환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

요약

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

초록

메틸화 다른 조직 유형의 안정 발생과 분화에 필요한 유전자의 정확한 조절을 담당하는 DNA에 필수적인 후생 변형 중 하나이다. 이 과정의 이상 조절은 종종 암과 같은 다양한 질환의 특징이다. 여기서, 우리는 최근 시퀀싱 기술을 간략 메틸 - 바인딩 많은 환자 집단에 대한 다양한 정상 및 질병 조직에 메틸화를 정량화하는 데 사용되는 캡쳐 DNA 시퀀싱 (MBDCap-SEQ)를. 우리는 최적의 정량화를 달성하기 위해 생물 정보학 파이프 라인과 함께이 친 화성 농축 방법의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 1000 methylome 프로젝트 (암 Methylome 시스템)의 일부로서 다양한 종류의 암 환자에 걸쳐 수백 시퀀스 사용되고있다.

서론

DNA 메틸화를 통해 유전자의 후생 유전 학적 조절은 본체 ^(1)의 서로 다른 조직 유형의 안정에 의해 분화 세포의 운명을 결정하기 위해 필요한 필수 메커니즘이다. 이 과정의 이상 ^조절이 암을 비롯한 다양한 질환을 일으키는 것으로 알려져있다.

이 프로세스는 주로 DNA ^(3)의 CpG 디 뉴클레오티드의 시토신 잔기에 메틸기의 첨가를 포함한다. 현재 많은 연구 ^2-8에서 설명한 바와 같이 각각 자신의 장점을 갖는 이러한 메카니즘을 조사하기 위해 사용되는 몇 가지 방법이있다. 여기에서 우리는 우리가 DNA의 메틸화 지역을 식별하는 친 화성 농축 기술을 사용 (MBDCap-SEQ) 메틸 바인딩 DNA 캡처 순서라는 이러한 기술 중 하나를 설명합니다. 이 기술은 메틸화 된 CpG 부위를 함유하는 게놈 DNA 단편에 대한 농축하는 MBD2 단백질 메틸 결합능에 만든다. 우리는 상업 메틸화 된 DNA 농축 키트를 활용이러한 메틸화 영역의 분리를위한. 우리의 실험은이 기술을 사용하여 환자 샘플 수백 스크리닝하고 여기 큰 환자 집단을 조사하는데 사용될 수있는 최적화 된 광범위한 프로토콜을 제공한다.

모든 차세대 시퀀싱 기술 명백한 바와 같이, MBDCap-SEQ 또한 정확하게 샘플 통해 메틸화의 수준을 정량화하기 위해 특정 바이오 인포 매틱스 방법을 필요로한다. 시퀀스 데이터 ^{(9), (10)의} 정규화 및 분석 프로세스를 최적화하기 위해 많은 최근의 연구가 있었다. LONUT - - 환자 샘플의 다수에 걸쳐 편향 비교를 가능하게하기 위해, 각 샘플의 선형 정규화 뒤에이 프로토콜에서는 고유 판독 복구 방식을 구현하는 방법 중 하나를 보여준다.

프로토콜

모든 조직은 임상 시험 심사위원회위원회의 승인을 다음과 얻어진 모든 참가자가 분자 분석과 후속 연구에 모두 동의 할 때. 프로토콜은 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 인간 연구위원회에 의해 승인됩니다.

1. 메틸 결합 DNA 캡처 (MBDCap)

