우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.
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이 논문에서
요약
초록
Site-directed mutagenesis는 단백질 구조, 기능 및 진화를 조사하는 방법으로 오랫동안 사용되어 왔습니다. 최근 대규모 병렬 염기서열분석 기술의 발전으로 많은 수의 돌연변이가 동시에 발생하는 기능적 또는 적합성 효과를 평가할 수 있는 가능성이 열렸습니다. 여기에서는 263 아미노산 항생제 내성 효소 TEM-1 β-lactamase를 예로 들어 고처리량 염기서열분석 기술을 활용하여 관심 단백질에서 가능한 모든 단일 아미노산 돌연변이의 효과를 실험적으로 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법에서는 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 라이브러리가 부위 지정 돌연변이 유발 PCR에 의해 구성되며, 각 위치를 가능한 모든 아미노산에 개별적으로 무작위화합니다. 그런 다음 라이브러리는 박테리아로 변환되고 β-락탐 항생제에 대한 내성을 부여하는 능력을 위해 선택됩니다. 그런 다음 각 돌연변이의 적합성 효과는 선택 전과 후의 라이브러리의 심층 염기서열분석에 의해 결정됩니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 고처리량 염기서열분석 판독 길이에 의해 수용되는 길이 그룹으로 인접 위치를 혼합하고 각 그룹에 바코드를 부착하기 위해 직교 프라이머를 사용함으로써 염기서열분석 판독 깊이를 최대화하고 전체 돌연변이 라이브러리를 동시에 선택할 수 있는 방법을 도입한다는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하는 대표적인 결과는 임상적으로 관련된 암피실린 용량에서 TEM-1의 모든 단일 아미노산 돌연변이의 적합성 효과를 평가하여 제공됩니다. 이 방법은 고처리량 선택 분석이 있는 다른 단백질로 쉽게 확장할 수 있어야 합니다.
서론
돌연변이 긴 생물학적 시스템과 진화의 성질을 연구하고, 향상되며 신규 한 기능 돌연변이 단백질 또는 생물체를 생성하기 위해 실험에 사용되었다. 초기 접근 방식은 생물의 무작위 돌연변이를 생산하는 방법에 의존하지만, 재조합 DNA 기술의 출현은 사이트 별 방식으로 DNA에 대한 선택의 변화, 즉., 부위 특이 적 변이 1, 2를 소개하고 연구 할 수 있었다. 현재의 기술은, 일반적으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이 유발에 올리고 뉴클레오티드를 이용하여, 주어진 유전자 돌연변이 3,4- 적은 수 (예., 점 돌연변이)를 작성하고 평가하기가 비교적 용이 한 것이다. 이것은 훨씬 더 어렵고 그러나 때 목표 방법, 예를 들면, 제작 및 평가 모두 가능한 단일 사이트 (또는 고차) 돌연변이.
많은 반면 m 다수의 평가하려 초기 연구에서 알게 된유전자 utations는 사용 된 기술은 5-7 균주 독립적 넌센스 감지기를 사용하여 각 돌연변이의 평가를 필요로하는, 예를 들면, 종종 힘들고되었는지 또는 인해 생거 시퀀싱 (8)의 저 시퀀싱 깊이로 그 정량 능력을 제한 하였다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 주로 높은 처리량 시퀀싱 기....
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프로토콜
참고 : 프로토콜의 개요는 그림 1을 참조하십시오. 프로토콜의 여러 단계 및 시약 ( "주의"로 표시) 안전 조치가 필요합니다. 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. 다른 지시가없는 한 모든 프로토콜 단계는 실온에서 수행된다.
1. 문화 미디어와 플레이트를 준비
- 준비하고 1 L 정제수 100 ㎖ 슈퍼 최적 국물 (SOB 표 1) 오토 클레이브에 의해 멸균 1 L 루리아 - 베르 타니 배지 (LB, 표 2) 및 1 L LB 한천 (표 3). 별도로 준비하고 세 배양 플라스크 각 포함 1 패 (LB)을 살균
참고 : 프로토콜 "물"을 의미 전반에 걸쳐 오토 클레이브 멸균 정제수를; SOB, LB와 LB 한천은 오토 클레이브 멸균 솔루션을 참조하십시오. - 70 % 에탄올 10ml에 0.12 g의 테트라 사이클린 히드로 클로라이드에 용해시켜 테트의 12 ㎎ / ㎖ 스톡을 준비한다. 0.2 μm의 필터와 저장소를 사용하여 소독4 °에서 C는 빛으로부터 보호.
- 다음 50 ° C 및 쿨 LB 한천은 구정 주식의 1 ㎖ (12 μg의 / ㎖ 구정의 최종 ....
