방법 논문

스트라이프 분석은 해리 해마 신경 세포를 사용하여 단백질 기판의 매력적인 또는 혐오감 활동을 연구하는

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DOI:

10.3791/54096

⸱

2016년 6월 19일

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

이 논문에서

요약

축삭 유도 분자는 신경 세포의 이동과 표적 성장 원뿔 탐색을 조절합니다. 우리는 유도 분자가 뉴런을 끌어당기거나 밀어내는 능력을 평가하기 위해 스트라이프 분석이라는 강력한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 배양된 해마 뉴런을 격퇴하는 FLRT2의 능력을 보여줌으로써 스트라이프 분석을 입증합니다.

초록

성장하는 축삭은 끝에서 성장 원뿔이라고 하는 매우 운동성이 높은 구조를 발달시킵니다. 성장 원뿔은 축삭 성장을 탐색하기 위해 세포 외 환경 신호와 접촉합니다. 넷린(Netrin), 슬릿(slit), 세마포린(semaphorin) 및 에프린(ephrin)은 축삭돌기의 수용체(receptor)와 공동 수용체(co-receptor)에 결합할 때 축삭돌기를 끌어당기거나 밀어낼 수 있는 유도 분자로 알려져 있습니다. 활성화된 수용체는 성장 원뿔에서 뉴런의 구조와 움직임을 변경하는 다양한 신호 분자를 시작합니다. 여기에서는 유도 분자가 뉴런을 끌어당기거나 밀어내는 능력을 평가하기 위한 스트라이프 분석에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서는 E15.5 마우스의 해리된 해마 뉴런을 피브로넥틴과 류신이 풍부한 막관통 단백질-2(FLRT2)의 엑토도메인(ectodomain)의 교대로 처리된 라미닌 코팅 접시에서 배양하고 면역글로불린 G(IgG) 단편 결정화 영역(Fc) 단백질을 제어합니다. 축삭돌기와 세포체 모두 배양 24시간 후 FLRT2 코팅된 줄무늬 영역에서 강하게 반발되었습니다. tau1을 사용한 면역염색은 FLRT2-Fc 코팅 줄무늬(~10%)에 비해 뉴런의 ~90%가 Fc 코팅 줄무늬에 분포되어 있음을 보여주었습니다. 이 결과는 FLRT2가 이러한 뉴런에 강한 반발 효과가 있음을 나타냅니다. 이 강력한 방법은 1차 배양 뉴런뿐만 아니라 신경아세포와 같은 다양한 다른 세포에도 적용할 수 있습니다.

서론

축삭지도는 새로 형성된 신경 세포는 신경계의 1, 2의 개발 기간 동안 자신의 목표에 축삭를 전송하는 과정입니다. 개발 축삭의 성장 원추라는 자신의 끝에 높은 운동성 구조를 실시하고 있습니다. 성장 콘 축삭의 경로를 탐색하는 세포 외 신호를 감지한다. 안내 등의 슬릿, semaphorin 같은 분자 및 ephrins는, 유치 또는 축삭 1,3,4에 적합한 수용체와 공동 수용체와의 상호 작용에 따라 축삭을 물리 칠 수 있습니다. 활성화 된 수용체는 축삭 성장 콘의 움직임에 대한 골격 조직에 영향을 미치는 성장 콘에 신호를 전송합니다.

다양한 방법이 유인 및 반발 성 분자의 작용을 평가하기 위해 개발되어왔다. 화학 - 유인 및 방충제는 그라데이션 농도 성장 / 문화 매체에 투여 될 수있다 (예., 던의 챔버 또는 μ-슬라이드) 마이크로-P에 의해 고농도의 자리에 5, 6,ipette (예., 전환 분석) 7 또는 목욕 응용 프로그램 (예., 성장 원뿔 붕괴 분석) 8,9에 의해 균일 한 농도.

다른 방법은 화학 - 유인 또는 반발은 기판 10-12으로서 판 표면에 도포되어있는 스트라이프 분석 또는 마이크로 콘택트 프린팅 (μCP)를 포함한다. Thestripe 분석은 원래 병아리 레티노 - tectal 시스템 (13)의 지형 매핑을 분석하기 위해 1987 년 본회퍼와 동료에 의해 ​​개발되었다. 원래 방법은 스트라이프와 메쉬 행렬을 사용하여 폴리 카보네이트 nucleopore 막에 코트 단백질에 진공 시스템이 필요합니다. 이상에서, 재조합 단백질을 직접적으로 좁은 슬릿 실리콘 매트릭스 (14, 15)를 사용하여, 스트라이프 패턴으로 배양 용기의 표면에 인쇄했다. 최근 여러 연구 그룹이 성공적으로 축삭지도 분자 활동 16-21의 분석이 스트라이프 분석을 적용했습니다.

