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방법 논문

생존 시간의 측정에

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

2016년 7월 22일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

이 논문에서

요약

윤충류는 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 동물성 플랑크톤입니다. 여기에서는 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 여러 세대에 걸친 배양 조건의 동기화는 모계 조건이 자손의 생활사에 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다.

초록

윤충류는 짧은 수명, 배양의 용이성, 클론 배양을 가능하게 하는 단성형성과 같은 몇 가지 장점으로 인해 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 코스모폴리탄 동물성 플랑크톤입니다. 그러나 생존 시간을 측정할 때는 모계의 나이와 모계의 섭식 조건에 영향을 받기 때문에 주의가 필요합니다. 여기에서는 여러 세대에 걸친 배양 조건의 신중한 동기화에 따라 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 경험적으로 볼 때, 동기화가 불량하면 조기 사망률이 발생하고 생존율이 점진적으로 감소하여 통계적 검정력이 약해집니다. 실제로, 이러한 조건 하에서, 칼로리 제한(CR)은 B. plicatilis의 수명을 크게 연장하지 못했지만, 과거와 현재의 연구에서 잘 동기화된 윤충류 샘플로 CR로 유도된 수명이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 초파리 Drosophila melanogaster와 선충 Caenorhabditis elegans를 포함한 다른 무척추 동물 모델에 유용 할 수 있습니다.

서론

로티퍼는 문 Rotifera 1을 구성하는 미세한 국제 동물 플랑크톤 (<1mm)입니다. 이들은 약 1000 체세포과 특성 차륜 형 섬모 장치 이루어지는 간단한 신체 운동 계획 및 공급을 위해 사용되는 코로나라고있다. 대부분의 로티퍼는 약 1,600과 500 종 각각 2를 포함하는 클래스 단 소강 또는 질 형목에 속한다. bdelloid 로티퍼가 의무 처녀 생식 (3)에 의해 재생하는 동안 단 소강 로티퍼는 일반적으로 모두 성적과 무성 생식 단계 (순환 처녀 생식)가 있습니다. 이 실험에서 높은 재현성을 보장 전적으로 동일한 로티퍼 개인을 얻는 것이 가능하다. 또한, 그들은 짧은 수명, 배양 용이성, 게놈과 transcriptomic 4-7 시퀀스 데이터의 가용성, 및로부터 떨어진 독특한 계통 위치로서 모델 생물 여러 다른 장점을 가지고rthropods 및 선충 8. 로티퍼 따라서 생태 학적, 독성의 무척추 동물 모델을 약속하고, 연구 9-12 노화된다.

환경 스트레스 또는 화학 물질에 노출 하에서 생존 시간이 13-19 연구 분야에서 자주 측정 된 파라미터이다. 이 어머니의 환경 조건에 민감하기 때문에 피퍼의 생존 시간을 측정하는 경우에는주의가 필요하다. 즉, 단 소강 로티퍼 Brachionus의 manjavacas에 세 어머니에서 여성 자손은 젊은 산모에서보다 짧은 수명을 가지고, 그러나 산모의 칼로리 제한 (CR)은 부분적으로 고급 산모의 나이 (20)의 해로운 효과를 상쇄. B.에서 plicatilis, 산모 CR은 자손의 수명, 기아에서 오래 생존 기간 및 항산화 효소 (21, 22)의 강화 된 표현과 관련된 높은 산화 스트레스 저항을 제공한다. 임산부 연령 효과또한 bdelloid 로티퍼 (23)에서 관찰되었다. 따라서, 실험 로티퍼의 조건을주의 깊게 생존 시간을 측정하기 전에 몇 세대에 걸쳐 동기화되어야합니다.

여기에서 우리는 여러 세대에 걸쳐 배양 조건의 동기화 다음 Brachionus의 로티퍼의 생존 시간의 측정을위한 프로토콜을 제공합니다. 간헐적 단식 (IF), 피퍼 주기적으로 공급되는 CR의 변형은 22, 24에 의한 장수 IF의 잘 알려진 효과 동기화의 효과를 나타 내기 위해 적용 하였다.

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프로토콜

미디어의 1. 준비

참고 : 사용에게 염분 16.5 PPT (PSU)의 반 희석 Brujewicz 인공 해수를. 다른 인공 seawaters도 자주 문화 Brachionus의 로티퍼 (25), (26)에 사용된다.