1. 샘플 수집 및 DNA 분리
   1. 환자 파라핀 조직 샘플에서 대량 종양 또는 정상 조직 샘플을 수집합니다.
   2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 파라핀 조직 샘플에서 게놈 DNA를 분리 상업 DNA 미니 키트를 사용합니다.
   3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 여기에 설명 된 절차에 메틸화 DNA 농축 키트를 사용합니다.
2. 초기 비드 세척
   참고 : 구슬은 게놈에 DNA 메틸화를 검출 MBD - 비오틴 단백질과 커플하는 데 사용됩니다. 구슬은 일반적으로 일시 중단주식 솔루션입니다. 이 액체를 씻어하려면 다음 단계를 사용합니다.
   1. 균일 한 현탁액을 얻기 위해 아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 스트렙 타비 딘 비즈 (재료 표 참조)의 주식을 재현 탁합니다. 텍싱하여 구슬을 혼합하지 마십시오.
   2. 입력 DNA 중 하나 μg의 경우, 1 배 바인딩 / 워시 버퍼의 90 μL와 튜브 구슬의 add10 μL. 1 분 동안 회전합니다. 텍싱하여 혼합하지 마십시오.
   3. 1 분 동안 자기 랙에 튜브 (들)을 놓습니다.
   4. 피펫으로 액체를 제거하고 액체를 폐기합니다.
   5. 구슬에 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 250 μL를 추가하고 1 분 동안 회전합니다.
   6. 두 번 1.2.5 - 반복 1.2.3 단계를 반복합니다.
3. 비드에 MBD-비오틴 단백질 커플 링
   1. 입력 DNA의 1.2 μg의, 각 튜브에 MBD - 비오틴 단백질의 7 μL (3.5 μg의)를 추가합니다.
   2. 100 μL의 최종 볼륨을 만들기 위해 단백질 1 배 바인딩 / 워시 버퍼의 93 μL를 추가합니다.
   3. 구슬 단백질을 혼합실온에서 1 시간 동안 회전 혼합기에서 혼합.
4. 단편화 된 DNA (입력)
   1. TE 버퍼 96 μL, 24 μL 5 배의 귀속 / 세척 버퍼에 전체 게놈 DNA의 1.2 μg의를 추가하여 초음파 처리 DNA 120 μL 솔루션을 확인합니다. 25 시간 - 30의 전원 ON 및 초음파 동안 30의 전원 OFF, 20을 사용합니다.
   2. 제조사의 프로토콜에 따라 혈압 (350) - (150)의 범위로 단편의 크기를 확인하는 상업용 고감도 DNA 키트와 bioanalyzer 시스템을 이용하여 초음파 DNA 용액 1 μL를 실행.
5. MBD-구슬을 씻으십시오
   1. 1 분 동안 자기 선반에 MBD-구슬이 들어있는 튜브를 놓습니다.
   2. 제거하고 구슬을 건드리지 않고 피펫으로 액체를 폐기합니다.
   3. 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 250 μL와 비드를 재현 탁.
   4. 5 분 동안 실온에서 회전 믹서 비드 섞는다.
   5. 두 번 1.5.4 - 반복 1.5.1 단계를 반복합니다.
6. 단편화 된 DNA 캡처 반응 (1 μg의 입력 DNA)
   1. MBD 비드를 함유하는 튜브에 DNA / 완충액 혼합물을 전송.
   2. RT에서 1 시간 동안 회전 혼합기에서 DNA와 MBD 비드 섞는다. 또한, 4 ^오 ℃에서 O / N을 혼합
7. 구슬에서 비 캡처 DNA 분리
   1. 1 분은 상기 튜브의 내벽에 비드 모두 집중하기 위해 DNA와 MBD 비드를 혼합 한 후, 자기 선반에 튜브를 놓는다.
   2. 피펫으로 상층 액을 제거하고 DNA nonmethylated 같은 깨끗한 DNase의 프리 microcentrifuge 관에 저장한다. 얼음이 샘플을 저장합니다.
   3. 구슬을 씻어 구슬에 1 배 바인딩 / 워시 버퍼 200 μL를 추가합니다.
   4. 3 분 동안 회전 믹서 비드 섞는다.
   5. 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.
   6. 피펫으로 액체를 제거하고 microcentrifuge 관에 저장합니다.
   7. 캡총이 더 세척 분획을 위해 1.7.6 - 입력 DNA의 ≤1 μg의의 반응을 진짜야, 반복 1.7.3 단계를 반복합니다.
8. 단일 분수 용출
   1. 높은 소금 버퍼 저염 버퍼 믹스 (1 : 1) 용출 버퍼 (1,000 밀리미터의 NaCl)을 얻을 수 있습니다.
   2. 용출 버퍼 (1000 mM의 염화나트륨)의 200 μL의 비드를 재현 탁.
   3. 3 분 동안 회전 믹서에 구슬을 품어.
   4. 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.
   5. 자기 선반에 장소에 튜브, 피펫 팁으로 구슬을 건드리지 않고 피펫으로 액체를 제거하고 깨끗한 DNase의 프리 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 저장합니다. 얼음이 샘플을 저장합니다.
   6. 반복 1.8.1 단계 - 같은 튜브의 두 번째 샘플을 수집 한 번 1.8.4을 (총 부피는 400 μL 될 것입니다). 얼음에 풀링 된 샘플을 저장합니다.
9. 에탄올 침전 (DNA 정리)
   1. 각 noncaptured, 세척 및 용출 분수 FR에이전 단계 OM 1 μL의 글리코겐을 추가 (20 μg의 / 키트에 포함 μL), 3M 아세트산 나트륨 1/10 샘플 볼륨의 pH 5.2 (예를 들어, 400, 40 μL 샘플 μL) 및 100 %의 2 샘플 볼륨 에탄올 (예, 400 당 800 μL 샘플 μL). 총 부피는 1241 μL이다.
   2. 잘 믹스 적어도 2 시간 동안 C ^O를 -80에서 품어.
   3. 4 ^오 ℃에서 11,363 XG에 15 분 동안 튜브를 원심 분리기
   4. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다.
   5. 차가운 70 % 에탄올 500 μL를 추가합니다.
   6. 4 ^오 ℃에서 11,363 XG에서 5 분 튜브를 원심 분리기
   7. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다.
   8. 1.9.7 한 번 남아있는 잔류 뜨는을 제거 - 반복 1.9.6 단계를 반복합니다.
   9. ~ 5 분 펠렛을 공기 - 건조. 완전히 펠렛을 건조하지 마십시오.
   10. DNase의없는 물 또는 기타 37.5 μL의 DNA 펠렛을 재현 탁버퍼의 적절한 볼륨.
   11. 얼음의 DNA를 배치 또는 -20 ^℃로 또는 아래에서 더 사용할 때까지 DNA를 저장합니다.
   12. DNA의 총량이 20 ng의 위에 있는지 확인합니다 (예, 형광 정량 시스템을 사용, 재료 표 참조).

