Method Article

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

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우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

Abstract

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인구 및 가족 기반 유전 연구는 일반적으로 임상 질병 또는 표현형과 통계적으로 관련된 유전적 변이를 식별하는 결과를 낳습니다. 많은 질병 및 형질의 경우, 대부분의 변이체는 비코딩(non-coding)이며, 따라서 유전자 발현을 제어하는 미묘하고 비교적 예측하기 어려운 메커니즘에 영향을 미쳐 작용할 가능성이 높습니다. 여기에서는 코딩되지 않은 변형의 우선 순위를 지정하고 해당 기능을 선별하기 위한 일반적인 전략적 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식에는 기능적 게놈 데이터베이스를 사용한 계산 우선 순위 지정과 위험 및 비위험 대립유전자에 대한 전사 인자(TF)의 차등 결합에 대한 실험적 분석이 포함됩니다. 유전적 변이의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위해 합성 DNA 올리고뉴클레오티드(올리고)를 사용하여 질병 또는 표현형 관련 세포의 핵 용해물 인자를 식별합니다. EMSA의 경우, 결합된 핵 인자(종종 TF)가 있거나 없는 올리고뉴클레오티드는 트리스-붕산염-EDTA(TBE) 폴리아크릴아미드 겔에서 비변성 전기영동에 의해 분석됩니다. DAPA의 경우, 올리고뉴클레오티드가 자기 컬럼에 결합되고 DNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 핵 인자를 용출 및 분석하여 질량 분석법 또는 환원성 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 이 일반적인 접근 방식은 모든 질병, 특성 또는 표현형과 관련된 비코딩 유전 변이의 기능을 연구하는 데 널리 사용될 수 있습니다.

Introduction

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시퀀싱 및 게놈 넓은 협회 연구 (GWAS), 후보의 궤적 연구를 포함하여 유전자형을 기반으로 연구, 그리고 깊은 시퀀싱 연구는 통계적으로 질병, 특성, 또는 표현형과 관련된 많은 유전자 변형을 확인했다. 초기 예측과는 반대로, 이러한 변형 (85-93%)의 대부분은 비 - 코딩 영역에 위치하는 단백질 1,2의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 이들 비 - 코딩 변이체의 기능을 해석하고 관련된 질환에 접속 생물학적 메커니즘을 결정하는 단계, 특성, 또는 표현형 3-6 도전 입증되었다. 유전자 발현 - 우리는 중요한 중간 표현형 변이를 연결하는 분자 메커니즘을 식별하기위한 일반적인 전략을 개발했다. 이 파이프 라인은 특히 유전 적 변이에 의해 결합 TF의 변조를 식별 할 수 있도록 설계되었습니다. 이 전략은 예측하기위한 계산 방법과 분자 생물학 기술을 결합생물학적 인 실리코 후보 변종의 효과 및 확인이 예측 경험적으로 (그림 1).

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그림 1

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Protocol

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솔루션 및 시약 1. 준비

  1. EMSA 및 방위 사업 청에 사용하기위한 사용자 정의 DNA 올리고 뉴클레오티드 프로브를 주문하십시오.
    1. 짧은 올리고 디자인, 바인딩이 아닌 특정 단백질을 감소시키기 위해 30, 및 17 bp의 내인성 게놈 서열에 의해 측면 중앙에 직접 관심의 변형을 배치 (35 ~ 45 염기의 길이 쌍 (BP) 사이). EMSA 올리고 들어, 5 '형광을 추가합니다. 방위 사업 청 올리고 들어, 5 '비오틴 태그를 추가합니다.
    2. 센스 가닥과 역 보완 가닥 모두를 주문하십시오. 또한, 주문 듀플렉스 (프리 어닐링) 올리고. 올리고 이름을 지정할 때 설립 참조 게놈의 명칭을 기반으로.
      참고 : "위험"과 질병 및 프로젝트 특정 할 수있다 "비 위험"지정 "참조"와 "비 참조"더 보편적으로 관련이있다.
    3. 올리고 도착하면, 간단히 100 μ의 최종 농도 클레아없는 물에서 재현 탁 내용과 스핀 다운;엠. 스토어는 -20 ° C에서 주식을 재현 탁. 알루미늄 호일로 포장하여 빛에서 형광 태그 올리고를 보호합니다.