  1. 454 mM의 염화나트륨을 추가, 26 밀리미터의 MgCl 2, 27 mM의 황산, 10 밀리미터의 KCl, 증류수 10 mM의 CaCl2를 4.5 L은 (최종 부피 5 L 될 것입니다). 또한, 탈 희석 물 대신에 증류수를 사용합니다. 다른 모든 염을 용해 후 CaCl2를 추가합니다.
  2. 0.48 M의 NaHCO3 원액 (200 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 25 ML을 추가합니다. NaHCO3을 최종 농도가 2.4 mm이다.
  3. 0.4 M NaBr은 원액 (500 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 10 ㎖를 추가합니다. NaBr은 최종 농도가 0.8 mm이다. 증류수로 5 L까지합니다.
  4. 0.45 ㎛ 멤브레인 필터 솔루션 필터.사용하기 전에 그것을 멸균 수로 2 회 희석 (v / v)로.
    참고 :이 원액으로 Brujewicz 인공 해수의 2 배 농도를 할 수있다.

2. 일반 문화 조건

  1. 문화 실험실 제기 또는 20 및 30 °의 C 사이의 멸균 100 ㎖ 비이커에 야생 캡처 로티퍼. 높은 온도는 더 짧은 수명 가속 재생을 초래한다. 실험의 편의를 위해 25 ° C를 사용합니다. 로티퍼 밀도 또는 인공 해수의 부피는 여기에 큰 문제가되지 않습니다.
  2. 인공 해수 (11) 문화식이 미세 조류 종. 스넬 등의 알을 참조하십시오. (2014) 자세한 내용은 11. 일반적으로, Tetraselmis의 tetrathele 사용 (~ 2 × 10 5 세포 / ㎖ 27,28), T. suecica (~ 6 × 10 5 세포 / ㎖ 25,29), 및 Nannochloropsis의 oculata (~ 7 × 10 6 세포 / ㎖ 30, 31). 다이어트 조류 때문에 (종, 문화 CONDIT이온, 생화학 적 조성물은) 상당히 모든 실험군에서 microalga 같은 많이 사용, Brachionus의 로티퍼의 생존 기간에 영향을 미친다.
  3. 먹이 (예를 들어, 2 일마다 먹이를 매주 접종) 가끔 미디어를 변경하여 배치 문화에 로티퍼의 재고 인구를 유지합니다. 로티퍼가 최적의 상태에있을 때 많은 신생아 2-3 계란 베어링 성인 관찰 할 수있다.
    참고 : 실험 로티퍼를 얻기 위해 또 다른 방법은 휴식 달걀을 부화하는 것입니다. 휴식 계란에서 부화 로티퍼 잘 동기화 된 것으로 간주, 그들의 수명은 amictic 계란 (11) 부화 로티퍼의 그것과 크게 다르지 않다된다. 그러나, 휴식 계란에서 로티퍼 이전 amictic 계란에서보다 재생을 시작합니다. 따라서,주의는 생식 특성의 측정이 필요하다.

사전 문화에 의해 로티퍼 3. 동기화

  1. 보안 목표 명세서에서 하나의 로티퍼를 선택옥토퍼스의 인구와 문화로 실험에 사용되는 하위 집단을 설정 2.1-2.3에 설명. 2 주 동안 일반적으로 문화.
  2. 하위 집단에서 계란 베어링 로티퍼를 수집 (실험에 사용되는 개인의 이중 번호를 수집). 단일 코호트 같은 배양을 (농도 : ~ 50 개인 / ㎖) 광고 무제한 공급하에 신선한 배지에서 2.1-2.3에서 설명한 바와 같이, 6 웰 배양 플레이트이다. 조절 된 매체가 Brachionus의 로티퍼 (32, 33)의 생식 생리에 영향을주기 때문에 인구 밀도를 제어하는 것이 중요합니다.
  3. 새로 준비 문화 매체에 성인의 첫번째 계란에서 부화 신생아를 전송합니다. 2 ~ 3 세대에 걸쳐이 절차를 반복합니다.
  4. 생존 시간을 측정하기위한 소정의 시간주기 (예를 들어, <3 시간)에서 빗금 신생아를 사용한다. , 색인 전압 여러 가지를 사용하여 재현성을 확인 매우 희한하지만, 하나의 개인을 선택할 가능성 편견을 방지하기 위해늘어진 하위 집단.
    참고 : 로티퍼는 일반적으로이 조건으로 만 무성 생식으로, 어떤 남성이 실험을 통해 존재하지 않는 확인합니다. 남성은 신생아보다 작은 일반적으로 빠른 여성보다 이동합니다. Mictic 여성은 특정 조건 (29)에서 amictic 여성 다른 수명을 가지고있다.