2. 시퀀싱

1. 시퀀싱 MBDCap 절차에서 회수 된 DNA 조각을 사용합니다. 각 샘플 시퀀싱하기 위해서는 (20)의 총량 - 40 ng의 DNA를 라이브러리 제조를 위해 요구된다.
2. DNA-SEQ 라이브러리 준비는 완전 자동화 된 라이브러리 구축 시스템을 사용하십시오 (재료 표 참조) 및 제조 업체에서 제공하는 표준 프로토콜을 따르십시오. 라이브러리 준비를위한 400 bp의 - 크기 (200)의 선택 DNA 조각. 자동화 라이브러리 제조 시스템은 라이브러리 제조 과정을 표준화 의한 수동 제제에 샘플에 걸쳐 변화를 최소화 허용한다.
3. 사용 어댑터 프라임RS 및 100 배 농도로 희석. 이 중, 각 샘플 10 μL를 사용합니다.
4. 단계 2.2에 따라, 반응을 수행하고, 형광 정량 시스템 (재료 표 참조)를 사용하여 DNA-SEQ 라이브러리를 정량화.
   1. PCR 증폭 과정을 설정합니다. PCR 마스터 믹스의 선택은 게놈의 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키는 것이다. PCR의 관에서 15 μL DNA-서열 라이브러리를 추가, 25 μL PCR 마스터 믹스 (재료 표 참조) 2 μL PCR 프라이머 믹스 (재료 표 참조), 8 μL H ₂ O
5. 출발 물질을 다른위한 순환 시간과 온도 변화의 PCR 마스터 믹스의 제조 업체에서 PCR 권고를 따라 98 ^O C 45 초 동안, 15 초 98 ^O를 C, 30 초 65 ^O를 C, 30, 72 ^O를 C의 X 사이클 의, 1 분 후 72 ^O를 C. 4 ^오 ℃에서 잡아
   1. 반환 한(- 10 회 8) 라이브러리 DNA의 10 nm의 - 2로 끝날 정도로 사이클을 ORM.
6. 1 PCR 반응 정리 : 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정화 구슬의 1 비율 (재료 표 참조).
7. 30 μL 용출 완충액 - 20 용리.
8. 흐름 셀의 한 차선으로 4 샘플 함께 각각의 샘플과 풀을 바코드. 시퀀싱에 대한 표준 50 bp의 단일 읽기 프로토콜 (재료 표 참조)를 사용합니다.

