방법 논문

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

DOI:

10.3791/54114

⸱

2016년 5월 8일

 , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Boston Children’s Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

초록

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창자 - 신체의 모든 장기의 면역 세포의 최대 개수를 포함 - 끊임없이 외래 항원, 미생물 및식이 모두 노출된다. 소장은 전신 질환의 숫자에 중요한 내에서 이러한 내강 항원이 면역 반응과 면역 세포의 교육을 형성하는 데 도움 것을 증가 이해 감안할 때, 장내 면역 체계의 특성에 대한 관심이 증가하고있다. 그러나, 많은 문서 프로토콜 힘들고 시간 소모적이다. 우리는 빠른 재현하고 힘든 퍼콜 구배를 필요로하지 않는 소형 장내 점막 고유 층, 상피내 층 및 파이어 패치에서 림프구 분리 여기 간단한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜 소장에 초점을 맞추고 있지만, 또한 결장의 분석에 적합하다. 또한, 우리는 특정 과학 QUES에 따라 추가 최적화를해야 할 몇 가지 측면을 강조기. 이 방법은이어서 유세포 분석 또는 특성화의 대체 수단을 사용할 수 림프구 가능한 다수의 분리가 발생.

서론

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소장의 주요 작업은 종종 영양 (1)의 분해 흡수가되는 것으로 간주된다. 대사 기능이 명확 필수적이지만, 소장의 루멘 내에있는 환경이 항원의 연속 사격으로부터 숙주를 보호 동등하게 중요한 역할을한다. 장내 외부 세계를 분리 (예., 내강 항원) 단일 전지 층 두께 상피 층 호스트의 내부 환경에서. 이와 같이, 작은 창자의 면역 시스템은 침입 병원균에 대한 강력한 대응을 설치하는 동안 최소한의와 점막을 입력식이 요법과 공생 미생물에서 외국 항원을 수있는 경우, 면역 반응을 반응성에 대한 임계 값을 균형의 강력한 작업이 다른 "유해한"항원. 이러한 항원에 대한 과도하거나 부적절한 면역 반응은 (병리학 적 질환으로 이어질 수 있습니다 예를 들어,., inflamma토리 장 질환, I 형 당뇨병, 다발성 경화증)과 3-6을 피해야한다.

전반적으로, 위장관 모든 항체 - 분비 세포 (7)의 70 % 이상 함유, 신체에서 가장 큰 면역 기관을 나타낼 것으로 생각된다. 고유 판 (LP)에서, 상피내 층 및 파이어 패치 (PPS) - - 작은 장 면역 체계는 3 개 주요 구획으로 구성되어 각각이 림프구의 독특한 그룹을 포함하는 것이다. LP에서 림프구 (LPLS)은 ~ 20 %의 B 세포 주로 TCRαβ + T 세포이고; 상피내 림프구 (IELs)는 TCRαβ + T 세포보다 TCRγδ + T 세포와 B 극소수의 셀을 포함하고; 그리고 작은 창자 벽에 내장 된 차 림프 기관이다 보호 프로파일은 ~ 8​​0 %의 B 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 해부학 적 영역의 각이 약간 별개의 기능과 존재 론적 기반을 가지고 있지만, 그들은에서 작동 아armonized 패션 병원성 모욕에서 호스트를 보호 할 수 있습니다.

또한, 미생물은 특정 미생물, 특히 세포 계통 8,9의 개체 발생의 동족 관계의 인식이 증가함에 따라 장 면역계의 개발을위한 중요한 결정이라고 성장 하락이있다. 또한, 장 면역계의 교육 해부학 먼 부위에 대한 면역 반응에 영향을 미치는 것으로 특정 (예., 관절염, 다발성 경화증, 폐렴), 그 이전에 10 인식보다는 장 면역계의 개발은 더욱 질병 과정에 중요한 것으로 명백 해졌다 -12. 이와 같이 정량적으로 장내 면역 체계를 평가에 대한 관심이 지금 호스트 공생 상호 작용과 많은 전신 질환의 발병도를 포함하는 호스트 병원체 상호 작용 이상으로 확장했다.