여기, 우리는 해리 해마 신경 세포에 대한 축삭지도 분자의 인력이나 반발력을 측정하는 스트라이프 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 특히,이 방법은 최소 갖춘 실험실 설정에서 적용될 수있다. 이 분석 들어, 형광 표지 된 기판의 제어 된 단백질의 교번 스트라이프는 90 ㎛의 슬릿 실리콘 매트릭스를 이용한 플라스틱 접시에 생성되고 라미닌 코팅. 우리의 데모에서는, E15.5 마우스의 해마 신경 세포가 피브로넥틴와 류신이 풍부한 막 횡단 단백질 2 (FLRT2)과의 Fc 단백질 (21)를 제어의 재조합 ectodomain의 줄무늬 교대에 배양 하였다 해리. 배양 24 시간 후, 축삭 신경의 세포체는 모두 강하게 FLRT2 줄무늬에서 반발되었다. 항 Tau1 항체로 염색 FLRT2 반발이 강한 것을 나타내는 ~ 뉴런의 90 %가 FLRT2-FC에 ~ 10 %에 비해 된 Fc 피복 영역에 분포 된 것으로 나타났다해마의 뉴런 (21)에 대한 기능.

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프로토콜

동물 주제와 관련된 절차는 의학의 하마 마츠 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

행렬의 1. 준비

  1. 전자 레인지에 5 분 동안 핫 플레이트에 4-8 실리콘 매트릭스를 삶아 그들을 층류 (줄무늬면이 위로)에서 1 시간 동안 완전히 건조 할 수 있습니다.
    참고 : 다음 절차는 층류에서 수행되어야한다.
  2. 압축 공기를 불어 또는 행렬의 스트라이프 측면에서 먼지를 제거하기 위해 투명 접착 테이프를 사용합니다. 깨끗한 스트라이프면을 유지 그래서 단단히 플레이트 표면에 부착 할 수 있습니다.
  3. 조심스럽게 손가락 (; 스트라이프면이 아래 접시 당 하나의 매트릭스)으로 눌러 6 cm 플라스틱 요리 상에 매트릭스를 배치합니다. 매트릭스와 요리 사이에 기포가 들어 가지 않도록. 배양 접시의 바닥면에 줄무늬의 위치를​​ 표시한다.
  4. 매트릭스 첨부 실패하면, 단계 1.2에서 반복합니다.

신경 문화 2. 스트라이프 생성 및 라미닌 코팅

  1. 형광 표지 된 재조합 단백질 준비은 FC-태그 단백질 (10 ~ 50 μg의 / ㎖) 및 형광 염료 -을 혼합하여 (25 μl를 주입 [단계 2.2] 100 ㎕의 배치 방법 [단계 2.2.1]에 대한 각 각) 공액 항 - 인간 항체의 Fc (1 비율 3 : 30-150 μg의 / ㎖) 인산염 완충 식염수 (PBS)이다. 그 후, RT에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다.
  2. 22-G 주사기를 이용하여, 매트릭스의 측면에 작은 구멍을 통해 이전 단계 (2.1)에서 제조 한 재조합 단백질의 25 μl를 주입 (도 1A, 1C에서의 화살표 및 1E).
    1. 대안 적으로, 매트릭스의 상단 슬릿으로 재조합 단백질 100 μl를 넣고 있도록 작은 구멍으로부터 액의 흡 약 절반 (도 1A, 1C 및 1E의 화살표), 재조합 단백질은 스트라이프 영역에서 유지된다.
  3. 30 마일의 접시를 품어세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 N.
  4. 행렬의 측면에있는 작은 구멍에서 상단 슬릿 (그림 1B) 및 흡인에 PBS 300 μl를 놓습니다 (그림 1A, C 및 E의 화살표) 부착 재조합 단백질을 제거합니다. 단백질은 건조하기 때문에, 완전히 PBS를 대기음하지 마십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. (총 3 회)
  5. 다른 코팅을 만드는 전체 스트라이프 영역을 덮도록, FC (10 내지 50 μg의 / ㎖)를 조심스럽게 조절 단백질 ~ 100 μL를 배치 즉시 매트릭스를 제거. 그 후, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 배양한다.
  6. PBS에서 ~로 접시면 20 μg의 / ㎖ 라미닌 100 μl를 PBS로 3 회 코트를 세척 한 후.
    주 : 라미닌 응고를 방지하는 얼음에 해동되어야한다.
  7. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 부화.
  8. PBS와 함께 접시 표면을 세 번 씻고 문화 메디칼 추가음. 사용할 때까지 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 배양 배지와 코팅 접시를 놓습니다.