3. 생물 정보학 분석

주의 : 서열로부터 수득 또한 프로세스 원료 fastq 파일은 품질 제어를 수행하며 게놈 짧은 DNA 서열 (판독) 매핑.

1. 사용 나비 넥타이 짧은 판독 노광 각 샘플 fastq 파일의 게놈 맵핑 도구가 기준 게놈 판독 매핑한다. 다수의 판독 매핑 툴이 단계를 수행 할 수있는 개인 선호도에 따라 사용될 수있다.
   1. 도 ë 2 불일치까지 허용참조 게놈에 매핑하는 동안 전자는 읽습니다. 각 읽기 (20) 최고의 정렬까지보고합니다. 예를 들어, 나비 넥타이 -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 를 사용합니다.
2. 다중 매핑이 농후 영역의 검출을 개선하기 위해 판독 복구 LONUT ^9를 사용한다. 각각의 판독의 경우, 최대 하나의 배향으로는 상기 호출 피크 중 충분히 근접 할 때 복원 될 것이다. 예를 들어, 사용 : 펄 lonut.pl -g hg19 -w (250) -p (99) . LONUT 다음 단계를 수행합니다.
   1. 로 분할 정렬 고유 읽고 매핑과 다중 읽기 매핑. 유일하게 매핑에 전화 피크는 피크 발신자 벨트 ^(11)를 사용하여 읽습니다. 예제 명령 (250) 및 -p 99 -w 옵션은 BELT위한 것입니다.
   2. 고유 매핑 수확기는 LONUT에서 얻은 읽기 회복과 함께 읽고, 결합은 침대 형식으로 추가 분석에 사용됩니다 읽습니다. COMBIN 수를 계산에드는 미래의 정상화를 위해 읽습니다.
3. 빈 읽습니다. 추출 펄 스크립트를 사용하여 관심의 영역에서 읽 펄 methyPipeline.pl - 최대 <상류 연장 길이> -dn <하류 연장 길이>. sampleInfoFile에 나열된 각 침대 파일의 경우, 펄 스크립트는 아래의 작업을 수행합니다.
   참고 : 펄 스크립트 추가 코딩 파일을 참조하십시오.
   1. 빈 24 염색체를 들어, 고정 빈 크기로 예를 들어, 100 bp의를 읽습니다.
   2. refGeneFile에 지정된 각 유전자의 경우, 옵션 - 최대 및 -dn에 의해 지정된 연장 길이까지 전사 시작 사이트 주위의 빈 (TSS)을 추출한다. 예를 들어, 최대 및 다운 스트림 TSS 4 KB입니다 지역에서 데이터를 추출합니다. 빈 크기는 100 염기쌍, 이것은 데이터가 81 빈들을 추출하고, 상기 중앙의 빈 TSS에 대응한다.
   3. 왼쪽에서 오른쪽으로 상류 쓰레기통은 항상 있도록 안티센스 가닥의 유전자를 들어, 괞 찮아 추출 된 영역을 반전상기 펄 스크립트 왼쪽에 세드릭.
   4. 2킬로바이트을 상류 왼쪽, 상류 4킬로바이트; 또한 세 개의 하위 영역으로 TSS ± ​​4킬로바이트 영역을 분할 중동 최대 및 다운 스트림 2킬로바이트; 오른쪽, 4킬로바이트에 2킬로바이트 하류.
   5. 3.3.3 계산 판독 매핑를 합한 총 횟수로 각 빈 판독의 각 샘플에 대해, 상기 카운트를 나눈다. 샘플 특정 제거됩니다 정규화는 차이를 읽고 다른 샘플에서 읽고 비교할 수 있습니다.
4. 왼쪽 영역으로부터 얻어진 판독 정규화에서 통계 테스트를 수행 (스크립트 파일에 나타낸 바와 같이) 측면 영역으로 기술 영역에서 정상적인 경우 그룹간에 차이 메틸화를 검출하는 상기 배시 스크립트를 실행.
   주 : bash는 스크립트의 추가 코딩 파일을 참조하십시오. 차별적 메틸화 된 지역을 기반으로, 일곱 조합이있다 :
   지역 전체 다음 TSS ± ​​4킬로바이트 영역에 걸쳐 차동 메틸화
   MiddleLeft : 모두 중앙과 왼쪽 지역에서 차동 메틸화
   MiddleRight : 모두 중간과 오른쪽 지역에서 차동 메틸화
   측면 : 왼쪽과 오른쪽 지역에서 차동 메틸화
   왼쪽 : 왼쪽 지역에서 차동 메틸화 만
   오른쪽 : 오른쪽 지역에서 차동 메틸화 만
   중간 : 중간 영역에 차등 메틸화 만
5. 토네이도 플롯에서 차동 메틸화를 시각화하기 위해 동일한 bash는 스크립트를 사용합니다. 별도의 패널에 하이퍼 및 하이포 메틸화 유전자를 플롯 각각 3.4에 설명 된 영역의 조합의 순서로 정렬.