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결과
직교 프라이밍 사이트를 포함하는 다섯 가지 변형 인 pBR322 플라스미드의 플라스미드지도 (pBR322_OP1 - pBR322_OP5)는도 2a에 도시된다. 직교 프라이머의 PCR은 다섯 pBR322_OP1-5 플라스미드와 함께, 각각의 직교의 프라이머 각 쌍을 사용하여 수행하거나, 모든 플라스미드를 뺀 직교 프라이머 쌍을 일치 플라스미드하고, 특정 여부를 테스트한다. 일치하는 플라스미드가 포함 된 경우 올바른 제품은 획득하고, 어떤 크기의 어떤 제품은 그것의 부재 (그림 2B)에서 얻어진되지 않았다.
대표적인 실험이 텍스트 (도 1)에 기술 된 프로토콜은 다음을 수행 하였다. 처리는 다음 (프로토콜 4.2) 6.2 × 10 6은 예비 선택 상태로부.......
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토론
여기 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 기술을 사용하여, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 관능 평가를 수행하기 위해 설명된다. 상기 방법의 중요한 특징은 클로닝 과정에서 직교하는 프라이머의 사용이다. 간단히, 각각의 아미노산 위치는 무작위 돌연변이 유발 PCR로되고, 시퀀스 길이 결합 높은 처리량 시퀀싱에 의해 수용되는 위치의 그룹으로 함께 혼합 하였다. 이러한 그룹은 직교 프라이밍 사이트 함께 혼합하고 선택 대상의 쌍을 포함하는 플라스미드 벡터로 클로닝하고, 직교 프라이머를 사용하여 디 멀티플렉싱하고,이어서 깊이 서열. 돌연변이 길이 제한 시퀀스 내의 판독 한정되기 때문에,이 방법은 유용 수가 긴 서열보다 크기가 유전자 돌연변이를 포함하는 길이가 읽혀 최대화한다. 또한,이 기술은 전체 mutatio 동시 또는 "하나의 배치"선택을 허용워크로드뿐만 아니라 돌연변이 선택 상이한 레벨을 경험할 가능성을 줄여 NAL 라이브러리. 실제로, 프로토콜 크게 우려 조직의 중요한 단계 : 복제 프로세스 (프로토콜 단계 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다
감사의 글
R.R.은 미국 국립보건원(National Institutes of Health, RO1EY018720-05), 로버트 A. 웰치 재단(Robert A. Welch Foundation, I-1366), 시스템 생물학 그린 센터(Green Center for Systems Biology)의 지원을 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Typtone | 리서치 프로듀셜 인터내셔널 | T60060-1000.0 | |
| 효모 추출물 | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 염화칼 | 그마-알드리치 | P9333-500G | |
| 황산마그네슘 | 시그마-알드리치 | M7506-500G | |
| 한천 | 피셔 사이언티픽 | BP1423-500 | |
| 테트라사이클린 염산염 | 시그마-알드리치 | T7660-5G | |
| 페트리 플레이트 | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| 올리고뉴클레오티드 프라이머 | 통합 DNA 기술 | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol 규모, 요청 |
| pBR322_AvrII | TEM-1 유전자 다운스트림의 AvrII 제한 부위를 포함하도록 변형된 pBR322 플라스미드 | ||
| pBR322_OP1 – | 포함하는 5개의 modified pBR322 플라스미드 | 요청 시 제공 | |
| New England Biolabs | M0491L | , 5x PCR buffer 및 PCR additive(GC enhancer) 포함, | |
| 15 ml 코니컬 튜브 | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR 플레이트, 96웰 | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96웰 플레이트 씰 | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96웰 열 순환기 | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x 겔 로딩 염료 | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| 에티듐 브로마이드 | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | ||
| EB 완충액 | Qiagen | 19086 | |
| 96웰 검은색 벽, 투명 바닥 분석 플레이트 | Corning | 3651 | |
| Lambda 파지 DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA 시약 | Invitrogen | P7581 | dsDNA 정량 시약, 프로토콜 단계 2.2.4에서 사용 |
| Victor 3 V 마이크로플레이트 리더 | PerkinElmer | ||
| DNA 정제 키트 | Zymo Research | D4003 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Corning | 3621 | |
| 장파장 UV 조명기 | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| 아가로스 젤 DNA 추출 버퍼 | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 전기 역량 E. coli | Avidity | EVB100 | |
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| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2089 | |
| 분광 광도계 (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Corning | 430828 | |
| Plasmid 정제 키트 | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 웰 PCR 스트립 튜브 | Axygen | 321-10-551 | |
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| 암피실린 나트륨염 | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq 시약 키트, v2 (500 cycles) | Illumina, | MS-102-2003 | |
| MiSeq 데스크탑 시퀀서 | , Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html 대안으로, Illumina HiSeq 플랫폼에서 시퀀싱을 할 수 있습니다 | |
| FLASh 소프트웨어 | John Hopkins University - 오픈 소스 | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | 소프트웨어를 사용하여 차세대 염기서열분석 데이터의 쌍단 판독을 병합할 |
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참고문헌
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155
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