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방법 논문

히트의 예방에 의한 흰쥐의 반작용을 스트레스

7K 조회수

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DOI:

10.3791/54122

⸱

2016년 7월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, Auburn University

이 논문에서

요약

우리는 유익한 박테리아로 경구 전처리를 통해 쥐의 열 스트레스 영향을 예방하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜은 다양한 투여 경로 및 다양한 화합물의 분석에 수정 및 사용할 수 있습니다.

초록

본 연구는 열 응력과 관련된 합병증에 대한 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 균주의 보호 효과를 평가하기 위해 디자인되었다. 서른 두 흰쥐이 연구에 사용되었다. 동물을 경구 B. 두 일 동안 하루에 두 번 처리 하였다 서브 틸리 BSB3 변형 또는 PBS. 다음날 마지막 처리 후, 각 그룹을 분할하고, 두 개의 실험 그룹 (하나는 PBS로 처리 한 B. subtilis에 처리) 25 분 동안 45 ℃로 넣었다. 두 대조군은 실온에서 25 분 동안 머물렀다. 모든 쥐를 안락사시키고, 다른 매개 변수는 모든 그룹에서 분석 하였다. 열 스트레스의 악영향 융모 높이 및 장 상피 점막 전체 두께의 감소에 의해 등록된다; 루멘에서 박테리아의 전위; 혈액 (LPS) 수준 리포 폴리 사카 라이드의 적혈구의 수포 및 고도 증가했다. 치료의 보호 효능은 사전 평가되고이러한 부작용의 vention. 이 프로토콜은 열 스트레스 합병증의 예방을위한 박테리아와 쥐의 구강 치료를 위해 설립되었다, 그러나이 프로토콜은 수정 및 관리의 다른 경로에 대해 서로 다른 화합물의 분석에 사용할 수 있습니다.

서론

다양한 스트레스 요인이 인간과 동물의 건강에 영향을 미칩니다. 체온은 가장 스트레스가 많은 요인 중 하나이며, 만성, 급성 및 치명적인 질병을 유발합니다1. 열 스트레스 후 장 형태의 변화와 장 장벽 무결성의 상실이 많은 사례에서 보고되었습니다2,3. 이 보호 장벽은 장내 세균과 그 독소, 특히 지질다당류(LPS)가 내강에서 내부 순환으로 이동하는 것을 방어하는 역할을 합니다4,5. 장내 미생물총(microbiota)의 안정성은 장 장벽 기능, 숙주의 면역 반응, 스트레스 상태에 대한 내성에 큰 영향을 미친다6. 따라서 장내 미생물총(microbiota)의 조절은 스트레스 관련 부작용을 예방하기 위한 새로운 접근법을 제공할 수 있습니다.

>jove_content<유익한 박테리아는 설사, 염증성 장 질환, 아토피 피부염,대사 장애 7-10과 같은 다양한 임상 상태를 성공적으로 관리하기 위해 장내 미생물군을 변형하는 유망한 전략으로 사용되어 왔습니다. 유익한 박테리아의 프로바이오틱스 효과에는 장 건강을 지원하는 필수 대사 산물 생성, 면역 체계 자극, 유당 내성 촉진, 상피 기능 장애 회복이 포함됩니다. 프로바이오틱스는 시험관 내 및 동물 모델에서 스트레스 관련 합병증을 예방하는 데 효과적이었습니다11,12.

연구자들은 바실러스 박테리아가 장 항상성을 지원하고13 숙주에 유익한 영향을 미치기 때문에 프로바이오틱스로서 바실러스 박테리아에 더 많은 관심을 기울였습니다14. 이전 데이터는 체외15,16 및 임상 시험17,18에서 병원체에 대한 바실러스 프로바이오틱스의 높은 효능을 입증했습니다. 여기에서는 열 스트레스 후 합병증에 대한 B. subtilis BSB3 균주의 예방 효과를 평가하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 오번 대학의 IACUC, 어번, 알라바마에 의해 승인되었다.