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Results

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해물의 품질을 특징으로 관련이있는 EMSA 또는 방위 사업 청, 그리고 다양성을 수행 할 때이 절에서 무엇을 기대해야하는지의 대표적인 결과가 제공된다. 예를 들어, 여러 번 동결 융해 단백질 시료 것은 변성 될 수 있다는 것을 제안하고있다. 이러한 "동결 - 해동"사이클의 맥락에서 EMSA 분석 재현성을 탐색하기 위해, 하나 이상의 유전 적 변형에 다른 두 개의 35 염기쌍 올리고는 지정된 시간 동안 해동 재 동결 하였다 핵 해물 일괄 적으로 배양 하였다 . 시간의 두 그림은 5 번이 특정 B 림프구 핵 추출물을 동결 및 해동하는 단백질의 무결성에 겉으로는 아무 효과가 없다는 것을 보여줍니다; 그러나, 핵 단백질의 안정성은 샘플에 따라 다르며, 따라서 사용되는 각 개별 셀 라인에서 테스트해야합니다. 다른 배치 위해 준비 할으로부터 변화를 가질 수도있다핵 해물의 관리 포인트. 이 변형으로 인해 분해 셀 통로 번호, 또는 다른 인자에 앞서 세.......

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Discussion

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시퀀싱 및 유전형 기술의 발전이 크게 질병과 관련된 유전자 변형을 식별하는 우리의 능력을 강화하고 있지만, 이러한 변형의 영향을 기능적 메커니즘을 이해하는 능력이 떨어지고있다. 문제의 주된 원인 가능성 유전자 발현을 제어하기 어려워-간 예측 메커니즘에 영향을하는 부호화 게놈 영역 많은 질병 관련 변종 N에 위치된다는 것이다. 여기서는 가능성이 많은 비 - 코딩 변이체의 기능에 기여하는 이벤트를 결합 유전자형 의존 TF를 식별하는 EMSA 및 DAPA 기술 유용한 분자 도구에 기초하여 프로토콜을 제시한다. 이러한 두 가지 기술이 과거에 널리 이용되었지만, 그것들은 단지 최근에 결합 TF의 유전 적 변이 분석하도록 구성되어있다. TF들 외에도 EMSA는 또한 프로토콜 (36) 만 약간의 조정으로 RNA 결합 단백질에 대한 유전자 변형의 효과를 분석하기 위해 사용될 수있다.

. "ove_content> 여기에 제시된 프로토콜을 수행하는 간단하고 쉬운 그럼에도 불구하고, 특정 부분은.......

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Disclosures

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저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

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프로토콜 개발에 대한 조언과 지시에 대해 Erin Zoller, Jessica Bene, Lindsey Hays에게 감사드립니다. MTW는 NIH R21 HG008186와 신시내티 아동 병원 연구 재단(Cincinnati Children's Hospital Research Foundation)의 신탁 관리자 상 보조금의 일부 지원을 받았습니다. ZHP는 T32 GM063483-13에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드통합 DNA 기술
http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry 염화칼피셔 사이언티픽BP366-500KCl, CE 버퍼
HEPES (1M)피셔 사이언티픽15630-080CE 및 NE 버퍼
EDTA (0.5M), pH 8.0Life TechnologiesR1021CE, NE 및 어닐링 버퍼
염화나트륨Fisher ScientificBP358-1NaCl, NE 버퍼
Tris-HCl (1M), pH 8.0InvitrogenBP1756-100어닐링 버퍼
용 인산염 완충 식염수 (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, 세포 세척
DL-Dithiothreitol 용액 (1M)Sigma646563환원제
프로테아제 억제제 칵테일Thermo Scientific87786의 이화작용을 예방
.Thermo Scientific78420TF의 탈인산화 방지
Nonidet P-40 대체품IBI ScientificIB01140NP-40, 핵 추출용
BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225단백질 농도 측정용
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910필요한 모든 EMSA 완충액
TBE Gels, 6%, 12 Wells 포함InvitrogenEC6265BOXEMSA
TBE 버퍼 (10x)Thermo ScientificB52EMSA FactorFinder
시작 키트Miltenyi Biotec130-092-318필요한 모든 DAPA 버퍼 포함
Licor Odyssey CLxLicorDAPA/EMSA
항생제-항진균제Gibco15240-062용 권장 스캐너페니실린 10,000 단위/ml, 10,000 &마이크로를 포함합니다. 스트렙토마이신의 g/ml 및 25 &마이크로; Fungizone®의 g/ml; 항진균성
소 태아 혈청Gibco26140-079FBS, 배양 배지용
RPMI 1640 배지Gibco22400-071L-글루타민 및 25mM HEPES 함유
륨 은 TFs 인산가수분해효소 억제제 칵테일합니다

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

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Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

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