현재 방법의 가변성을 감안장내 림프구 분리, 필요한 시간 밸런싱 점점 중요하면서 수율 가능성 및 일관성을 최적화하는 방법. 퍼콜 구배를 포함 프로토콜, 시간과 노동 집약적과 인간의 오류 가능성이 더 많은 경향이 변수 수율로 이어지는 13을 생존. 여기서, 우리는 3 작은 창자의 면역 구획에서 림프구의 분리 및 특성에 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 또한, 점막 면역 체계에서 미생물에 의한 변화에 주어진 관심이 높아지고, 우리는 이러한 변화가 정량적으로 장내 면역 체계에 미치는 영향을 평가하기 위해 마우스와 미생물의 수평 전송을 허용하는 데 사용할 수있는 단계를 포함한다.

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프로토콜

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모든 연구는 실험 동물 과학을위한 미국 협회 (AALAS)에 의해 설정된 수의 기준을 충족 하버드 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 엄격한 검토 및 지침에 따라 실시 하였다.

공동 주택을 통해 박테리아의 1 수평 전송 (옵션)

  1. 식품 모두 멸균 된 물을 사용하여 멸균 일회용 케이지를 조립하는 동안 (무균 마우스를 사용하는 경우 특히) 외인성 오염을 최소화하기 위해 무균 기술을 연습.
  2. 사용 귀 펀치 또는 태그 개별적으로 다른 microbiotas 항구와 같은 케이지에서 그들을 집 6 주령 C57BL / 6 마​​우스를 표시합니다. 마우스 coprophagic하고 케이지 바닥에서 배설물 알약을 먹고 주어진 것으로, 미생물이 자연적으로 마우스 사이에 수평으로 전송됩니다.
  3. ≥1 주 동안 공동 주택 마우스는 이전의 분석에 미생물 전송 및 면역 학적 변화를위한 시간을 허용합니다.

    4. 작은 창자 상피내 층과 얇은 판의 propria에서 단일 세포 현탁액 2. 준비

    1. 솔루션의 준비
      1. (소장 당) 추출 미디어 준비 : 30 ml의 RPMI + 93 ㎕의 5 % 디티 오 트레이 톨 (DTT) (/ V w) + 60 ㎕의 0.5 M EDTA + 500 ㎕의 우 태아 혈청 (FBS). 사용하기 전에 즉시 DTT를 추가합니다.
      2. 25 ml의 RPMI + 12.5 mg을 디스 파제 + 37.5 mg의 콜라게나 II + 300 μL의 FBS (소장 당) 소화 매체를 준비합니다. 사용하기 전에 즉시 디스 파제와 콜라게나 제를 추가합니다.
      3. 37 ° C에 37 ° C, prewarm 솔루션에서 수행 된 모든 배양하십시오.
    2. 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식하여 마우스를 안락사.
    3. 아래로 마우스 등의 측면을 놓고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이. 순차적으로 이리저리 복부 중간 선을 따라 피부와 후 복막 근막을 절단하여 개복술을 수행하기 위해 가위를 사용하여따라서 복강을 노출, 칼 모양의 과정에 치골을 해요.
    4. 유문 괄약근에 병행하여 위장에서 소장을 분리하는 가위를 사용합니다. 조심스럽게 장간막 지방을 멀리 괴롭 히고, 복막에서 소장을 제거합니다.
      1. 완전히 소장을 제거하려면 ileo-맹장 접합에서 두 번째 컷을 확인합니다. 감기에 고립 소장을 배치 (예., 4 ° C) 10 % FBS를 포함하는 RPMI 세포 생존 능력을 극대화 할 수 있습니다.
    5. 부드럽게 곡선 집게를 사용하여 지방의 큰 조각을 제거합니다. 지방을 제거하는 동안 장 조직 자체를 찢어지지 않도록주의하십시오.
    6. 주사기에 부착 된 18 G 공급 바늘을 사용하여 차가운 PBS의 20 ㎖ - 15 장 내용, 부드럽게 세척 장을 제거하십시오.
    7. 보호 프로파일을 절제 가위를 사용하여, 5 % FBS를 포함하는 차가운 RPMI에 배치합니다. 보호 프로파일은 소장의 antimesenteric 측에 위치하며, 멀티 소엽 흰색으로 표시된다질량. 12 프로파일 - 특정 균주에 따라 마우스는 일반적으로 8있다.
    8. 4 인치 세그먼트 - (3)에 소장을 잘라.
    9. 멀리 조직에서 지방을 애타게 무딘 메스를 사용하여 RPMI에 적신 종이 타월에 각각의 작은 창자 세그먼트를 압연에 의해 잔여 지방을 제거합니다.
    10. 곡선 집게로 장 세그먼트를 cannulating 및 조직의 말단부를 파악하여 내부 조직을 켭니다. 부드럽게 조직이 반전되는 결과 (근위 단부에서 시작하는) 곡선으로부터 집게 조직 세그먼트를 제거하기 위해 직선 겸자 쌍을 사용한다.
    11. 30 추출 미디어 ㎖의 교반 막대가 들어있는 컵에 조직 세그먼트를 배치합니다. 컵에 뚜껑을 고정하고, 37 ℃에서 15 분 동안 500 rpm으로 교반; 교반 활발하지만 난류되지해야합니다.
    12. 배양 후, 흐린 나타납니다 상피 함유 상층 액에서 조직 조각을 분리 강철 여과기를 사용합니다. 이 뜨는 내가 포함되어 있습니다2.23 - 2.18 단계에서 샘플을 여과로 진행하여, 필요하다면 추가로 분석 될 수 ntraepithelial 림프구.
    13. 수동 잔류 추출 매체를 씻어 RPMI에서 조직 조각을 선동.
    14. 건조 종이 타월에 조직을 배치하고이 추출 매질에 의해 해방되지 않은 잔류 점액 제거를 용이하게하기 위해 단부에 걸쳐 여러 번 종료 플립.
    15. 소화 매체의 600 μL와 1.5 ML 튜브에 조직 조각을 놓습니다.
    16. 조각은 더 이상 가위에 충실하지 않고 용액이 균질 나타날 때까지 조직을 말하다 가위를 사용합니다. 이 단계에서는 조직 전체 효소 소화를 위해 중요하다.
    17. 소화 매체의 25 ml에 들어있는 컵에 다진 소장을 추가합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 500 rpm에서 교반한다. 반쯤 소화를 통해 (예. 15 분에), 최대 피펫 및 혈청 학적 피펫과 아래 조직의 큰 덩어리를 분쇄하기 위해.
    18. 필터 소화 조직 (또는 epith단계 2.12에서 elial 층의 경우 50 ML 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 처리 IELs는). 10 % FBS를 포함하는 RPMI 20 ㎖와 스트레이너를 씻어.
    19. 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에 필터링 솔루션을 원심 분리기.
    20. 조심스럽게 10 % FBS를 포함하는 RPMI 1 ml의 상층 액과에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
    21. 필터는 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 재현 탁. 10 % FBS를 포함하는 RPMI 20 ml의 스트레이너를 씻어.
    22. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 500 XG에 솔루션을 여과.
    23. 조심스럽게 2 % FBS를 함유하는 RPMI 1 ml의 상층 액 및 펠렛을 재현 탁 가만히 따르다.

