그마 알드리치	B5887
비트로넥틴	라이프 테크놀로지	A14700
ROCK 억제제	시그마 알드리치	Y0503
<강력한>내구성 조절 재료
18mm 커버 유리	슈페리어	HSU-0111580
4% 파라포름알디히드(PFA)	기술 및 혁신	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
소 혈청 알부민 (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 항체	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 항체	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 항체	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 항체	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 항체	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 항체	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 염소 anti-mouse IgG (H+L) 항체	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, 코팅	현일 Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
클로로포름	시그마 알드리치	366919
이소프리필알코올	밀리포어	109634
에탄올	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA 합성 키트	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA 중합효소	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE 버퍼	Life Technologies	15581-044
로딩 스타	Dyne Bio	A750
아가로스	시그마-알드리치	9012-36-6
1 kb (+) DNA 래더 마커	효소	DM003
알칼리성 인산가수분해효소	Millipore	SCR004