생존 시간 4. 측정

  1. 플라스틱 접시에 배치 신생아 (인공 해수의 각 웰 포함 1 mL를 일반적으로 24 또는 48 웰 플레이트).
  2. 24 시간 간격으로, 만약 높은 온도 (위 30 ° C 이상)에서 새로 제조 된 배양 배지 또는 12 시간 간격으로 로티퍼를 전송합니다. 자손의 수를 기록하고 각 개인은 죽은이나 살아 있는지 여부. 코로나의 섬모 운동이 완전히 정지했을 때 죽은로 로티퍼를 기록합니다.
    참고 피퍼 종종 웰의 측벽에 부착. 물을 부드러운 피펫 그들을 찾는 데 도움이됩니다. 로티퍼를 찾을 또는 아칸소되지 않은 경우전자는 실수로 "검열​​"라고하지 "죽은"로, 그들을 기록, 피펫에 의해 손상.
  3. 실험 로티퍼 적극적으로 재생 될 때 신생아를 제거합니다. 신생아 빠르게 성장하고 실험 피퍼 구별 때때로 어렵다.

5. 데이터 분석

  1. 카플란 - 마이어 생존 곡선 (도 1 및 2)를 X 축, Y 축 및 시간을 누적 생존율을 플로팅하여 만들기. 이 생존 데이터의 일반적인 표현이다. 생존 시간 (34)의 통계 비교 (또한 벽난로 - 콕스 테스트라고도 함) 비모수 로그 순위 테스트를 사용합니다. 로그 순위 테스트는 또한 JMP와 R. 같은 다른 표준 통계 패키지에 포함되어 있습니다
    주 : 정규 분포는 일반적으로 생존 데이터 (35)에 의해 충족되지 않기 때문에 학생의 t- 테스트 또는 파라 메트릭 다중 비교 다음 분산 (ANOVA) 분석을 사용하지 마십시오. 또한, 이러한 운전 방식DS는 계정에 검열 개인을하지 않습니다. 더 검열 데이터가없는 경우 맨 - 휘트니 U 시험을 이용할 수있다.

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결과


그림 1은 제대로 동기화 인구 (두 개의 복제 만점)의 대표적인 생존 곡선을 보여줍니다. 이 실험에서, 로티퍼이었다 중 공급 일상 [광고 무제한 (AL) 그룹] 또는 (그룹 IF) 매일. 평균 생존 기간은 각각 그룹화 AL 및 IF (13) 18 일이었다. 이를 잘 IF는 로티퍼의 수명을 연장하는 것이 알려져 있지만,이 실험은 AL 및 그룹 IF 수명 사이의 유의 한 차이를 검출하지 못했다. 경험적 조기 사망률과 생존율의 점진적인 감소가 불충분 동기화 결과는이 실험에서 관찰했다. 하위 집단에 대한 부적절한 처리 또는 낮은 수질로 인한 로티퍼 손상과 유사한 결과를 얻을하는 경향이있다.

로티퍼 조건이 최적 잘 동기화되면, 조기 사망은 거의 관찰되지 및 accordin된다의 Gly 로티퍼 실험 ...

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토론

현재의 프로토콜 Brachionus 피퍼의 생존 시간을 측정하는 방법을 설명한다. 중요한 단계는 여러 세대에 걸쳐 로티퍼 상태의 동기화이다. 실험 피퍼 잘 동기화되면 여러 선행 연구 18,24,37,38에보고 된 일반적인 유형 I 생존 곡선은 거의 조기 사망이 관찰된다. 생존 시간의 표준 편차 따라서 높은 통계 전력의 결과로 가난하게 동기화 로티퍼에 비해 작아진다. 동기화는 또한 생존 시간 측정의 재현성을 향상 할 것으로 예상된다 - 엄마 최적 조건에서 배양되므로, 현재 프로토콜 모체 세대의 가능한 해로운 효과를 상쇄. 조기 사망률이 여전히 조심 동기화 후 관찰되는 경우, 새로 준비 문화 미디어 사용을 고려, 즉 먹이 조류, 또는 새로 설립 된 실험 집단의 다른 많은 (,) 프로토콜 3.1에서 시작합니다.

이 프로토콜의 제한은 잘 동기화 로티퍼 잠재적 통해 문자를 구분한다는 것입니다. 예를 들어, 수명을 연장...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 촬영에 그들의 도움을, 조지 자비스, 마사 복, 그리고 베티 Hecox - 레아, 해양 생물 연구소에 감사하고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨Wako190-13921
염화마그네슘Wako136-03995
황산마그네슘Wako131-00427
염화칼Wako168-22111
염화칼슘Wako035-00455
중탄산나트륨Wako199-05985
브롬화나트륨Wako190-01515
멤브레인 필터(0.45 &마이크로; m 기공 크기)MilliporeHAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treatedThomas Scientific6902D01Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treatedThomas Scientific6902D07Flat bottom
Tetraselmis, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersion 6.0d
륨

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