결과

우리는 그 중에서도 유방 ^{12, 13,} 자궁 내막, 전립선 ^(14), 및 간암 등 다양한 종류의 암 환자에서 다수의 DNA 메틸화 변화를 연구 MBDCap - 배열을 사용했다. 여기에서 우리는 최근에 ¹² 게시 된 유방암 연구에서 몇 가지 정보를 보여줍니다. 이 예에서, 우리는 다른 차등 게놈 영역에 걸쳐 정상에 대해 종양 메틸화 된 CpG 섬을 식별 총 유전체 방식을 사용 하였다. 조사는 개 가운데 유전자 프로모터 (N = 13,081)에 위치 된 CpG 섬을 조사 19.5 %가 정상에 비해 종양에서 차동 메틸화를 보였다 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 6959 유전자 내의 CpG 섬에서, 55.2 %는 차동 메틸화를 보였다. 유전자 간 발기인 4847의와의 CpG 섬이없는 유전자 프로모터에 대해 28.1 %를 보여, 5454 조사 지역의 1.8 % 차동 DNA 메틸화 (그림 1A)을 보여 주었다. 시각적 표현(그림 1B)는

토론

MBDCap-SEQ 기술은 환자 ^(15)의 다수 집단을 조사 할 때 비용 효율적인 대안으로 고려 친 화성 농축 방법 ^(3)이다. 여기에 제시된 파이프 라인은 데이터 분석 및 해석에 샘플 조달에서 포괄적 인 접근 방식을 설명합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 DNA 메틸화가 발생하는 곳이므로 게놈에서 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키기 위해 PCR 증폭 과정을 설정한다. 또한, 시퀀싱 후, 각각의 샘플이 유일하게 매핑 적어도 20 개 이상의 백만 게놈을 읽고 있는지 확인하는 것이 필수적이다. 이 범위는 전체 게놈 ^(12)을 매핑하는 데 충분한 깊이 농축 또는 시퀀스를 제공 할 것으로 예상된다. 이 범위가 부분에서 그 샘플에 대한 특정 샘플에 대한 염기 서열의 첫 라운드 더 많은 DNA 동안 충족되지 않으면 하나를 사용할 수, 두 번째 부분에서 시퀀싱의 또 다른 라운드를 실행할 수 있습니다. 결과는 연구와 병합 할 수 있습니다 읽기첫 라운드에서 EADS는 커버리지를 달성했다. 전체 실험은 복사 번호 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메틸 마이너 DNA 농축 키트	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus 초음파 처리 장치	diagenode	B01020001
3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	완전 자동화된 라이브러리 건설 시스템
어댑터 프라이머	Bioo Scientific	514104	PCR 프라이머 믹스
Qubit	Invitrogen	Q32854	형광 정량 분석 시스템
PCR 마스터 믹스	KAPA Scientific	KK2621	PCR 마스터 믹스
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR 정제 비드
EB 버퍼	Qiagen	19086
HiSeq 2000 염기서열분석 시스템	Illumina