환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

요약

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

초록

메틸화 다른 조직 유형의 안정 발생과 분화에 필요한 유전자의 정확한 조절을 담당하는 DNA에 필수적인 후생 변형 중 하나이다. 이 과정의 이상 조절은 종종 암과 같은 다양한 질환의 특징이다. 여기서, 우리는 최근 시퀀싱 기술을 간략 메틸 - 바인딩 많은 환자 집단에 대한 다양한 정상 및 질병 조직에 메틸화를 정량화하는 데 사용되는 캡쳐 DNA 시퀀싱 (MBDCap-SEQ)를. 우리는 최적의 정량화를 달성하기 위해 생물 정보학 파이프 라인과 함께이 친 화성 농축 방법의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 1000 methylome 프로젝트 (암 Methylome 시스템)의 일부로서 다양한 종류의 암 환자에 걸쳐 수백 시퀀스 사용되고있다.

서론

DNA 메틸화를 통해 유전자의 후생 유전 학적 조절은 본체 ^(1)의 서로 다른 조직 유형의 안정에 의해 분화 세포의 운명을 결정하기 위해 필요한 필수 메커니즘이다. 이 과정의 이상 ^조절이 암을 비롯한 다양한 질환을 일으키는 것으로 알려져있다.

이 프로세스는 주로 DNA ^(3)의 CpG 디 뉴클레오티드의 시토신 잔기에 메틸기의 첨가를 포함한다. 현재 많은 연구 ^2-8에서 설명한 바와 같이 각각 자신의 장점을 갖는 이러한 메카니즘을 조사하기 위해 사용되는 몇 가지 방법이있다. 여기에서 우리는 우리가 DNA의 메틸화 지역을 식별하는 친 화성 농축 기술을 사용 (MBDCap-SEQ) 메틸 바인딩 DNA 캡처 순서라는 이러한 기술 중 하나를 설명합니다. 이 기술은 메틸화 된 CpG 부위를 함유하는 게놈 DNA 단편에 대한 농축하는 MBD2 단백질 메틸 결합능에 만든다. 우리는 상업 메틸화 된 DNA 농축 키트를 활용이러한 메틸화 영역의 분리를위한. 우리의 실험은이 기술을 사용하여 환자 샘플 수백 스크리닝하고 여기 큰 환자 집단을 조사하는데 사용될 수있는 최적화 된 광범위한 프로토콜을 제공한다.

모든 차세대 시퀀싱 기술 명백한 바와 같이, MBDCap-SEQ 또한 정확하게 샘플 통해 메틸화의 수준을 정량화하기 위해 특정 바이오 인포....

프로토콜

모든 조직은 임상 시험 심사위원회위원회의 승인을 다음과 얻어진 모든 참가자가 분자 분석과 후속 연구에 모두 동의 할 때. 프로토콜은 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 인간 연구위원회에 의해 승인됩니다.

1. 메틸 결합 DNA 캡처 (MBDCap)

1. 샘플 수집 및 DNA 분리
   1. 환자 파라핀 조직 샘플에서 대량 종양 또는 정상 조직 샘플을 수집합니다.
   2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 파라핀 조직 샘플에서 게놈 DNA를 분리 상업 DNA 미니 키트를 사용합니다.
   3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 여기에 설명 된 절차에 메틸화 DNA 농축 키트를 사용합니다.
2. 초기 비드 세척
   참고 : 구슬은 게놈에 DNA 메틸화를 검출 MBD - 비오틴 단백질과 커플하는 데 사용됩니다. 구슬은 일반적으로 일시 중단주식 솔루션입니다. 이 액체를 씻어하려면 다음 단계를 사용합니다.
   1. 균일 한 현탁액을 얻기 위해 아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 스트렙 타비 딘 비즈 (재료 표 참조)의 주식을 재현 탁합니다. 텍싱하여 구슬을 혼합하지 마십시오.
   2. 입력 DNA 중 하나 μ....

결과

우리는 그 중에서도 유방 ^{12, 13,} 자궁 내막, 전립선 ^(14), 및 간암 등 다양한 종류의 암 환자에서 다수의 DNA 메틸화 변화를 연구 MBDCap - 배열을 사용했다. 여기에서 우리는 최근에 ¹² 게시 된 유방암 연구에서 몇 가지 정보를 보여줍니다. 이 예에서, 우리는 다른 차등 게놈 영역에 걸쳐 정상에 대해 종양 메틸화 된 CpG 섬을 식별 총 유전체 방식을 사용 하였다. 조사는 개 가운데 유전자 프로모터 (N = 13,081)에 위치 된 CpG 섬을 조사 19.5 %가 정상에 비해 종양에서 차동 메틸화를 보였다 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 6959 유전자 내의 CpG 섬에서, 55.2 %는 차동 메틸화를 보였다. 유전자 간 발기인 4847의와의 CpG 섬이없는 유전자 프로모터에 대해 28.1 %를 보여, 5454 조사 지역의 1.8 % 차동 DNA 메틸화 (그림 1A)을 보여 주었다. 시각적 표현(그림 1B)는

토론

MBDCap-SEQ 기술은 환자 ^(15)의 다수 집단을 조사 할 때 비용 효율적인 대안으로 고려 친 화성 농축 방법 ^(3)이다. 여기에 제시된 파이프 라인은 데이터 분석 및 해석에 샘플 조달에서 포괄적 인 접근 방식을 설명합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 DNA 메틸화가 발생하는 곳이므로 게놈에서 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키기 위해 PCR 증폭 과정을 설정한다. 또한, 시퀀싱 후, 각각의 샘플이 유일하게 매핑 적어도 20 개 이상의 백만 게놈을 읽고 있는지 확인하는 것이 필수적이다. 이 범위는 전체 게놈 ^(12)을 매핑하는 데 충분한 깊이 농축 또는 시퀀스를 제공 할 것으로 예상된다. 이 범위가 부분에서 그 샘플에 대한 특정 샘플에 대한 염기 서열의 첫 라운드 더 많은 DNA 동안 충족되지 않으면 하나를 사용할 수, 두 번째 부분에서 시퀀싱의 또 다른 라운드를 실행할 수 있습니다. 결과는 연구와 병합 할 수 있습니다 읽기첫 라운드에서 EADS는 커버리지를 달성했다. 전체 실험은 복사 번호 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메틸 마이너 DNA 농축 키트	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus 초음파 처리 장치	diagenode	B01020001
3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	완전 자동화된 라이브러리 건설 시스템
어댑터 프라이머	Bioo Scientific	514104	PCR 프라이머 믹스
Qubit	Invitrogen	Q32854	형광 정량 분석 시스템
PCR 마스터 믹스	KAPA Scientific	KK2621	PCR 마스터 믹스
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR 정제 비드
EB 버퍼	Qiagen	19086
HiSeq 2000 염기서열분석 시스템	Illumina