E15.5 마우스 배아 3. 배양 해마 신경 세포

  1. 자궁 경부 전위를 통해 어머니를 안락사 세 E15.5 배아를 분리.
  2. sagittally 가위로 머리의 중간 선에 피부와 두개골을 잘라 작은 스푼을 사용하여 뇌를 제거합니다. 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 3 ㎖를 포함하는 60 mm 페트리 접시에 조심스럽게 뇌를 전송합니다.
  3. 메스를 사용하여, 피질, 해마 및 선조체 (그림 2A)를 포함하여 반구를 잘라. 그리고, 신중 수막을 제거하여 해마 영역을 해부하고, 얼음 (도 2B-C)에서, HBSS 용액 2 ㎖를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 해부 해마 조직을 옮긴다. 8 요리 뉴런을 배양하기위한 충분한 튜브 3 배아에서 6 해마를 수집합니다.
  4. 수소를 교체트립신 / EDTA 용액 (2 mL) 및 수조에서 15 분 동안 37 ° C에서 튜브를 부화와 BSS 용액.
    대기음 HBSS 원심 분리하지 않고 튜브를 기울여 HBSS 솔루션을 가만히 따르다하지 않습니다 있습니다.
  5. 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL를 첨가함으로써 트립신의 활성을 중화.
  6. 5 분 동안 100 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 배지 2 ㎖로 펠렛을 씻는다. 다시 한 번이 단계를 반복합니다.
  7. 피펫은 큰 구멍이 1,000 ㎕의 팁을 사용하여 배지에서 상하 해마 10 배 조직을 해리 (팁을 잘라).
  8. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 아래 일반 (포경) 1,000 μL 팁으로 변경하고 해리 조직을 위로 피펫합니다.
  9. 80 ~ 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 전달하여 단일 세포를 분리합니다.
  10. 5 분 동안 150 XG에서 필터링 된 단일 세포 현탁액을 원심 분리기.
  11. 흡입하여 상층 액을 제거하고 펠를 재현 탁등 배지 2 ㎖에 (뉴런).
  12. 밀도와 생존을 결정 트리 판 블루 염색에 혈구 세포를 사용하여 계산. stripes.The 현탁액의 각 세트는 신중 전체 스트라이프 영역을 커버하는 배치해야합니다 위해 다음, 배양액 150 ㎕를 10,000 신경 세포를 접시.

안티 Tau1 항체를 이용하여 세포 기관 및 면역 형광 염색법에 의한 축삭 4. 시각화

  1. 배양 24 시간 후, 부착 세포를 방해하지 않고 매체를 흡인하고, 예열 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) / 4 % 슈 크로스에서 15 분 동안 RT에서 / PBS로 뉴런을 고정한다.
  2. PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. 원하는 경우, 필요한 항체의 양을 감소시키기 위해 스트라이프 영역 주위에 원을 그리 발수 펜을 사용한다.
  3. 5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 / PBS로 뉴런 Permeabilize 하시려면.
  4. 3 % 당나귀 혈청과 0.1 % 트리톤 X-100을 포함 차단 솔루션 뉴런을 품어4 ° C에서 1 % 당나귀 혈청 / 0.1 % 트리톤 X-100 / PBS O / N : 안티 Tau1 항체 (200 일)로 배양 한 다음 30 분.
  5. PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) /0.1% 트리톤 X-100 / PBS 30 분에 형광 접합 된 항 - 마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션 뉴런.
  6. PBS로 플레이트 표면을 3 회 반복한다. antifade 용액 50 μl를 사용하여 18mm X 18mm 커버 유리와 스트라이프 영역을 커버. 이미징을 방해 공기 방울을 피하십시오.
  7. GFP 및 RFP, 1,000 밀리 초 노출 시간 (그림 3)에 대한 예를 들어, 해당 시스템을 사용하여 형광 현미경, 10 배 대물 렌즈, 필터 세트와 형광 이미지를 얻습니다.