문화 미디어, 요리 및 세균 문화 1. 준비

  1. 영양 한천 플레이트에 밤새 성장 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 BSB3 문화의 하나의 식민지를 가진 플라스크에 영양 배지 10 ㎖를 접종한다.
  2. 리터 당 포자 매체 (19) (500 ml의 확인 : 박토 영양 국물, 8g, 10 % (w / v)의 KCl을 10 ml의 1.2 % (v)를 4 × 7H 2 O, 10 ml의 황산 / 승, 한천, (15) g) 및 20 분 동안 121 ℃로 오토 클레이브. 다음 멸균 솔루션을 50 ℃로 냉각하고 추가 할 수 있습니다 : 1 M 칼슘을 (NO 3) 2, 1 ml의; 0.01 M MnCl 2, 1 ㎖; 1 mM의 4, 1 ml의 병용했을.
  3. 실온에서 20 분 동안 40 O를 C에 차가운 준비 매체는 살균 캐비닛 (20) 무균 배양 접시의 각에 25 ml에 붓는다. 매체가 하룻밤 응고 수 있습니다.
  4. B의 하룻밤 문화의 0.5 ml의 확산acillus 서브 틸리 BSB3 페트리 접시에서 매체의 표면에. 90 %의 포자까지 5 일간 37 ℃로 문화를 품어. 고해상도 현미경에 의한 위상 밝은 포자를 알 수있다.
  5. 플레이트를 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 첨가하고 멸균 된 셀 확산기를 이용하여 표면으로부터 박테리아를 긁어 수확 박테리아. 필요할 때까지 냉장고에 정지를 저장합니다.
  6. O 37 ℃에서 24 시간 - 18 인큐베이션 포자 형성 배지 플레이트 상에 세균 현탁액의 적절한 희석액 (10-5 ~ 10-6)의 0.1 mL의 도금에 의해 박테리아의 생존을 확인
  7. 식민지 카운터를 사용하여 접시에 박테리아 식민지를 카운트하고 테스트를 정지 박테리아의 역가를 계산합니다. 최종 농도 1 × 10 8 CFU / PBS에서 ml의 세균 현탁액을 준비합니다.

2. 동물

  1. 300g - 32 수컷 흰쥐 (250을 사용하여). 표준 펠릿 차우와 물을 무료로 액세스 할 수있는 특정 병원균이없는 상태에서 동물을 유지한다. 평균 온도 (21 ± 1 O를 C), 습도 (50 ± 5 %) 및 12 시간 명암주기를 설정합니다.

3. 실험 설계

  1. 적응 2 일 후 구강 투여 (11)에 의해 동물의 치료를 시작합니다. 경구 위관 바늘과 주사기를 사용합니다. B. 16 쥐 치료 서브 틸리 BSB3 현탁액 (랫트 당 1 mL)을 이틀 동안 하루에 두 번씩 (B. 서브 틸리 기). PBS 16 쥐 (쥐 당 1 ㎖) 이일 (PBS 군) (그림 1)에 대한 하루에 두 번을 취급합니다.
  2. 그룹 1 제어 (PBS / 아니오 스트레스), 그룹 2 (B) : 치료 후, 각 그룹 (그룹당 8 쥐)를 세분화 서브 틸리 스 (B. 서브 틸리 / 아니오 스트레스), 그룹 3 스트레스 (PBS / 열 스트레스) 및 그룹 4- B. 서브 틸리 + 스트레스 (B. 서브 틸리 / 열 스트레스).
  3. ELEC를 사용하여 각 쥐 직장 온도 측정디지털 온도계를 TRONIC. 25 분 동안 실온에서 그룹 1 및 2의 쥐 유지. 45 O C에서 기후 챔버에서 그룹 3, 4, 상대 습도 25 분 동안 55 %의 장소 동물.
  4. 이후, 전자 디지털 온도계를 이용하여 모든 군의 각 쥐 직장 온도를 측정한다. 4 시간 동안 실온에서 모든 동물을 놓습니다.
  5. 밀봉 마취 항아리 - (4 % 2)와 쥐 깊이 (발가락 핀치에 대한 응답의 부재) 마취 될 때까지 관찰 이소 플루 란과 쥐를 마취. 단두대와 빠른 잘린 쥐를 안락사.
  6. 혈청을 얻는 즉시 현미경 검사 용 피펫으로 혈액 샘플 (각 쥐에서 7 μl를) 데리고 apyrogenic 튜브에 apyrogenic 피펫과 - (16 ml의 15) 각각의 쥐 20에서 트렁크 혈액을 수집합니다.
  7. 응고 할 수 있도록 적어도 30 분 동안 냉장고에 혈액 튜브를 넣어. 20 O C에서 원심 분리기 튜브, 7,000 XG에 10 분 동안 빠르게피펫으로 혈청을 제거합니다. 분석 할 때까지 -20 ℃로 각각 50 μl의 볼륨에 쥐 저장소에서 얻은 나누어지는 혈청.

