Method Article

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

DOI:

10.3791/54105

⸱

June 16th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, Taiwan, 2Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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단세포의 이질성을 연구하는 것은 많은 생물학적 질문에 매우 중요하지만 기술적으로는 어렵습니다. 따라서 단일 세포 배양 실험을 수행하기 위해 간단하면서도 처리량이 많은 방법이 필요합니다. 여기에서는 고효율 단일 세포 분리(~77%)를 위한 미세유체 칩 기반 전략을 보고하고 클론 생성 분석을 사용하여 장기 단일 세포 배양(최대 7d) 및 세포 이질성 분석을 수행할 수 있는 능력을 입증합니다. 이러한 응용은 KT98 마우스 신경 줄기 세포와 A549 및 MDA-MB-435 인간 암 세포로 입증되었습니다. 높은 단일 세포 분리 효율과 장기 배양 능력은 미세유체 채널의 상단과 하단에 다양한 크기의 마이크로웰을 사용함으로써 달성됩니다. 소형 마이크로웰 어레이는 단일 세포를 정밀하게 분리하도록 설계되었으며, 대형 마이크로웰 어레이는 미세유체 칩에서 단일 세포 클론 배양에 사용됩니다. 이 미세유체 플랫폼은 분리 효율을 저하시키지 않으면서 다양한 배양 전략을 위한 조정 가능한 세포 배양 공간의 유연성으로 인해 단일 세포 배양 응용 분야에 매력적인 접근 방식을 구성합니다.

Introduction

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현재 배양 공간에 개별적으로 하나의 셀을 배치는 일반적으로 제한 희석 또는 형광 - 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 달성된다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있습니다 피펫 및 조직 배양 플레이트를 필요로 많은 실험실의 경우, 희석을 제한하는 편리한 방법입니다. 이러한 경우에, 세포 현탁액을 연속적으로 적당한 세포 밀도로 희석 한 다음 수동 피펫을 이용하여 배양 웰에 두었다. 이러한 복실 단셀 그런 다음 1 콜로니 형성이 스크리닝 이질성 유전자로서 세포 분석을 위해 사용된다. 한계 희석법의 푸 아송 분포의 특성은 37 % (3)의 최대 확률 단세포 이벤트를 제한하기 때문에,이 방법을 지원하기위한 로봇 팔을 이용하지 않고 낮은 처리량과 노동력이있다. 통합 된 로보트 팔 FACS 기계 정확하게 PLAC으로 푸 아송 분포의 한계를 극복 할 수있다한 번에 4에서 잘 문화에서 하나의 셀을 보내고. 그러나, 높은 기계적 전단 응력은 5 (따라서, 세포 생존 능력을 저하) 및 기계 구입 및 운영 비용은 많은 실험실에서의 사용을 제한하고있다.

고효율 마이크로 웰 (6)에 하나의 셀을로드에 위의 한계를 극복하기 위해, 마이크로 장....

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Protocol

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주 : 우리의 미세 유체 소자의 제작을위한 포토 마스크 설계는 컴퓨터 이용 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 그려졌다. 디자인이어서, 상용 서비스를 이용하여 크롬 포토 마스크를 제조하는데 사용 하였다. PDMS의 장치는 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 제조 하였다. 11

리소그래피에 의해 마스터 금형 1. 제작

  1. 포토 리소그래피 공정 (12) 전에, 기판으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 사용하여 10 분 동안 120 ℃에서 종래의 오븐에서 웨이퍼 탈수.
  2. 플라즈마 클리너 30 초 100w에서 산소 플라즈마 처리를 이용하여 탈수 한 실리콘 웨이퍼를 클린.
  3. 다음 베이킹 프로세스에 대해 각각 65 ° C에서 두 개의 핫 플레이트 95 ° C를 예열.
  4. 스핀 코터에 의해 세정 된 실리콘 웨이퍼 상에 네가티브 포토 레지스트 (PR)를 도포 5g; 30 초 동안 1,200 rpm으로 (SU-8 50)에서 스핀 마이크로 층을 생성한다.
  5. 홍보를 배치12 분 동안 65 ℃에서 예열 된 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 도포하고, 소프트 베이크 공정을 수행하기 위해 (두께 100㎛의 패턴) 33 분 동안 95 ° C에서 다른 예열 된 핫 ....