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결과

E15.5 마우스 해리 해마 뉴런 도금의 형광 제어을 FC (도 3A-C) 또는 비 - 표지 된 Fc 제어 교대 FLRT2-FC (도 3d-F) 라벨 줄무늬 24 시간 동안 배양 하였다. 두 경우 모두, 뉴런은 집계했고, 번들로 자신의 축삭을 확장했다. 컨트롤을 된 Fc / 된 Fc 줄무늬가 신경이 형광 표지하고 비 표지 된 줄무늬 균일하게 분포하고, 이들은 임의의 방향 (도 3A-C)에서 자신의 축삭을 연장. 반면에, 때 FLRT-2Fc /의 Fc 줄무늬 배양, 축삭은 FLRT2-의 Fc 영역에 성장 피했다. 따라서, 축삭 연장 주로 제어 된 Fc (도 3d-F)에 위치시켰다. 특히, 균체와 축삭 모두 FLRT2-FC에서 반발되었다. 따라서, 축삭의 스트라이프에 평행 한 방향으로 연장도 3d '.'- F '축삭을...

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토론

이 프로토콜은 E15.5 마우스의 해마에서 재조합 단백질과 해리 신경 세포를 사용하는 스트라이프 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 스트라이프 패턴으로 배치 관심 재조합 단백질에 신경 세포의 반발 매력, 또는 중립적 인 반응을 효율적으로 관찰 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 이점은 특별한 행렬 진공 장치를 필요로하는 기존의 방법에 비해 단백질이 직접 플라스틱 접시의 표면에 인쇄되는 줄무늬를 생성하기위한 간단한 방법 및 nucleopore 막 20 21. 단백질 줄무늬하려면 표지 재조합 단백질 과잉 버퍼와 결합되지 않은 단백질의주의 흡인 한 후, 작은 구멍 또는 큰 샘플 (~ 100 μL) 행렬 위에 슬릿에 배치 될 수 통해 주입 될 수있다 구멍을 통해.

이 방법의 또 다른 장점은 뉴런 다수 같이 시각화 될 수 있다는화롯불 실험 많은 성장 원뿔 21을 동시에 분석 할 수있다. 대조적으로, 종래의 회전 분석에서, 단지 하나의 뉴런 및 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 일본 과학 진흥회(Japan Society for the Promotion of Science)의 과학 연구 보조금(Grants-in-Aid for Scientific Research)의 지원을 받았습니다(23700412, 25122707 및 26670090 to S.Y.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 ml 원심분리기 튜브Violamo 1-3500-01
4% 파라포름알데히드(PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 염소 항인간 IgG 항체Thermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 당나귀 항마우스 IgG 항체Thermo ScientificA-21203희석 1/500
Anti-Tau1 항체ChemiconMAB3420희석 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481대체 장착 매체 사용 가능
B27 보충제Thermo Scientific17504-044희석 1/50
소 혈청 알부민Sigma01-2030-2
Cell strainer 100 umBD Falcon352360
원심분리 기계Kubota2410
커버 유리 18mmx18mmMatsunami18x18 mm No. 1
DAKO 펜DAKOS2002대체 발수 펜 사용 가능
일회용 메스Feather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
형광 현미경NikonE600
집게 No. 5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061희석 1/100
Hamilton 주사기Hamilton805N22 게이지, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
Human IgG, Fc FragmentJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
Normal Donkey SerumJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicillin-StreptomycinThermo Scientific15070-063희석 1/100
플라스틱 배양 접시, 60mmThermo Scientific150288
실리콘 매트릭스Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo MicroscopeOlympusSZ61
Tip, 1000 uLWatson125-1000S
투명 접착 테이프Tesa57315대체 접착 테이프 사용 가능
Triton X-100SigmaT8787
Trypan blue, 0.4%Bio-Rad145-0013
B27, GlutaMAX 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054 배양 배지 Neurobasal.

참고문헌

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  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

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FLRT2Tau1

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