    파이어 패치에서 단일 세포 현탁액 3. 준비

    1. 전송 (25) 소화 미디어 ㎖의 교반 막대와 컵에 보호 프로파일을 절제. 보안 뚜껑, 37 ° C에서 10 분 동안 500 rpm에서 스핀.
    2. 필터는 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 프로파일 소화. 어떤 덩어리의 REMA 경우에, 1 ML의 주사기에서 플런저의 평평한 끝 부분을 사용하여 스트레이너를 통해 키를 누릅니다.
    3. 10 % FBS를 포함하는 RPMI의 10 ml의 스트레이너를 씻어.
    4. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 500 XG에 솔루션을 여과.
    5. 조심스럽게 2 % FBS를 함유하는 RPMI 1 ml의 상층 액 및 펠렛을 재현 탁 가만히 따르다.

    유동 세포 계측법 4. 표면 얼룩

    1. 세포 분취 적절한 부피 (예., LPLS 200 μL)를 96 웰 둥근 바닥 플레이트에.
    2. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 접시를 반전시켜 상층 액을 가만히 따르다.
    3. RPMI이 2 % FBS가 포함 된 90 μL에 재현 탁 세포와 1 : 안티 CD16 / 32 (FC 블록)의 100 희석. 4 ℃에서 10 분 동안 품어.
    4. 10 μl의 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 접시를 반전시켜 상층 액을 가만히 따르다.
    5. 250 ㎕의 PBS에 재현 탁 세포. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 로 가만히 따르다 뜨는반전 판.
    6. 제조 업체의 프로토콜에 따라, 원하는 경우 생존 염료 (선택 사항) 얼룩 세포.
    7. 100 ㎕의 1 % 포르말린에 재현 탁 세포는 세포를 해결합니다. 4 ℃에서 어둠 속에서 1 시간 동안 품어.
    8. 200 μl의 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 접시를 반전시켜 상층 액을 가만히 따르다.
    9. 250 ㎕의 PBS에 재현 탁 세포. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 접시를 반전시켜 상층 액을 가만히 따르다.
    10. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁 세포. 유동 세포 계측기를 사용하여 세포를 분석한다.