4. 수술

  1. 잘라 내기 / 전기 가위로 시체의 아래쪽 복부 및 흉부의 모든 모피 트림. 살균 캐비닛에 시체를 놓고 70 % 알코올로 시체의 면도 표면을 처리.
  2. 복부의 정중선 절개를 만들기 위해 멸균 메스를 사용합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 쥐에서 간, 장간막 림프절, 비장과 소장을 제거합니다.

세균 전좌 5. 분석

  1. 미리 무게 멸균 튜브에 간, 장간막 림프절, 비장의 각 샘플을 놓고 무게. 시료와 관의 무게와 빈 튜브의 중량 차이로 시료의 중량을 계산한다.
  2. 1:10 희석을 얻기 위해 튜브에 멸균 PBS를 추가 (w / v)의의 샘플 및 homoge균질 현탁액 (21)을 얻기 위해 멸균 유리 조직 균질 각 샘플 nize.
  3. 멸균 PBS에서 각 샘플의 일련 희석 (10-1 10-4)을 확인합니다. 접시 헤민 (0.005 g / L) 및 비타민 K1 (0.01 g / L) MacConkey 플레이트의 표면의 5 %의 혈액 한천 브루셀라 혈액 한천 상 각 조직의 모든 희석액 0.1ml를.
  4. 37 입출력 C 22 MacConkey의 5 %의 혈액 아가 플레이트 및 호기성 브루셀라 혈액 아가 플레이트 혐기성 조건에서 부화.
  5. 24 시간 후에 호기성 세균의 콜로니를 카운트하고, 배양 48 시간이 콜로니 계수기를 사용하여 후 혐기성 세균의 콜로니. 조직의 그램의 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수와 그 결과를 표현한다.

6. 조직 학적 분석

  1. 수술에 의해 각각의 쥐에서 소장 샘플을 제거 (- 4.2 4.1 단계). 파라핀에 포함 Bouin의 정착액의 샘플을 수정헤 마톡 실린 및 에오신 표준 절차 (23)를 이용하여 6 μm의 섹션과 얼룩 섹션을 준비합니다.
  2. 각 샘플 (배율 100 배) 24 장 융모 총 점막 두께의 높이를 측정하는 고해상도 현미경 시스템을 사용한다. 각 쥐​​에서 4 샘플을 분석하고 각 샘플에 최소 20 측정을합니다. 마이크로 미터의 결과를 표현한다.

7. 사이토 카인 분석

  1. IL-1β 상업 쥐 ELISA 키트를 사용하여; IL-6; TNF-α; INF-γ 및 IL-10는 제조사의 프로토콜에 따라 혈청 사이토 카인의 수준을 측정한다.
  2. 관련 장비에 대한 표준을 사용하여 분석 시료의 각 세트에 대한 표준 곡선을 생성합니다. 적절한 표준 곡선과 실험 데이터를 비교하여 각 샘플에서 사이토 카인의 수준을 정의합니다.

8. 리포 폴리 사카 라이드 분석

  1. 래트에 따른 LPS ELISA 키트를 사용하여 혈청 LPS 레벨 분석제조 업체의 프로토콜입니다. 표준 곡선의 값으로 얻어진 값의 비교에 의해 샘플에서 LPS의 농도를 추정한다.

혈액의 9 고해상도 광학 현미경

  1. 이전 25, 26 설명 현미경 시스템을 사용합니다. 라이브 화상을 기록하는 현미경 시스템을위한베이스 및 비디오 카메라와 컴퓨터 (25) 등의 제진 플랫폼을 사용한다. 이전 27 바와 같은 리차드슨 슬라이드를 이용하여 테스트 영상을 보정한다.
  2. 유리 슬라이드, 커버 슬립, 사진의 각 쥐에서 갓 그린 혈액의 7 μl를 놓고 각 샘플 (확대 1,700X) 72 × 53.3 μm의 2 열 이미지 프레임을 기록합니다.
  3. 실시간으로 고해상도 직시 광학 이미지를 제공하는 소프트웨어를 사용하여 소포의 농도를 측정한다. 각 실험 조건 28 20 이미지 프레임의 최소를 검사합니다.

