축삭 유도 분자는 신경 세포의 이동과 표적 성장 원뿔 탐색을 조절합니다. 우리는 유도 분자가 뉴런을 끌어당기거나 밀어내는 능력을 평가하기 위해 스트라이프 분석이라는 강력한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 배양된 해마 뉴런을 격퇴하는 FLRT2의 능력을 보여줌으로써 스트라이프 분석을 입증합니다.
방법 논문
축삭 유도 분자는 신경 세포의 이동과 표적 성장 원뿔 탐색을 조절합니다. 우리는 유도 분자가 뉴런을 끌어당기거나 밀어내는 능력을 평가하기 위해 스트라이프 분석이라는 강력한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 배양된 해마 뉴런을 격퇴하는 FLRT2의 능력을 보여줌으로써 스트라이프 분석을 입증합니다.
성장하는 축삭은 끝에서 성장 원뿔이라고 하는 매우 운동성이 높은 구조를 발달시킵니다. 성장 원뿔은 축삭 성장을 탐색하기 위해 세포 외 환경 신호와 접촉합니다. 넷린(Netrin), 슬릿(slit), 세마포린(semaphorin) 및 에프린(ephrin)은 축삭돌기의 수용체(receptor)와 공동 수용체(co-receptor)에 결합할 때 축삭돌기를 끌어당기거나 밀어낼 수 있는 유도 분자로 알려져 있습니다. 활성화된 수용체는 성장 원뿔에서 뉴런의 구조와 움직임을 변경하는 다양한 신호 분자를 시작합니다. 여기에서는 유도 분자가 뉴런을 끌어당기거나 밀어내는 능력을 평가하기 위한 스트라이프 분석에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서는 E15.5 마우스의 해리된 해마 뉴런을 피브로넥틴과 류신이 풍부한 막관통 단백질-2(FLRT2)의 엑토도메인(ectodomain)의 교대로 처리된 라미닌 코팅 접시에서 배양하고 면역글로불린 G(IgG) 단편 결정화 영역(Fc) 단백질을 제어합니다. 축삭돌기와 세포체 모두 배양 24시간 후 FLRT2 코팅된 줄무늬 영역에서 강하게 반발되었습니다. tau1을 사용한 면역염색은 FLRT2-Fc 코팅 줄무늬(~10%)에 비해 뉴런의 ~90%가 Fc 코팅 줄무늬에 분포되어 있음을 보여주었습니다. 이 결과는 FLRT2가 이러한 뉴런에 강한 반발 효과가 있음을 나타냅니다. 이 강력한 방법은 1차 배양 뉴런뿐만 아니라 신경아세포와 같은 다양한 다른 세포에도 적용할 수 있습니다.
축삭지도는 새로 형성된 신경 세포는 신경계의 1, 2의 개발 기간 동안 자신의 목표에 축삭를 전송하는 과정입니다. 개발 축삭의 성장 원추라는 자신의 끝에 높은 운동성 구조를 실시하고 있습니다. 성장 콘 축삭의 경로를 탐색하는 세포 외 신호를 감지한다. 안내 등의 슬릿, semaphorin 같은 분자 및 ephrins는, 유치 또는 축삭 1,3,4에 적합한 수용체와 공동 수용체와의 상호 작용에 따라 축삭을 물리 칠 수 있습니다. 활성화 된 수용체는 축삭 성장 콘의 움직임에 대한 골격 조직에 영향을 미치는 성장 콘에 신호를 전송합니다.
다양한 방법이 유인 및 반발 성 분자의 작용을 평가하기 위해 개발되어왔다. 화학 - 유인 및 방충제는 그라데이션 농도 성장 / 문화 매체에 투여 될 수있다 (예., 던의 챔버 또는 μ-슬라이드) 마이크로-P에 의해 고농도의 자리에 5, 6,ipette (예., 전환 분석) 7 또는 목욕 응용 프로그램 (예., 성장 원뿔 붕괴 분석) 8,9에 의해 균일 한 농도.
다른 방법은 화학 - 유인 또는 반발은 기판 ....
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동물 주제와 관련된 절차는 의학의 하마 마츠 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
행렬의 1. 준비
신경 문화 2. 스트라이프 생성 및 라미닌 코팅
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E15.5 마우스 해리 해마 뉴런 도금의 형광 제어을 FC (도 3A-C) 또는 비 - 표지 된 Fc 제어 교대 FLRT2-FC (도 3d-F) 라벨 줄무늬 24 시간 동안 배양 하였다. 두 경우 모두, 뉴런은 집계했고, 번들로 자신의 축삭을 확장했다. 컨트롤을 된 Fc / 된 Fc 줄무늬가 신경이 형광 표지하고 비 표지 된 줄무늬 균일하게 분포하고, 이들은 임의의 방향 (도 3A-C)에서 자신의 축삭을 연장. 반면에, 때 FLRT-2Fc /의 Fc 줄무늬 배양, 축삭은 FLRT2-의 Fc 영역에 성장 피했다. 따라서, 축삭 연장 주로 제어 된 Fc (도 3d-F)에 위치시켰다. 특히, 균체와 축삭 모두 FLRT2-FC에서 반발되었다. 따라서, 축삭의 스트라이프에 평행 한 방향으로 연장도 3d '.'- F '축삭을.......
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이 프로토콜은 E15.5 마우스의 해마에서 재조합 단백질과 해리 신경 세포를 사용하는 스트라이프 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 스트라이프 패턴으로 배치 관심 재조합 단백질에 신경 세포의 반발 매력, 또는 중립적 인 반응을 효율적으로 관찰 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 이점은 특별한 행렬 진공 장치를 필요로하는 기존의 방법에 비해 단백질이 직접 플라스틱 접시의 표면에 인쇄되는 줄무늬를 생성하기위한 간단한 방법 및 nucleopore 막 20 21. 단백질 줄무늬하려면 표지 재조합 단백질 과잉 버퍼와 결합되지 않은 단백질의주의 흡인 한 후, 작은 구멍 또는 큰 샘플 (~ 100 μL) 행렬 위에 슬릿에 배치 될 수 통해 주입 될 수있다 구멍을 통해.
이 방법의 또 다른 장점은 뉴런 다수 같이 시각화 될 수 있다는화롯불 실험 많은 성장 원뿔 21을 동시에 분석 할 수있다. 대조적으로, 종래의 회전 분석에서, 단지 하나의 뉴런 및 .......
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저자는 공개할 것이 없습니다.
이 작업은 일본 과학 진흥회(Japan Society for the Promotion of Science)의 과학 연구 보조금(Grants-in-Aid for Scientific Research)의 지원을 받았습니다(23700412, 25122707 및 26670090 to S.Y.).
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