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결과

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비장 (도 1a 및도 1b)와 같은 유사한 순방향 및 측면 산란 특성을 갖는 세포 분리 집단을 수득한다 작은 창자 림프구의 단일 세포 현탁액의 세포 계측 분석을 흐른다. 조직은 분리의 초기 단계에서 4 ℃로 유지되지 않은 경우, 림프구는 하부 전방 산란을 갖는 다른 상피 죽은 세포로부터 분리하기 어렵 인 림프구 집단에서 얻어진 다이 시작할 수있다 (도 1C) . 작은 창자 조직이 완전히 장간막 지방 세정되지 않으면 또한 림프구 (도 1D)의 전체 손실이 사실상 존재한다. 이러한 기능은 신속 작동 방법 샘플의 품질을 보장하는 것이 필요하다 (장간막 지방에도 소량을 제거, 즉.) (예., 조직 워밍업 할 수 없음) 및 세부 사항에 주목 나타낸다. Typica에서야 베드로, 우리는 ~ 작은 창자 LPLS (그림 1E)에 대...

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토론

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우리는 분리를위한 프로토콜을 제시하고 보호 프로파일의 LPLS, IELs 및 림프구를 포함한 작은 장 림프구의 세포 계측 특성 흐름. 미생물의 변화가 작은 창자의 면역 체계에 미치는 영향을 평가에 관심있는 경우, 우리는 세부 사항 다른 microbiotas을 품고 마우스와 생물의 수평 전송에 관련된 간단한 단계. 이 프로토콜은 소장에 초점을 맞추고 있지만, 순서는 오직 차이가없는 프로파일 제거되지한다 (결장 패치가 존재하지만, 이러한 조잡한 일반적 보이지 않는) 것으로되고 함께 대장 분석 동일하다.

작은 창자 조직에서 림프구의 최적의 분리를 달성하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 지방 조직의 세심한 제거는 림프구의 생존과 최적의 수율을 보장하는 데 절대적으로 중요하다. 또한, DTT는 추출에 사용되는 결정적이다 mucolytic상피 세포의. 그 불안정한 특성상, 우리는 다시 동결하지 않는 볼륨 ≤-20 ℃에서 5 % 용액의 일회용 분취 저장되지 제안. EDTA는 상피 세포 ...

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

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NKS는 NIH 상 K08 AI108690의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 장갑Kimberly-Clark555092
멸균 마우스 케이지InnoviveMS2-AD에는 뚜껑, 케이지 바닥 및 알파-드라이 침구가 포함되어
금속 피더InnoviveM-FEED
물병InnoviveM-WB-300
카드 홀더InnoviveCRD-HLD-H
오토클레이브 설치류 차우 (NIH-31M)Zeigler4131207530
RPMI 매체 1640Gibco11875-119
디티 오 트레이톨 (DTT)시그마D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)AmbionAM9262
소 태아 혈청 (FBS)GemBio100-510
Dispase IIInvitrogen17105-041프로토콜의 농도는 1.878 U/mg
콜라겐분해효소, 유형 II 의Invitrogen17101-015프로토콜의 농도는 245 U/mg의 활성 수준을 기반으로 합니다.
부 가위RobozRS-5882
수유 바늘(18G, 2인치 길이)RobozFN-7905
10ml 주사기BD305482
PBSGibco14190-250
일회용 메스(15 블레이드)Miltex4-415
곡선 집게RobozRS-5211
스트레이트 집게RobozRS-5132
다목적 컵, 120mlVWR89009-662
교반 막대VWR58949-062
다중 위치 교반 플레이트, 9 위치VWR12621-048
스테인리스 스틸 원뿔형 스트레이너, 3인치 RSVP
1.5 ml 튜브Eppendorf0030 125.150
100 μ m 세포 여과기팔콘08-771-19
40 μ m 세포 여과기Falcon08-771-1
50ml 원뿔형 튜브Falcon352098
1ml 주사기BD309659
96웰 플레이트, 둥근 바닥Corning3799
안티 마우스 CD16/32(Fc 블록)Biolegend101320
(옵션) 정착성 생존도 염료 eFluor 780eBiosciences65-0865-18
10% 포르말린, 중성 완충Thermo Scientific5725
있습니다 활성 수준을 기반으로 합니다. 해

참고문헌

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  13. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
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  15. Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
  16. Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

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