10 Statis틱

  1. 평균과 표준 편차 등의 모든 값을 표현한다. 통계 분석 및 그래프 플로팅을 수행합니다. 두 표본 t 검정으로 결과를 분석 통계적 유의성을 정의하는 0.05의 유의 수준을 설정한다.

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결과

열 스트레스 후 바로 전에 동물의 체온의 평균은 각각 36.7 ± 0.07 입출력 C 및 40.3 ± 0.17 O C (P <0.05)이었다. 열 (그룹 3)로 쥐의 노출 융모 높이의 현저한 억제 및 점막 전체 두께의 결과 (도 2, 3 참조). 열 유해한 영향에서 스트레스 보호 소장 전에 BSB3 균주의 경구 투여.

장내 세균은 세균의 전위 장간막 림프절 분석 (MLN) 간 및 각 쥐의 비장에 의해 결정 하였다. 1.7 × 103 ± 4.6 × 10 2 CFU / g 조직 (그림 4)의 농도로 세균 배양 MLN에서만 고립 된 쥐의 간 (그룹 3) PBS로 사전 처리 및 열에 노출. 대조군에서 모든 테스트 샘플 (그룹...

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토론

심각한 건강 상태 (29)에서, 고온에 노출 된 결과. 예방 및 열 스트레스와 관련된 합병증의 조기 발견은 매우 중요 (30)이다. 제시된 프로토콜은 열 스트레스 부작용 방지를위한 다양한 방식의 효능을 평가하는 데 사용될 수있다.

이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 다음과 같습니다 열처리 과정 (45 O C, 25 분); 수집 및 독소 오염을 방지하는 혈액 처리 중 apyrogenic 재료의 사용; 동결 융해를 반복을 피하기 위해 -20 ℃로 혈청 분취 량을 유지; 세균 전위의 분석에서 멸균 절차에 따라. 이 프로토콜은 열 스트레스의 부작용 방지를위한 박테리아와 쥐의 구강 치료를 위해 설립되었다. 관리 및 다른 화합물의 다른 경로의 경우,이 프로토콜은 수정 될 수 있습니다. TR의 예를 들면, 시간열 스트레스 전에 eatment은 확장 될 수있다. 경구 투여는 직장 ...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Auburn University 기금 FOP 101002-139294-2050의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수(PBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP4417
에틸 알코올 Pharmco products Inc. 미국 코네티컷주 브룩필드 64-17-5
한VWR97064-334
맥콩키 한천 플레이트VWR470180-742
5% 혈액 한천 플레이트VWR89405-024
브루셀라 혈액 한천 플레이트 Hemin, 비타민 KVWR89405-032
Bouin' s FixativeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA15990
IL-10 Rat ELISA kitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0011
IL-6 Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0061
INF-gamma Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USA
TNF-alpha Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USAKRC3011
Rat LPS ELISA KitNeoBioLab, MA, USARL0275
Environmental Chamber 6020-1Caron, Marietta, OH, USA6020-1
원심분리기 Beckman Coulter, 인디애나폴리스, 미국, Optima L-90K
울트라 원심분리기
광학 현미경 광학 시스템CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Colony 카운터Fisher Scientific, 피츠버그, 펜실베니아, 미국RE-3325
FreezerHaier, 브루클린, 뉴욕, 미국HCMO50LA
울트라 마이크로플레이트 리더Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx 808
자동 스트립 워셔Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx50
피펫Gilson, Pipetman, FranceP100, P200, P1000
C24 인큐베이터 쉐이커New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USAClassic C24
Rocking Shaker Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA55
페트리 접시Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA875713100 mm x 15 mm
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Sanford, ME, USASG403
Culture Growing FlasksCorning Incorporated, Corning, NY, USA4995PYREX 250 ml 삼각 플라스크
광학 분광계 Genesys 20Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬.4001
Sony DXC-33 비디오 카메라Sony
Richardson 테스트 슬라이드전자 현미경 과학, Hatfield, PA, USA80303
Millipore 정수 시스템MilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus 소프트웨어미디어 사이버네틱스, MD, 미국
트리플 빔 밸런스오하우스 코퍼레이션, Parsippany, NJ, 미국
조직 균질화기, DounceVWR71000-518
천 KRC4021

참고문헌

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