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Results

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단일 세포 분리 및 배양 용 마이크로 유체 플랫폼은 마이크로 웰 어레이의 두 세트 (도 2A)와 마이크로 채널 (200 ㎛의 높이)를 포함한다. 마이크로 웰 어레이의 두 세트 캡처 웰 (직경 25 μm의 깊이에 27 μm의) 각각 단일 세포의 분리 및 문화에 대한 문화 웰 (직경 285 μm의 깊이에서 300 μm의), 각 되나된다 탑 뷰 (도 2B)에서 볼 때 캡처 - 웰 배양 웰의 중앙에 위치한다. 장치 조작 (회로도 동작 흐름은 그림 1에 예시되어있다), 필요한 장비 (주사기 펌프, 조직 문화 인큐베이터, 및 현미경) 및 소모품 (주사기, 피펫 및 튜브)를 들어 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 플랫폼의 휴대 성 및 투명성이 세포가 쉽게 편의와 장치에서 관찰 및 분석을 허용세포 배양 실험 동안적인 현미경.

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Discussion

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마이크로 웰 기반 장치 시스템은 6,14 그러한 6 트래핑 대규모 단일 셀 및 단일 조혈 줄기 세포 증식 15 단일 세포 조작 및 분석을 위해 사용되어왔다. 물론 크기, 개수, 형상 비록 특정 애플리케이션을 위해 조절 될 수 있으며, 웰의 크기가 증가 될 때 단일 세포 분리 효율은 항상 노출되어있다. 9,15

마이크로 웰의 크기가 세포의 확산과 성장을 허용하도록 확대하면서 이러한 제한을 극복하기 위해, 공원 등의 알. 높은 단일 셀 포착 비율 (58.34 %)가 삼각 마이크로 웰과 마이크로 유체 칩을보고 하였다. 그러나, (a 측 ~ 50㎛의 길이를 가진)이 마이크로 웰는 최대 2 일 동안 증식을 지원할 수있다. 16 우리 이중 웰 전략은 큰 마이크로 웰의 단일 셀 로딩 포아송 확률에 의해 제한되지 않을 수 있도록 분포는 dilu을 제한에서 발생기 방법과 크기 적.......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구는 국립보건연구원(National Health Research Institutes)의 보조금(03-A1 BNMP11-014)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 소프트웨어AutodeskAutoCAD LT 2011부품 번호 057C1-74A111-1001
실리콘 웨이퍼 Eltech corperationSPE0039
기존 오븐영신 회사ovp45
플라즈마 클리너NordsonAP-300벤치 탑 플라즈마 처리 시스템
SU-8 50 네거티브 포토레지MicroChemY131269
SU-8 100 네거티브 포토레지스트MicroChemY131273
Spin coaterSynrex Co., 주식 회사.SC-HMI 2" ~ 6"
핫플레이트YOTEC 회사YS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
SU-8 개발자Grand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GC프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트
스캐닝 레이저 프로파일 로미터KEYENCEVK-X 100
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. 위험한. 호흡기를 부식시키고 물과 격렬하게 반응합니다.
DesiccatorBel-Art ProductsF42020-0000공간 절약형 진공 탈착기 190  mm 화이트 베이스
폴리디메틸실록산(PDMS) 키트다우 코닝실가드 184
해리스 유니 코어 펀처테드 펠라 Inc.15072, 0.75mm 내경
탈착식 테이프3M CompanyScotch 탈착식 테이프 811
실체현미경Leica MicrosystemsLeica E24
소 혈청 알부민(BSA)Bersing TechnologyALB001.500
DMEM 기초 매체Gibco12800-017
소 태아 혈청Thermo HycloneSH30071.03HI
항생제BiowestL0014-100글루타민-페니실린-스트렙토마이신
재조합 효소 혼합물혁신적인 세포 기술AM-105Accumax
DiIC12(3) 세포막 염료BD Biosciences354218세포 추적기로 사용
주사기 펌프하버드 장치703007
플라스틱 주사기(1ml)BD Biosciences309659
23게이지 무딘 바늘Ever Sharp Technology, Inc.TD21
폴리테트라플루오로에텐(PTFE) 튜빙Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23T내경, 0.51  밀리미터; 외경, 0.82  밀리미터
스트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA

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Single Cell IsolationMicrofluidic ChipHigh throughput CultureMicrowell ArrayCell Capture WellsGravitational LoadingPDMS FabricationPlasma BondingClonal CultureHeterogeneity Analysis

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